制備純化的干細胞組分的高安全性方法
【專利摘要】在此描述了一種用來制備純化的源于脂質的干細胞組分的高安全性方法，在該方法中使用了特別設計的單一采集裝置，從而減少了含有干細胞的材料經過的通道和操作的數(shù)量，將污染、材料損失、以及樣品無意中互換的風險降到最低，并進一步簡化了采集原材料的人員與進行干細胞分離的專業(yè)人員之間的接口和協(xié)作。
【專利說明】制備純化的干細胞組分的高安全性方法
[0001]現(xiàn)有技術狀況
[0002]干細胞在美容和醫(yī)療的實踐中獲得了越來越多的關注，這與它們生成新生物組織的能力有關，由干細胞生成的新生物組織可以應用于由于各種原因失去了這些生物組織或其再生能力的病人。
[0003]特別地，成人干細胞，例如源于脂質或骨髓的干細胞，吸引了特別的關注，原因是它們具有更加可控的功效，而且可以不受適用于胚胎干細胞的道德限制的約束。
[0004]源于脂質的干細胞的一個典型應用領域是為了美容目的的組織填充:在此，需要接受美容療法的病人捐獻出其自身的一部分脂質組織(脂肪組織提取物(Iipoaspirate));通過以下方式加工處理該脂質組織:實驗室回收純化的細胞組分，后者被注射回病人的需要進行填充的身體區(qū)域。獲取到的細胞組分被稱為血管基質組分(SVF)，代表了從脂質組織中提取到的有核細胞的總數(shù)量。典型地，這些細胞中有10至20%是干細胞，也稱為間充質干細胞。它們具有多能性，能夠修復或再生多種類型的人體組織。使用自體同源的脂質組織避免了免疫反應和組織排斥的風險。此外，這些提取出來的細胞接下來可以被長時間冷凍儲存在液氮中，以供干細胞提供者支配，在后續(xù)治療時使用，包括在人體干細胞療法中使用干細胞。
[0005]制備純化的源于脂質組織的細胞組分的方法在現(xiàn)有技術中是已知的。 [0006]這些方法的步驟大體包括最初的脂質原材料的獲取、干細胞成分的選擇性提取、提取后的脂質基質的去除，以及最終的洗滌、純化、和制備具有方便應用的濃度和體積的干細胞組分。這些方法，由于包括含有干細胞的材料流過若干移液管、導管、貝克離心管(beckers)等等的步驟，涉及到相當大的細菌污染和/或材料損失的風險，因此這些方法需要非常嚴格的規(guī)程，涉及到環(huán)境和所用不同材料的無菌性、多次洗滌以回收可能粘附的材料，上述因素均增加了方法的總成本。多次的容器轉移還增加了源自不同病人的樣品被無意中互換的風險，從而使最終的干細胞接受者遭受到非自體同源的干細胞被植入的風險。
[0007]上述規(guī)程還要求采集脂質原材料的操作者與分離干細胞的實驗室之間嚴密合作和相互理解。有時原材料會裝在非最優(yōu)化的容器中被遞送(例如太大、封裝不適當、包裝錯誤、劑量非最優(yōu)化等等):在所有這些情況下，實驗室就會被迫以次最優(yōu)化的起始樣品進行操作，這可能會影響到最終產品的品質。
[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種改進的方法，用來制備源于脂質組織的干細胞組分，該方法對病人來說更安全，對操作者來說更迅捷。
[0009]本發(fā)明進一步的目的在于，簡化/標準化采集脂質原材料的操作者與負責干細胞分離的操作者之間的接口和協(xié)作。
[0010]本發(fā)明進一步的目的在于，減少生產純化的細胞組分過程中所包括的步驟和操作的數(shù)量。
[0011]本發(fā)明進一步的目的在于，使得那些與干細胞使用有關的醫(yī)療/美容方法更加迅速和有效。發(fā)明概要
[0012]本發(fā)明涉及一種獲取源于脂質的干細胞組分的方法，基本上基于以下步驟:
[0013](a)采集或接收含有干細胞的脂質組織樣品；
