用于識別腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記、方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本公開涉及用于識別癌癥的預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記(包括CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox-2、APC、β-連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白)的組合。本公開還涉及識別所述標(biāo)記的方法、預(yù)測預(yù)后的方法和對于癌癥的計劃的個性化治療的方法。本公開還涉及包含針對所述預(yù)測的所述標(biāo)記的抗體的試劑盒／檢測所述預(yù)測的所述標(biāo)記的其它方法的試驗。
【專利說明】用于識別腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記、方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開涉及用于識別癌癥的預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記的組合。本公開還涉及識別所述標(biāo)記的方法、預(yù)測預(yù)后的方法和癌癥的計劃的個性化治療的方法。本公開還涉及包含針對所述預(yù)測的所述標(biāo)記的抗體的試劑盒/檢測所述預(yù)測的所述標(biāo)記的其它方法的試驗。
【背景技術(shù)】
[0002]化學(xué)療法/放射療法:
[0003]在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，癌細(xì)胞的檢測、識別和表征是診斷的重要方面。在醫(yī)學(xué)的眾多挑戰(zhàn)中沒有一個比癌癥的治療和治愈具有更有爭議的開端或經(jīng)歷更艱難的進展。大多數(shù)患者的有效治療需要使身體中的每個器官阻止轉(zhuǎn)移性疾病。大于70%的癌癥患者經(jīng)受化療/放射療法。
[0004]盡管在腫瘤學(xué)療法中從多角度取得開創(chuàng)性進展，癌癥治愈仍然是難以捉摸的。由于對放射和化學(xué)療法的抗性的發(fā)展，因此盡管在某種程度上最大化療法但晚期的實體惡性腫瘤仍然保持為治療學(xué)挑戰(zhàn)。例如，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是利用目前僅提供減輕疼痛療法的最致命的癌癥之一。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的護理標(biāo)準(zhǔn)由手術(shù)切除、離子化外部波束輻照(ionizingexternal beam irradiation)和化學(xué)療法組成。放射療法已是最有效的非外科的治療方式，然而復(fù)發(fā)是基本普遍的。
[0005]然而，經(jīng)受化療/放療的大多數(shù)患者會遭受治療的不必要的嚴(yán)重副作用。此外，許多患者還表現(xiàn)出對治療的抗性,導(dǎo)致治療失敗。
[0006]因此，對于研發(fā)可以確定處方的化療/放療的先驗(priori)有效性的診斷試驗存在需求?，F(xiàn)今，基于諸如腫瘤組織學(xué)、腫瘤體積以及腫瘤分期等臨床參數(shù)和日益發(fā)展的生物成像技術(shù)來作出治療決定?？紤]到周圍正常組織的耐性限度，放療/化療劑量和計劃以及與藥物的組合被規(guī)定為經(jīng)驗類解決方案。因為目前的標(biāo)準(zhǔn)治療處方并不將腫瘤的異質(zhì)性/個體性考慮在內(nèi)，所以這些療法經(jīng)常失敗且患者經(jīng)受不必要的副作用。
[0007]腫瘤通常具有兩種細(xì)胞，CSC和腫瘤細(xì)胞。CSC僅構(gòu)成一部分腫瘤并且通常占少數(shù)。腫瘤的本體由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，腫瘤細(xì)胞不斷分裂并且形成被稱作“腫瘤”的實體大團塊。
[0008]另一方面，CSC是幾乎不分裂并且具有自我更新能力的靜止細(xì)胞(休眠細(xì)胞，quiescent cells),即按照它們制造作為它們自身的完美復(fù)制品的子細(xì)胞并且制造可以進行并分化成特定腫瘤的各種細(xì)胞的方式進行分裂(參考:The Biology of CancerStem Cells, Neethan A.Lobo et al, Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2007.23:675-99 和 Thetheoretical basis of cancer-stem-cell-based therapeutics of cancer:can it beput into practice ?，Isidro Sa’ nchez-Garcl’ a et al，BioEssays29:1269-1280)。