[0014](b)使用合適的水性緩沖液洗滌步驟(a)得到的樣品；
[0015](C)使用能夠從含有干細胞的脂質組織中提取干細胞的酶培養(yǎng)步驟(b)得到的樣品;
[0016](d)從步驟(C)得到的產品中回收水相；
[0017](e)對步驟(d)獲得的水相進行純化；
[0018](f)對步驟(e)獲得的水相進行滴定，并可選地對水相進行稀釋以獲取具有所需濃度和體積的干細胞組分最終產品。
[0019]本發(fā)明的一個必要特征在于，在貫穿至少上述步驟(a)、(b)、(C)的過程中，含有干細胞的材料在同一個采集裝置(在此稱為“單一采集裝置”或“S⑶”)內進行處理。單一采集裝置的使用避免了被處理的材料與外界環(huán)境相接觸，將與多次容器轉移相關的被污染的風險、活性材料的損失降到最低，并且簡化了獲取純化的干細胞組分所需的總體操作過程。
[0020]單一采集裝置是能夠吸取和排出液體的無菌容器；它以注射器為代表，但不限于注射器。單一采集裝置可以具有大的灌裝容量(例如20至IOOmL),以允許從相應的脂質材料中大規(guī)模采集干細胞。單一采集裝置優(yōu)選是透明或半透明的，具有一個用于指示最佳灌裝量的標記，和/或用于書寫或貼標簽的區(qū)域，以標示樣品來源。
[0021]將會從描述中明顯得出，根據(jù)所涉及的特定過程步驟，單一采集裝置完成了采集器(如同移液管)、相分離器、以及過程反應器的功能；因此，所有這些功能都被更加有利地執(zhí)行，而不需要將樣品從一個容器轉移到另一個容器，和/或使得樣品與外界環(huán)境相接觸。
[0022]單一采集裝置基本上被用在貫穿步驟(a)、(b)、(C)的過程中；然而，如果需要，單一采集裝置也可以繼續(xù)貫穿在步驟(d)、(e)、(f)中的一個或多個步驟中使用，具有與上面描述的相同的功能和優(yōu)點。
[0023]基于以上前提，本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0024](a)在單一采集裝置中，采集或接收含有干細胞的脂質組織樣品;
[0025](b)在所述單一采集裝置中，使用合適的水性緩沖液洗滌步驟(a)得到的樣品；
[0026](C)在所述單一采集裝置中，使用能夠消化脂質組織并從中提取干細胞的酶培養(yǎng)步驟(b)得到的樣品；
[0027](d)從步驟(C)得到的產品中回收水相；
[0028](e)對步驟(d)獲得的水相進行純化；
[0029](f)對步驟(e)獲得的水相進行滴定，必要時再對水相進行稀釋以獲取具有所需濃度和體積的干細胞組分最終產品。
[0030]發(fā)明詳細說明
[0031]步驟(a)
[0032]在本步驟中，含有干細胞的脂質組織樣品被從合適的來源吸取到單一采集裝置中。
[0033]脂肪組織提取物是典型的脂質組織樣品。所述樣品必須是液體或至少是流體，以實現(xiàn)本方法的目的；流動性不夠的材料可以通過進一步均化和/或加入液體介質，例如緩沖溶液，來進行補償。
[0034]在步驟(a)中，將單一采集裝置與脂質組織樣品相接觸，操作它以吸取合適體積的脂質組織；在完全填滿所述單一采集裝置的可用容量之前，中止吸入操作，從而為洗滌用緩沖液以及下文將描述的其他試劑留出進一步吸入的容量(典型地是單一采集裝置容量的
一半)。
[0035]步驟(a)中“采集或接收”的表述解釋了以下事實:該步驟可以由與執(zhí)行步驟(b)-(f)的機構/操作者相同或不同的機構/操作者來執(zhí)行:在第一種選擇中，步驟(a)中的操作者“采集”脂質樣品并直接依照步驟(b)-(f)對其進行加工處理；在第二種情況下，操作者“接收”由別人采集到的脂質樣品，然后依照步驟(b)-(f)對其進行加工處理；典型地，步驟(a)可以由醫(yī)院或美容中心執(zhí)行；步驟(b)-(f)由專業(yè)從事干細胞加工處理的實驗室執(zhí)行。