[0009]化療/放療爭取通過靶向并殺死快速分裂的細(xì)胞來減少腫瘤尺寸。由于CSC幾乎不分裂，因此它們不被這些療法殺死并且幸存以再次制造腫瘤，這被稱作癌癥的“復(fù)發(fā)，，。(參考:Chemotherapy and Cancer Stem Cells，Jeremy N.Rich et al, Cell StemCelll，0ctober2007 ；Identification of Selective Inhibitors of Cancer Stem Cellsby High-Throughput Screening, Piyush B.Gupta et al，Celll38，1-15，August21，2009 ；Identification and targeting of cancer stem cells，Tobias Schatton et al,BioEssays31:1038-1049 ;TUM0UR STEM CELLS AND DRUG RESISTANCE，Michael Dean etal,Nature Reviews,cancer,Volume5,April2005 ；Cancer stem cells in solid tumors，Patrick C.Hermann et al，SeminarsinCancer Biology (2008))。
[0010]依據(jù)上述參考文獻可見，使用FACS (熒光激活細(xì)胞分選法)，已將CSC從基于它們具備的某種細(xì)胞表面標(biāo)記的新生腫瘤中隔離出來。這些如100-200個細(xì)胞一樣少的經(jīng)隔離的CSC足以引發(fā)作為針對上達至10000-20000個非CSC /本體腫瘤細(xì)胞的新腫瘤。(參考:Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells,Muhammad Al-Hajjet al,PNAS,Aprill,2003,vol.100—n0.—3983-3988 !Identification ofa Cancer StemCell in Human Brain Tumors,Sheila K.Singh et al, CANCER RESEARCH63，5821—5828，Septemberl5, 2003 !Identification of human brain tumour initiating cells, SheilaK.Singh et al, NATURE | V0L432 118N0VEMBER2004) ? 90 年代中期在血癌中識別出 CSC，2003年首次在實體腫瘤中從乳腺癌，隨后從腦癌和所有其它癌中識別出)。
[0011]CSC的存在和直接抵抗它們的藥物的缺乏，可能是難倒我們治愈癌癥的一個原因。許多制藥公司和生物技術(shù)正致力于發(fā)明會專門靶向腫瘤中的這些CSC的藥物，以防止癌癥復(fù)發(fā)等。許多這些藥物正在臨床試驗中。
[0012]化療/放療的抗性和治療失敗是由于在腫瘤中存在被稱作癌癥干細(xì)胞(CSC)的細(xì)胞。腫瘤本質(zhì)上是異質(zhì)的并且含有2種細(xì)胞，癌癥干細(xì)胞和形成腫瘤本體的腫瘤細(xì)胞。然而長期以來已確認(rèn)的是，不是所有的腫瘤細(xì)胞都具有引發(fā)新腫瘤或治療后復(fù)發(fā)的潛力，近來的方法進展只出現(xiàn)了最終允許的CSC的識別并研究它們的生物學(xué)。已預(yù)期使CSC從越來越多的包括白血病以及乳房、腦、結(jié)腸、頭和頸以及胰腺的腫瘤的人類癌癥中隔離。對于不同的腫瘤已顯示出，當(dāng)與來自相同腫瘤的未分類種群相比時，CSC亞群的移植導(dǎo)致較高的腫瘤轉(zhuǎn)移率。
[0013]CSC定義為腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞，其具備自我更新并產(chǎn)生包含腫瘤的所有癌細(xì)胞的異質(zhì)世系(血統(tǒng))的能力。這意味著CSC可能是能夠通過對稱或不對稱分裂擴展CSC池或分化為癌癥祖細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞的小亞群。然而，這點是腫瘤依賴的并且在黑色素瘤CSC中導(dǎo)致總腫瘤細(xì)胞的顯著較高的百分?jǐn)?shù)。非干細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部構(gòu)成所有癌細(xì)胞的本體，但是僅具有有限的增殖潛力并且是非致瘤的。
[0014]CSC的性能:CSC是存在于腫瘤中的靜止細(xì)胞，并由此與構(gòu)成腫瘤本體的迅速增殖的腫瘤細(xì)胞功能不同。由于本質(zhì)上靜止的CSC能夠抵抗使化療/放療以及這些療法靶向迅速分裂的腫瘤細(xì)胞的“合意的效果”。此外，CSC賦有多個離子通道/轉(zhuǎn)運，較高的缺氧耐性和差異基因表達等，這有助于它們的抗化療/放療性現(xiàn)象。增加的數(shù)據(jù)體表明CSC和非CSC的生物差異對響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)療法是重要的并且大多數(shù)制藥公司正使用這些差異來設(shè)計針對CSC的合理藥物。對于放射療法和化學(xué)療法治療的失敗而言，一個根本的原因可能是關(guān)于根除癌癥干細(xì)胞(CSC)的當(dāng)前治療的低療效。漸增的證據(jù)表明CSC對細(xì)胞毒素/放射療法的抗性并可以由此導(dǎo)致治療失敗。