[0036]在上述的第二種選擇中，本方法尤其具有以下優(yōu)勢，它消除了現(xiàn)有技術的已知方法中發(fā)生污染的主要原因，在這些已知方法中，脂肪組織提取物被收集入第一個容器，被儲存、寄送至外部的實驗室、然后轉移至合適的反應器。所有這些轉移/操作都會涉及到樣品與外界環(huán)境的接觸，帶來與之相關聯(lián)的污染的風險，并伴隨有不可避免的部分產品損失。這些缺點和風險現(xiàn)在可以通過本方法被最小化。
[0037]使用單一采集裝置的進一步的優(yōu)勢在于，為最初的操作者即采集脂質樣品的操作者，提供了標準化容器，該標準化容器在灌裝容量、空隙容量、氣密性、包裝材料等等各個方面均適當調整，使其適合于進一步的加工處理。
[0038]以下步驟可以緊接著步驟(a)被執(zhí)行；或者，部分充滿的單一采集裝置在可以保持干細胞活性的條件下被儲存一段時間，直至依照步驟(b)-(f)對其進行進一步加工處理的時候。
[0039]步驟(b)
[0040]在本步驟中，在步驟(a)中所吸取的脂質樣品在所述單一采集裝置內部被使用水性緩沖液進行洗滌。
[0041]為了做到這點，從步驟(a)中得到的部分充滿的單一采集裝置被操作以吸取一定體積的緩沖溶液，該緩沖溶液與所述單一采集裝置內存在的脂質組織樣品混合；例如可以通過對單一采集裝置施加振動/搖動來促進兩相之間的均質混合。所用的緩沖溶液是與干細胞具有相容性的溶液，典型地是補充有用作酶營養(yǎng)素的鈣鹽和/或鎂鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS);緩沖溶液和脂質組織的體積比是例如從大約0.5:1.5至大約1.5:0.5，優(yōu)選為大約1:1。
[0042]在上述混合/均質化之后，所述單一采集裝置被靜置，直至兩相(脂質相與水相)分離。然后所述單一采集裝置被操作以排出水相，同時保留脂質相；特別地，當所述單一采集裝置為注射器時，這可以通過將其朝下放置(針頭向下)來達成:這將導致脂質相移動至注射器的上半部分，在針頭遠端，同時水相聚集到相反的部分，靠近針頭:在這種狀態(tài)下，施加在注射器柱塞上的壓力將使水相從針頭排出；適當?shù)乇３謮毫Γ敝了?脂質相界面到達針頭處:此時水相(將被棄置)基本上已被排出，注射器里僅含有脂質相，接下來的步驟將基于該脂質相來執(zhí)行。
[0043]上面描述的洗滌步驟可以被重復更多次，例如一或兩次，直至達到脂質相所需的洗滌程度。
[0044]步驟(c)
[0045]在本步驟中，從步驟(b)中得到的洗滌后的脂質相在所述單一采集裝置內部，用能夠從含有干細胞的脂質材料中提取干細胞的酶進行培養(yǎng)。
[0046]為了執(zhí)行這一步驟，所述單一采集裝置被操作以進一步吸取含有所述酶的液體介質的一個等分試樣。該酶典型地是釋放酶，該液體介質典型地是緩沖液，優(yōu)選為經過酶活性優(yōu)化的磷酸鹽緩沖液(PBS)，特別是補充有鈣鹽和/或鎂鹽；所述液體介質具有已知的酶滴定值，以允許操作者吸入所需的可重復的酶量。
[0047]這樣得到的被充滿的單一采集裝置，可選地被插入到密封的封袋里，隨后被放入培養(yǎng)器中，典型地是具有振蕩托盤的溫度可控的烘箱中。在培養(yǎng)之前，所述單一采集裝置優(yōu)選地被攪動以使內含物質被均化；然后繼續(xù)在培養(yǎng)器內通過托盤的振蕩運動進行混合。
[0048]所述培養(yǎng)器可以在如下條件下進行操作，但不限于如下條件:培養(yǎng)時間為20-80分鐘，優(yōu)選為30-60分鐘，最優(yōu)選為45分鐘；溫度為30-45°C，優(yōu)選為37°C ;攪動:l_5rpm(轉每分鐘)，優(yōu)選為2或3rpm。