[0015]存在于與本公開相似的領(lǐng)域中的當(dāng)前技術(shù)包括Oncotype Dx和Mammaprint。這些是相似的，但是它們檢測不到CSC的存在。它們評估患者中ER / PR和Her-2-neu途徑的存在以評估患者是否需要手術(shù)后的化學(xué)療法。目前，沒有檢測腫瘤中存在CSC的診斷試驗，并由此不能預(yù)測復(fù)發(fā)時間以及化療和放療的有用性。此外，當(dāng)前的方法在選擇具體的化學(xué)療法藥物/組合方面不能提供幫助。
[0016]依據(jù)臨床觀點，這個觀念的直接結(jié)果是只要消除所有CSC癌癥療法就可以治愈患者，并且單一存活的CSC可以引起復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。此外，還意味著如果在開出化療/放射療法的處方之前針對CSC的存在評估腫瘤，則存在腫瘤學(xué)家可以預(yù)測治療的有效性、更好地管理癌癥治療和在治療無效的情況下降低對患者治療的不必要的副作用的公平機會。自2004年發(fā)現(xiàn)第一種實體腫瘤CSC以來，在CSC生物學(xué)方面已有很大進展。CSC的含量、分布和敏感性的預(yù)測試驗、微環(huán)境CSC生態(tài)位和標(biāo)記應(yīng)當(dāng)用于在分級解決方案中允許療法的基于CSC的個性化定制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]因此，本公開涉及用于癌的預(yù)后的選自下組的生物學(xué)標(biāo)記，該組包括⑶44、⑶24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、0ct_4、Sox_2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合；一種用于具有癌或疑似具有癌的受試者的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含針對選自包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4, Sox-2, APC、β -連環(huán)蛋白和 P-鈣粘蛋白或它們的任意組合的組中的生物學(xué)標(biāo)記的抗體，可選地連同用于履行免疫組織化學(xué)和指導(dǎo)手冊的有機溶劑、試劑、第二抗體、酶；一種識別是或疑似是腫瘤的生物樣品中的細(xì)胞上的生物學(xué)標(biāo)記的方法，所述方法包括以下行為:a)采集、固定、切片和用有機溶劑處理生物樣品，接著使用預(yù)定樣品稀釋物進行抗原修復(fù)和b)添加針對選自自下組的生物學(xué)標(biāo)記的第一抗體，該組包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4, Sox-2, APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合，以及添加與酶連接的第二抗體和用于獲得用于識別生物學(xué)標(biāo)記的顯色反應(yīng)或熒光與試劑；一種具有癌或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括以下行為:a)采集來自受試者的生物樣品并且識別在樣品的細(xì)胞中選自下組的受體的表達或缺乏以獲得表達識別細(xì)胞(expression identified cell),該組包括雌激素受體、孕酮受體和Her-2-neu受體或它們的任意組合，b)用針對選自下組的生物學(xué)標(biāo)記的抗體對步驟(a)的所述細(xì)胞實施免疫組織化學(xué)分析，該組包括⑶44、⑶24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、0ct-4、Sox-2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合以及c)識別在樣品的細(xì)胞中受體和一種或多種生物學(xué)標(biāo)記的表達或缺乏并且使標(biāo)記的識別與用于預(yù)測受試者的預(yù)后的預(yù)測療效參考表相關(guān)聯(lián)；以及一種治療癌的方法，所述方法包括以下行為:a)針對生物樣品中的腫瘤細(xì)胞識別選自包括CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox-2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-1丐粘蛋白或它們的任意組合的組中的生物學(xué)標(biāo)記，并且預(yù)測具有癌或疑似具有癌的受試者的預(yù)后，以及b)基于該預(yù)測，設(shè)計抑制癌的癌癥療法。
【具體實施方式】
[0018]本公開涉及用于癌的預(yù)后的選自包含CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox-2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-1丐粘蛋白或其任意組合的組的生物學(xué)標(biāo)記。
[0019]在本公開的一個實施方式中，癌是乳腺癌。[0020]在本公開的另一個實施方式中，標(biāo)記位于選自下組的位置處的所述癌的腫瘤細(xì)胞上，該組包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和核膜或它們的任意組合。
[0021]本公開還涉及用于具有癌或疑似具有癌的受試者的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含針對選自包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD 133、Oc t_4、Sox_2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或其任意組合的組的生物學(xué)標(biāo)記的抗體，可選地連同用于履行免疫組織化學(xué)和指導(dǎo)手冊的有機溶劑、試劑、第二抗體、酶。
[0022]本公開還涉及一種識別是或疑似是腫瘤的生物樣品中的細(xì)胞上的生物學(xué)標(biāo)記的方法，所述方法包括以下行為:
[0023]a)采集、固定、切片和用有機溶劑處理生物樣品，接著使用預(yù)定樣品稀釋物進行抗原修復(fù)并且添加針對選自下組的生物學(xué)標(biāo)記的第一抗體，該組包括⑶44、⑶24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4, Sox-2, APC, β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合；以及
[0024]b)添加與酶連接的第二抗體和用于獲得用于識別生物學(xué)標(biāo)記的顯色反應(yīng)或熒光的試劑。
[0025]在本公開的一個實施方式中，癌是乳腺癌。
[0026]在本公開的另一個實施方式中，有機溶劑選自包括乙醇和二甲苯或它們的任意組合的組。
[0027]在本公開的又另一個實施方式中，利用常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)在預(yù)定條件下實施采集、固定、切片和處理。
[0028]本公開還涉及一種具有癌或疑似具有癌的受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括以下行為:
[0029]a)采集來自受試者生物樣品并且識別在樣品的細(xì)胞中下組的受體的表達或缺乏以獲得表達識別細(xì)胞，該組包括雌激素受體、孕酮受體和Her-2-neu受體或其任意組合；
[0030]b)用針對選自下組的生物學(xué)標(biāo)記的抗體對步驟(a)的所述細(xì)胞實施免疫組織化學(xué)分析，該組包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4, Sox-2, APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合；以及
[0031]c)識別在樣品的細(xì)胞中受體和一種或多種生物學(xué)標(biāo)記的表達或缺乏并且使標(biāo)記的識別與用于預(yù)測受試者的預(yù)后的預(yù)測療效參考表相關(guān)聯(lián)。
[0032]在本公開的一個實施方式中，利用常規(guī)方法實施免疫組織化學(xué)分析，并且其中由于來自樣品的細(xì)胞的染色，通過使完成該方法時所獲得的顯色反應(yīng)或熒光可見來實施標(biāo)記的識別。
[0033]在本公開的另一個實施方式中，相關(guān)聯(lián)是基于選自下組的參數(shù)，該組包括染色的百分?jǐn)?shù)、染色的強度和染色的位置或它們的任意組合；并且其中染色的位置選自包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和核膜或它們的任意組合的組。
[0034]在本公開的又另一個實施方式中，相關(guān)聯(lián)包括使染色的百分?jǐn)?shù)乘以染色的強度得到預(yù)測分?jǐn)?shù)，以便取決于生物學(xué)標(biāo)記表達的位置將預(yù)后預(yù)測為好或壞。
[0035]在本公開的還另一個實施方式中，預(yù)測分?jǐn)?shù)選自下組，該組包括約I至約80范圍內(nèi)的低分?jǐn)?shù)、約81至約150范圍內(nèi)的中等分?jǐn)?shù)和約150至約300范圍內(nèi)的高分?jǐn)?shù)。
[0036]在本公開的還另一個實施方式中，預(yù)測療效參考表為選自包括1、1A、2、2A、3、3A、
4、4A、5、6、6A、7、7A、8、9和10或這些表的任意組合的組中的單獨的表或表的組合。[0037]本公開還涉及一種治療癌的方法，所述方法包括以下行為:
[0038]a)針對生物樣品中的腫瘤細(xì)胞識別選自包括CD44、⑶24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox-2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合的組中的生物學(xué)標(biāo)記并且預(yù)測具有癌或疑似具有癌的受試者的預(yù)后；以及
[0039]b)基于該預(yù)測，設(shè)計抑制癌的癌癥療法。