[0049]步驟(d)
[0050]在本步驟中，酶反應被阻止，脂質相被去除，水相(含有被酶解離出來的干細胞)被回收用于進一步依照步驟(e)-(f)處理。
[0051 ] 為了執(zhí)行這一 步驟，所述單一采集裝置被從所述培養(yǎng)器中移出，從封袋(可選地使用)中取出；培養(yǎng)懸浮液被與酶鈍化液的一個等分試樣相混合，例如，所述酶鈍化液可以是合適濃度的緩沖白蛋白溶液，例如重量分數(shù)可以是1%。
[0052]兩種液體混合的合適模式在于，將鈍化液吸入所述單一采集裝置內，搖動單一采集裝置以獲得完全均化，將所述單一采集裝置靜置，直至脂質相與水相分離，然后回收水相。
[0053]水相的回收可以通過將其從所述單一采集裝置中射出(噴射模式)來實現(xiàn)，或者，作為另一種選擇，將其保留在所述單一采集裝置內(保留模式)來實現(xiàn)。
[0054]“噴射模式”可以通過將注射器朝下放置(針頭向下)來實施:這將導致脂質相移動至注射器的上半部分，遠離針頭，同時水相聚集到相反的部分，靠近針頭:在這種狀態(tài)下，施加在注射器柱塞上的壓力將使水相從針頭射出；適當?shù)乇３謮毫?，直至水?脂質相界面到達針頭處:此時水相(將被收集用于進一步依照步驟(e)-(f)處理)基本上已從注射器中排出；注射器里含有干細胞已被提取出的脂質相，所述脂質相現(xiàn)在可以被另行射出而排出。
[0055]作為所述噴射模式的替代性選擇，“保留模式”可以通過將注射器朝上放置(針頭向上)來實施:這將使脂質相移動至注射器的靠近針頭的部分，同時水相聚集到相反的部分，遠離針頭:在這種狀態(tài)下，施加在注射器活塞上的壓力將使脂質相從針頭射出；可以采取適當措施來避免從朝上的注射器中射出的液體發(fā)生飛散:例如，在噴射前，針頭可以穿過燒瓶的橡皮塞，然后射出的液體可以被收集到所述燒瓶中。適當?shù)乇３謮毫?，直至水?脂質相界面到達針頭處:此時脂質相(將被棄置)基本上已被從注射器中排出，注射器里含有水相，該水相將被用于進一步依照步驟(e)-(f)處理。
[0056]在步驟(d)結束時，從所述單一采集裝置中回收水相并另行對其進行處理，除非，所述單一采集裝置具備允許對其進行離心分離的形狀和堅固度:在這種情況下，隨后的過程步驟也可以在單一采集裝置內執(zhí)行，從而為整個方法過程帶來進一步的保護/簡化。
[0057]如果不適用于離心分離，被倒空的單一采集裝置優(yōu)選地使用合適的溶液(優(yōu)選使用上面描述的鈍化液)洗滌一次或多次，以回收可能粘附在其表面上的干細胞，所有得到的水相被合并，用于進一步依照步驟(e)-(f)處理。
[0058]步驟(e)
[0059]在本步驟中，由步驟(d)得到的(合并的)水相被純化，以除去來源于原始脂質樣品的可能存在的可溶性/不可溶性雜質。一般通過離心分離、去除上清液、沉淀物再懸浮、過濾來實現(xiàn)樣品的純化。離心分離一般可以在如下條件下被執(zhí)行:離心速度為300-500G，優(yōu)選為350-450G，更優(yōu)選為400G ;離心時間為1_10分鐘，優(yōu)選為3_7分鐘，更優(yōu)選為5分鐘。
[0060]在去除上清液之后，沉淀物再懸浮可以通過使用合適的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液PBS)或上面描述的鈍化液來實現(xiàn)。
[0061]上述的離心分離和再懸浮可以被重復一次或多次，以增加微粒(干細胞)組分與水溶性雜質的分離純化度。
[0062]經過(最終的)再懸浮的沉淀物隨后被過濾一次或多次，以去除相對于干細胞組分來說粒度過大的微粒雜質。為了做到這點，懸浮的沉淀物通過具有合適孔徑的薄膜被過濾，該薄膜的孔徑例如是80-120 μ m,優(yōu)選為大約100 μ m,將粒度過大的微粒材料保留下來，而讓(較小粒度的)干細胞在過濾過程中通過濾膜進入濾液。所得到的液體可以使用更細的過濾器被再次過濾，該更細的過濾器的孔徑可以是60-80 μ m,優(yōu)選為大約40 μ m,以達成更精細地去除過大微粒的目的 。最后得到的包含純化的干細胞的濾液用于進一步依照步驟(f)處理。
[0063]步驟(f)
[0064]在本步驟中，從步驟(e)中得到的純化液體被滴定，然后被稀釋以獲得具有所需濃度和體積的干細胞組分最終產品。
[0065]滴定可以通過以下步驟進行，通過量取精確體積(例如50μ L)的步驟(e)得到的液體，并通過合適的計數(shù)儀器得出其干細胞計數(shù)值，該計數(shù)儀器典型地是熒光激活細胞分類儀(FACS)，具備得出源于脂肪的間充質干細胞數(shù)量的優(yōu)化的計數(shù)途徑；或者，也可以通過其他儀器，例如血球計數(shù)器，來間接地對干細胞含量進行估值:該血球計數(shù)器計數(shù)得出有核細胞的總數(shù)量，而在本方法的這個階段，有核細胞的總數(shù)中有10-20%被發(fā)現(xiàn)是干細胞。優(yōu)選地，兩次或多次讀數(shù)并計算其平均值，以獲得更高的精度。
[0066]根據(jù)已知的滴定值，在必要時，從步驟(e)得到的液體可以被稀釋至一個合適的濃度?？梢酝ㄟ^使用合適的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液PBS)或上面描述的鈍化液來實現(xiàn)液體的稀釋。最終濃度值根據(jù)干細胞組分最終產品所需的功效水平來進行選擇；有用的、非限制性的干細胞濃度值可以為(以有核細胞總數(shù)來表示)IO8至IO4細胞數(shù)/mL，優(yōu)選為IO7至IO5細胞數(shù)/mL，更優(yōu)選為IO6細胞數(shù)/mL。
[0067]干細胞組分最終產品隨后可以被包裝在合適的容器(例如微型注射器)中，作為具有合適體積的單元，例如ImL的單元；選擇最終體積，使其與干細胞組分最終產品的施用場合(例如皺紋填充、組織再生等等)相兼容并操作便利。
[0068]干細胞組分最終產品優(yōu)選盡快使用，或者，作為另一種選擇，它在合適的無菌和溫度條件下被儲存，直至被使用。[0069]在任何源于脂質的干細胞有作用的應用中均可以使用它。非限制性的例子是在美容或再生治療的領域中應用，特別是組織填充、創(chuàng)傷修復、組織或器官再生。這樣獲得的干細胞組分及其醫(yī)療用途構成本發(fā)明的一部分。
[0070]下面對依照本發(fā)明的合適的、非窮舉的方法過程進行了描述。
[0071]實施例1
[0072]1.1使用鈣/鎂磷酸鹽緩沖液洗滌
[0073]—個IOOmL的注射器(單一采集裝置)，含有50mL脂肪組織提取物原材料，被加入50mL含有鈣鹽和鎂鹽的標準杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’ s PBS buffer)。所述注射器(單一采集裝置)被翻轉顛倒10次以使內含物質均化，然后以豎直姿態(tài)(針頭向下)靜置約5分鐘，以使得水相和脂質相分離。擠壓注射器柱塞，以射出整個下層相(水相)，將脂質相保留在注射器中。該洗滌過程被重復多次，所述射出的水相被棄置。
[0074]1.2使用釋放酶培養(yǎng)