[0040]本公開是使用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-PCR)作為技術(shù)利用某種CSC特定標(biāo)記評估腫瘤樣品以找出在表示患者對標(biāo)準(zhǔn)療法的反應(yīng)的給定腫瘤中CSC /耐藥性細(xì)胞的存在的診斷試驗。標(biāo)記的實例包括但不限于以下標(biāo)記:⑶44、⑶133、⑶24、0ct4、Sox2和存在于CSC上的離子轉(zhuǎn)運體/通道如轉(zhuǎn)運體的ABC家族即ABCG2和ABCC4、ESA、APC、P-連環(huán)蛋白、(磷酸化(phospho)、全磷酸化和非磷酸化的)B-1丐粘蛋白。
[0041]本公開在用于腫瘤早期檢測的腫瘤學(xué)領(lǐng)域中有效用。可能的癌癥的診斷/預(yù)后將在計劃化療和處方的交替靶向治療方面輔助腫瘤學(xué)家。還將使患者免于昂貴治療的不必要的副作用。
[0042]本公開也涉及用于識別CSC的標(biāo)記以及這些標(biāo)記的組合和檢測這種癌干細(xì)胞(CSC)的方法學(xué)。
[0043]通過參考以下用于僅說明的目的且不意圖限制本公開的范圍而提供的具體實施例可以獲得更完整的理解。
[0044]以下實施例表示用于乳腺癌的預(yù)后的可以單獨或彼此組合使用的各種標(biāo)記。本文中所提供的實施例示出可能用于分析并達到具有或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后的各種類的組合。關(guān)于如何通過認(rèn)知標(biāo)記的組合或單獨認(rèn)知標(biāo)記得到解釋，為了表示和清楚來組合本文中所提供的表。對于不能通過本文中的實施例明確說明的解釋而言，可以單獨使用或與本文中所提供的任意其它標(biāo)記組合使用來自本文中所示的任意組合的任意表。所有的這類可能的組合以及這種組合的解釋都落入本公開的范圍內(nèi)。因此，為了精確預(yù)后并基于這種預(yù)后為進一步治療過程制定策略，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過檢查樣品、得到結(jié)果以及使該結(jié)果與本文中所提供的標(biāo)記的解釋相比較來設(shè)想受試者的預(yù)后。
[0045]實施例
[0046]在本公開中，利用針對⑶44和⑶24的兩種抗體實施IHC (免疫組織化學(xué))以理解是否可以在這些患者中看見任何CSC信號。被找到的信號是⑶44+ /⑶24_/lOT。
[0047]然而，基于FACS分析已知這兩種標(biāo)記存在于CSC上，它僅檢測表面/膜相關(guān)的表達。FACS可以僅檢測膜表達，因此盡管在許多情況下在細(xì)胞質(zhì)中看見⑶24表達，它仍被視作陰性的或者被標(biāo)記為細(xì)胞質(zhì)的。然而，IHC可以檢測在膜和細(xì)胞質(zhì)二者中CD24的存在，并且在許多情況下，可以在除膜之外的細(xì)胞質(zhì)中或有時僅在細(xì)胞質(zhì)中看見表達。因此，在表達完全是如本公開的某些表中所公開的細(xì)胞質(zhì)的情況下，如果使用FACS檢測則它們中的結(jié)果可以視作CD24-(CD24陰性)，與本公開中使用IHC不同。因為基于本公開的IHC的檢測，所以檢測膜以及細(xì)胞質(zhì)和核膜表達。
[0048]在本公開的一個實施方式中，值得注意的是，癌/腫瘤結(jié)節(jié)狀態(tài)/分期NO也有時反映壞療效。然而，作為慣例，通常在結(jié)節(jié)分期中增長如:N2或NI反映壞療效,而NO被認(rèn)為沒有轉(zhuǎn)移至鄰近的結(jié)節(jié)并由此導(dǎo)致好療效/具有較不嚴(yán)重形式的癌/腫瘤。盡管如此，本公開中所公開的表10 (病歷)清楚地描述了在較低結(jié)節(jié)分期腫瘤情況下有壞療效并且反之亦然。所以，不能完全依賴結(jié)節(jié)狀態(tài)并由此需要樣品的更深度分析，是因為不能單獨基于這種現(xiàn)有技術(shù)，如結(jié)節(jié)狀態(tài)識別進行好或壞的預(yù)后。因此，本公開清楚地反映了對于可以與現(xiàn)有技術(shù)如腫瘤結(jié)節(jié)狀態(tài)組合的、識別癌細(xì)胞上存在的標(biāo)記的需求和重要性。所以，本公開顯然的是，染色細(xì)胞的％、染色的強度和各自標(biāo)記的位置的組合被認(rèn)為達到患者樣品的正確預(yù)后。
[0049]在本公開的另一個實施方式中，還值得注意的是，下面反映的標(biāo)記是待識別的，不僅在患者樣品的癌干細(xì)胞/癌起始細(xì)胞/腫瘤起始細(xì)胞中，而相反地也包括樣品的所有腫瘤細(xì)胞。
[0050]實施例1
[0051]用于識別本公開的患者樣品中的標(biāo)記的技術(shù)包括免疫組織化學(xué)(IHC)或RT-PCR。
[0052]使用如下的技術(shù)實施識別來自腫瘤的癌干細(xì)胞的過程:
[0053]從患者采集腫瘤樣品。樣品是通過將樣品包埋在石蠟中以制成塊而固定的福爾馬林
[0054]I
[0055]在載玻片上將該塊切片
[0056]I
[0057]使載玻片穿過一系列有機溶劑以脫水
[0058]I
[0059]使用特定樣品稀釋物，在受控的實驗條件下實施抗原修復(fù)
[0060]I
[0061]然后將載玻片上的切片冷卻至室溫(RT)
[0062]I
[0063]然后添加封閉劑
[0064]I
[0065]然后添加針對抗原的第一抗體
[0066]I
[0067]然后添加與酶連接的第二抗體
[0068]I