[0075]步驟1.1所得到的注射器(單一采集裝置)中含有經過洗滌的脂質相，其被操作以吸取酶試劑，并使酶試劑的濃度達到0.28活力單位/mL (ffunsch Units/ml)。所述酶試劑預先按照以下方法制備，將0.028活力單位/μ L (ffunsch Units/μ L)的釋放酶(采用含有鈣鹽和鎂鹽的杜氏磷酸鹽緩沖液稀釋的MNP-S酶)母液用上面描述的鈣/鎂磷酸鹽緩沖液以1:500的體積比進行稀釋。
[0076]按此灌裝的注射器(單一采集裝置)被進一步操作以吸入20mL無菌空氣，翻轉顛倒10次以使內含物質均化，封裝在封袋中并放置于具有振蕩托盤的培養(yǎng)器內，預加熱至37 0C。培養(yǎng)過程在37°C下進行45分鐘，并伴隨3rpm的振蕩。
[0077]1.3釋放酶的鈍化失活
[0078]在培養(yǎng)時間期滿之后，振蕩被中斷，所述注射器(單一采集裝置)被從培養(yǎng)器中移出，被從封袋中取出，并被加入等體積的白蛋白溶于杜氏磷酸鹽緩沖液形成的質量分數(shù)為1%的溶液。按此灌裝的注射器(單一采集裝置)被進一步操作以吸入5mL無菌空氣，翻轉顛倒10次以使內含物質均化；然后注射器(單一采集裝置)被以豎直姿態(tài)(針頭向下)靜置5分鐘，以使得水相和脂質相分離。
[0079]1.4水相的回收
[0080]擠壓所述注射器(單一采集裝置)的柱塞，以射出整個下層相(水相):含有干細胞的水相被回收入離心分離試管(標記為“第一回收物”)。遺留在所述注射器(單一采集裝置)中的脂質相被另行射出并棄置；然后依照步驟1.3中所描述的過程，使用1%的白蛋白溶液洗滌空的注射器(單一采集裝置)，洗滌液被收集入另一個離心分離試管(標記為“第二回收物，，)。
[0081]1.5第一次離心分離以及沉淀物再懸浮
[0082]步驟1.4所得到的兩試管(第一及第二回收物)在20°C下以400G的離心速度被離心分離5分鐘。所有上清液被移除；使用20mL的白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液形成的質量分數(shù)為1%的溶液，手動地使第二回收物試管中的沉淀物再懸??；所得的懸浮液被加入到第一回收物試管中，用于對其中存在的沉淀物進行再懸浮。
[0083]1.6過濾，第二次離心分離以及沉淀物再懸浮
[0084]步驟1.5結束時所得到的懸浮液通過兩個隨后的步驟被過濾，使用的是孔徑分別為100和40 μ m的過濾器。濾渣被棄置。最后得到的含有干細胞的液體在20°C下以400G的離心速度被離心分離5分鐘。上清液被去除，使用5mL的白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液形成的質量分數(shù)為1%的溶液對沉淀物進行再懸浮。
[0085]1.7 滴定
[0086]使用ImL的移液管，從步驟1.6所得到的過濾后的懸浮液中采集兩份50 μ L的樣品(血管基質組分，SVF),并將其嵌入血球計數(shù)器以供讀數(shù)。計算兩次讀數(shù)(表示為總的有核細胞數(shù)量，即白細胞計數(shù)/mL，WBC/ml)的平均值，以獲得溶液的精確滴定值。
[0087]也可以對ImL步驟1.6所得到的溶液的樣品進行干細胞的直接計數(shù):樣品以1300G的離心速度被離心分離5分鐘；去除上清液，使用0.440 μ L的熒光激活細胞分類(FACS)緩沖液(磷酸鹽緩沖液+1%的人血清)對沉淀物進行再懸?。粚⑺萌芤菏褂煤线m的抗體培養(yǎng)20分鐘，加入Versalyse溶血劑和干細胞計數(shù)溶液，然后在Navios細胞熒光儀(sytofluorimeter)上進行讀數(shù),估算樣品中存在的干細胞的數(shù)量,并據(jù)此得出相應的干細胞濃度。
[0088]1.8稀釋至標準濃度以及包裝