[0069]然后添加用于獲得顯色反應(yīng)的試劑
[0070]I
[0071]觀察用于識別染色的％、染色的強度和位置的染色。使所有這些結(jié)果相關(guān)聯(lián)以達到用于識別腫瘤樣品中CSC的存在并的結(jié)論并且達到所得到的好/壞療效。
[0072]在本公開的一個實施方式中，在下面的詳細(xì)方案中所提到的有機溶劑、試劑、第二抗體和酶僅用于說明的目的并且本質(zhì)上不應(yīng)當(dāng)解釋為限制性的。本公開設(shè)想并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且常用的這類溶劑、試劑、第二抗體和酶的所有可能的組合及替換。
[0073]為了進一步提供關(guān)于本公開中采用的方法的清楚性，如下提供免疫組織化學(xué)的詳細(xì)方案:
[0074]IHC 方案
[0075]A]涂覆載玻片并切割FFPE塊的部分:[0076]1.用自來水洗滌新的載玻片。
[0077]2.用I %酸醇溶液(1ml HCl+99ml70%乙醇)浸潰載玻片5分鐘。
[0078]3.用蒸餾水洗滌載玻片一次以確保洗掉酸醇。
[0079]4.干燥載玻片。
[0080]5.室溫(RT)下將載玻片浸潰于10%聚-L-賴氨酸水溶液(PLL)中15分鐘。
[0081]6.除去載玻片并在RT下干燥它們。
[0082]7.使用Leica Microteome在這些PLL涂敷的載玻片上獲取FFPE腫瘤塊的3— 5微米部分。
[0083]8.在60°C下孵育該部分3小時或過夜。
[0084]B]脫蠟方案:
[0085]1.在RT下于二甲苯-1中浸潰具有腫瘤部分的載玻片10分鐘。
[0086]2.在RT下于二甲苯-1I中浸潰載玻片10分鐘。
[0087]3.在RT下于二甲苯-1II中浸潰載玻片10分鐘。
[0088]4.在RT下于100%乙醇中浸潰載玻片5分鐘。
[0089]5.在RT下于100%乙醇中浸潰載玻片5分鐘。
[0090]6.在RT下于70%乙醇中浸潰載玻片5分鐘。
[0091]7.在RT下于70%乙醇中浸潰載玻片5分鐘。
[0092]8.在RT下于D / W中浸潰載玻片5分鐘。
[0093]9.在RT下于3%的H2O2處于甲醇中的溶液中浸潰載玻片20-30分鐘。
[0094]C]抗原修復(fù)和免疫染色:
[0095]這個步驟對于各抗體/標(biāo)記而言將是不同的。下面是抗體A和B的方案。如下是用于兩種抗體的抗原修復(fù)的緩沖液:
[0096]ρΗ7.4 的 ImM EDTA+1OmM Tris-Cl 緩沖液
[0097]1.對于抗體A:通過使用壓力鍋條件在Tris-EDTA緩沖液中鳴笛3聲(取決于你的壓力鍋，可以調(diào)整鳴笛數(shù)量。請避免過度蒸煮)進行最佳修復(fù)抗原。
[0098]對于抗體B:通過如下微波條件進行最佳修復(fù)抗原:
[0099]800瓦特進行6分鐘
[0100]800瓦特進行6分鐘
[0101]200瓦特進行15分鐘
[0102]然而，也可以嘗試如上的壓力鍋方法。
[0103]2.抗原修復(fù)之后，用30分鐘在緩沖液自身中將載玻片冷卻至RT。
[0104]3.在蒸餾水中洗滌載玻片2分鐘。
[0105]4.在TBST (具有0.1 %吐溫20的三羥甲基氨基甲烷-緩沖鹽水)中洗滌載玻片5分鐘。
[0106]5.在TBST中洗滌載玻片5分鐘。
[0107]6.用3%的BSA溶液封閉載玻片/如果你正在使用第二抗體的試劑盒然后酌情使用由試劑盒給定的封閉。
[0108]7.在RT下于緩沖液(見下文)中添加稀釋的第一抗體60分鐘。
[0109]8.在RT下于TBST中洗滌載玻片5分鐘。[0110]9.重復(fù)步驟#8兩次。
[0111]10.按照試劑盒(建議的)適當(dāng)?shù)南♂尪忍砑拥诙贵w即與抗小鼠抗體連接的HRP。在RT下培養(yǎng)30-60分鐘。
[0112]IL在RT下于TBST中洗滌5分鐘。
[0113]12.重復(fù)步驟#11兩次。
[0114]13.按照試劑盒的建議添加底物DAB等。
[0115]14.按照試劑盒(建議)洗掉過量的底物。
[0116]15.具有蘇木精的復(fù)染劑。
[0117]16通過在100%乙醇中浸潰5分鐘洗掉過量的染色劑。
[0118]17.重復(fù)步驟 #16。
[0119]18.干燥載玻片。
[0120]19.在RT下于二甲苯中洗滌一次進行5分鐘。
[0121]20.在DPX /適當(dāng)?shù)姆夤探橘|(zhì)中封固。
[0122]21.按照片材評分/分級載玻片。
[0123]各溶液的配方:
[0124]1.酸醇:1ml 濃 HCl+99ml70% 乙醇
[0125]2.抗原修復(fù)緩沖液:10mM EDTA pH8.0+10mM Tris_ClpH7.4
[0126]3.第一抗體稀釋緩沖液:10mM Tris_ClpH7.4+0.9% NaCl+0.5% BSA
[0127]4.封閉緩沖液:3— 5%的處于Tris_ClpH7.4中的BSA，或使用由試劑盒給定的封閉液或依據(jù)你的方案。
[0128]5.TBST:10mM Tris_ClpH7.4+0.9% NaCl+0.1 % 吐溫-20
[0129]進一步地，僅僅為了說明的目的，如下提供抗原修復(fù)所采用的特定樣品稀釋物、有機溶劑和實驗條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠理解采用的各種參數(shù)和條件，因此對得到這種分析的方案而言本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有各種替代和替換也在本公開的范圍內(nèi):
[0130]抗體A-壓力鍋(PC) ,Tris-EDTA (TE) ρΗ7.4緩沖液，在設(shè)置2處2聲鳴笛和在設(shè)置I處I聲鳴笛；1:1400稀釋度
[0131]抗體B-微波，50mM檸檬酸鹽緩沖液pH6.0 ; ‘高’設(shè)置-700W處微波/ Cit6.0 /7分鐘；高-750W處5分鐘；‘解凍’設(shè)置-200W處15分鐘；稀釋度I:50
[0132]抗體C-2N HCl，RT ; 1: 300 稀釋
[0133]抗體E-在90°C下于50mM檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中水浴30分鐘；稀釋度1:600
[0134]抗體F-壓力鍋，檸檬酸鹽緩沖液pH-6 ;在加熱器上于設(shè)置I處I聲鳴笛并在I設(shè)置處沸騰20分鐘；稀釋度1:200
[0135]抗體G-2N HCl，RT15 分鐘，I:50 稀釋度
[0136]抗體H-在設(shè)置2處PC / Cit6.0 / 2聲鳴笛和設(shè)置I處I聲鳴笛；稀釋度1: 1000
[0137]抗體1-壓力鍋(設(shè)置2處2分鐘時2聲鳴笛，設(shè)置I處I聲鳴笛)，Cit6.0 ;稀釋度 1:1000
[0138]抗體J-壓力鍋，CU6.0-壓力鍋(設(shè)置2處2分鐘時2聲鳴笛，設(shè)置I處I聲鳴笛)；抗體稀釋度1:50
[0139]抗體K-在檸檬酸鹽中于90°C下水浴30分鐘，pH6.0 ;1:100稀釋度[0140]抗體L-壓力鍋(2分鐘時2聲鳴笛，I分鐘時I聲鳴笛)，TE緩沖液7.4pH，購買的預(yù)稀釋的抗體
[0141]抗體O-在檸檬酸鹽緩沖液pH6.0下壓力鍋在設(shè)置2處2聲鳴笛和在設(shè)置I處I
聲鳴笛
[0142]實施例2
[0143]本公開中所使用的抗體選自以下的一種或多種:
[0144]CD44:(參考:CD44Std./ HCAMAb-4 (克隆 156-3C11))
[0145]CD24:(參考:(CD24(GP1-連接的表面粘蛋白)Ab_2(克隆SN3b)
[0146]ABCG2:(參考:來自 Novus Biologicals 的 NB-11093511)
[0147]ESA:(參考:Novocastra上皮特異性抗原)
[0148]ABCC4:(參考:ABCC4單克隆的抗體(M03)，克隆182)
[0149]CD 133:(參考:來自 Abnova 的 PAB-12663)
[0150]Oct-4:(參考:0CT4 抗體(NBl 10-90606))
[0151]Sox-2:(來自 Spring Biosciences 的 E-18600)
[0152]APC:(參考:Adenomateous Polyposis Coli 基因產(chǎn)品)
[0153]P-鈣粘蛋白:(參考:抗-P-鈣粘蛋白抗體[56C1]，預(yù)稀釋的(ab75442))
[0154]B-連環(huán)蛋白:(參考:抗活性-β-連環(huán)蛋白(抗-ABC)，克隆8E7)JBC-1870057。
[0155]在以下來自表I一9的所有表中，染色細(xì)胞的強度具有I至3范圍內(nèi)的值。此處，強度1=染色載玻片的非常淺的棕顏色，強度2=染色載玻片的中等棕顏色和強度3=染色載玻片的深棕顏色。中間色觀察被稱作I一2或2-3等。
[0156]進一步地，選自包含表1、1A、2、2A、3、3A、4、4A、5、6、6A、7、7A、8、9 和 10 的組的本文
中所提供的表可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員單獨使用或使用其表的任意組合以解釋并達到用于預(yù)測具有或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后的相關(guān)結(jié)果。在本公開中這些表也可以單獨地或組合地被稱作預(yù)測結(jié)果參考表。
[0157]表IA
[0158]
【權(quán)利要求】
1.用于癌癥的預(yù)后選自下組的生物學(xué)標(biāo)記，該組包括CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox-2、APC, β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物學(xué)標(biāo)記，其中所述癌癥是乳腺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物學(xué)標(biāo)記，其中所述標(biāo)記位于選自下組的位置處的所述癌癥的腫瘤細(xì)胞上，該組包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和核膜或它們的任意組合。
4.一種用于具有癌癥或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含針對選自包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD 133、Oct-4, Sox-2, APC, β -連環(huán)蛋白和 P-鈣粘蛋白或它們的任意組合的組中的生物學(xué)標(biāo)記的抗體，可選地連同用于實施免疫組織化學(xué)的有機溶劑、試劑、第二抗體、酶，以及指導(dǎo)手冊。