[0089]基于步驟1.7測量得到的滴定值，使用白蛋白溶于磷酸鹽緩沖液形成的質量分數(shù)為5%的溶液對步驟1.6所得到的溶液的剩余部分進行稀釋，至其濃度和體積達到便于干細胞療法實際操作的水平。濃度的有用范圍是0.5至3X IO6白細胞計數(shù)/mL(WBC/ml)。所得到的溶液被最后分裝 到ImL的無菌注射器中，然后被包裝并密封，以供遠程運輸并遞送至最終使用者。
【權利要求】
1.一種制備源于脂質組織的干細胞組分的方法，包括以下步驟: (a)采集或接收含有干細胞的脂質組織樣品； (b)使用合適的水性緩沖液洗滌步驟(a)得到的樣品； (C)使用能夠消化脂質組織并從中提取干細胞的酶培養(yǎng)步驟(b)得到的樣品； (d)從步驟(C)得到的產品中回收水相； (e)對步驟(d)獲得的水相進行純化； (f)對步驟(e)獲得的水相進行滴定，必要時對所述水相進行稀釋以獲得具有所需濃度和體積的干細胞組分最終產品， 其中，在貫穿至少所述步驟(a)、(b)、(c)的過程中，含有干細胞的材料在單一采集裝置(SCD)內進行處理，所述單一采集裝置執(zhí)行采集器、相分離器以及過程反應器的功能。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述單一采集裝置具有20ml至IOOmL的灌裝容量。
3.根據(jù)權利要求1-2所述的方法，其中，所述單一采集裝置是注射器，所述注射器上可選地設有一個或多個用于指示最佳灌裝體積的標記，和/或設有用于書寫或貼標簽的區(qū)域。
4.根據(jù)權利要求1-3所述的方法，其中，所述脂質材料是脂肪組織提取物(IipoaspirateX
5.根據(jù)權利要求1-4所述的方法，其中，所述步驟(a)與所述步驟(b-d)由兩個不同的操作者分別來執(zhí)行，所述兩個不同操作者處于彼此遠離的位置。
6.根據(jù)權利要求1-5所述的方法，其中，在所述步驟(b)中，所述緩沖液是補充有酶的營養(yǎng)鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS)。
7.根據(jù)權利要求1-6所述的方法，使用注射器作為單一采集裝置，其中的步驟(b)和/或(C)包括將所述注射器朝下放置(針頭向下)或朝上放置(針頭向上)，隨后將靠近針頭的物相注射出去。
8.根據(jù)權利要求1-7所述的方法，其中，在所述步驟(c)中，所述酶是釋放酶，所述培養(yǎng)在30°C~45°C的溫度下進行20分鐘~80分鐘。
9.根據(jù)權利要求1-8所述的方法，其中，在所述步驟(d)中，將培養(yǎng)后的混合物與含有白蛋白的溶液混合，然后棄置脂質相，并回收水相以供后續(xù)的方法步驟使用。
10.根據(jù)權利要求1-9所述的方法，其中，在所述步驟(d)~(e)中的一個或多個步驟中，所述含有干細胞的材料存在于所述單一采集裝置內。
11.根據(jù)權利要求1-10所述的方法，其中，所述步驟(e)中的所述純化通過離心分離和/或過濾來執(zhí)行。
12.根據(jù)權利要求1-11所述的方法，其中，所述干細胞組分最終產品被制成一個或多個l-5mL的單元，所述單元包含的總的有核細胞濃度為IO8至104。
13.由權利要求1-12所述的方法獲得的干細胞組分。
14.根據(jù)權利要求13所述的干細胞組分，作為一種原料，用于組織填充、創(chuàng)傷修復、組織或器官再生。
【文檔編號】C12N5/071GK103842496SQ201280021056
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權日:2012年9月28日
【發(fā)明者】詹尼·蘇塔迪, 緹綺婭諾·泰隆 申請人:瑞士干細胞基金會