5.一種識別是或疑似是腫瘤的生物樣品中的細(xì)胞上的生物學(xué)標(biāo)記的方法，所述方法包括以下操作: a)采集、固定、切片和用有機溶劑處理所述生物樣品，接著使用預(yù)定的樣品稀釋物進行抗原修復(fù)并且添加針對選自下組的生物學(xué)標(biāo)記的第一抗體，該組包括⑶44、⑶24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4、Sox_2、APC、β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合；以及 b)添加與酶結(jié)合的第二抗體和用于獲得用以識別所述生物學(xué)標(biāo)記的顯色反應(yīng)或熒光的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒和根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述`的試劑盒和根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述有機溶劑選自包括乙醇和二甲苯或它們的任意組合的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中利用常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)在預(yù)定條件下實施所述采集、固定、切片和處理。
9.一種具有癌癥或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后的方法，所述方法包括以下操作: a)采集來自所述受試者的生物樣品并且識別在所述樣品的細(xì)胞中選自下組的受體的表達或缺乏以獲得表達識別細(xì)胞，該組包括雌激素受體、孕酮受體和Her-2-neu受體或它們的任意組合； b)用針對選自下組的生物學(xué)標(biāo)記的抗體對步驟(a)的所述細(xì)胞實施免疫組織化學(xué)分析，該組包括 CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、Oct-4, Sox-2, APC, β -連環(huán)蛋白和P-鈣粘蛋白或它們的任意組合；以及 c)識別在所述樣品的細(xì)胞中所述受體和一種或多種所述生物學(xué)標(biāo)記的表達或缺乏并且使所述標(biāo)記的所述識別與用于預(yù)測所述受試者的所述預(yù)后的預(yù)測結(jié)果參考表相關(guān)聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中利用常規(guī)方法實施所述免疫組織化學(xué)分析，并且其中由于來自所述樣品的所述細(xì)胞的染色，通過使完成所述方法時所獲得的顯色反應(yīng)或熒光可視化來實施所述標(biāo)記的識別。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述相關(guān)聯(lián)是基于選自下組的參數(shù)，該組包括染色的百分?jǐn)?shù)、染色的強度和染色的位置或它們的任意組合；并且其中所述染色的所述位置選自包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和核膜或它們的任意組合的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述相關(guān)聯(lián)包括使所述染色的百分?jǐn)?shù)乘以所述染色的強度以得到預(yù)測分?jǐn)?shù)，以便取決于所述生物學(xué)標(biāo)記表達的位置將所述預(yù)后預(yù)測為好或壞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述預(yù)測分?jǐn)?shù)選自下組，該組包括約I至約80范圍內(nèi)的低分?jǐn)?shù)、約81至約150范圍內(nèi)的中等分?jǐn)?shù)和約150至約300范圍內(nèi)的高分?jǐn)?shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述預(yù)測結(jié)果參考表為選自包括1、1A、2、2A、3、.3A、4、4A、5、6、6A、7、7A、8、9和10或這些表的任意組合的組中的單獨的表或表的組合。
15.一種治療癌癥的方法，所述方法包括以下操作: a)識別生物樣品中的腫瘤細(xì)胞上的選自包括CD44、CD24、ABCG2、ESA、ABCC4、CD133、.Oct-4、Sox-2、APC> β -連環(huán)蛋白和P-1丐粘蛋白或它們的任意組合的組中的生物學(xué)標(biāo)記并且預(yù)測具有癌癥或疑似具有癌癥的受試者的預(yù)后；以及 b)基于所述預(yù)測，設(shè)計用于抑制所述癌癥的癌癥療法。
【文檔編號】C12N5/095GK103562723SQ201280021095
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月27日
【發(fā)明者】曼吉里·巴克爾 申請人:歐恩克斯特姆診斷學(xué)（毛里求斯）私人有限公司