一種用于控制丁二醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法
【專利摘要】用于改善2,3-丁二醇發(fā)酵的效率的方法。更具體地，增加一種或多種一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌對(duì)含一氧化碳或含一氧化碳和氫氣的底物厭氧發(fā)酵的丁二醇生產(chǎn)率的方法。所述方法包括供應(yīng)氫氣耗盡的底物以增加丁二醇生產(chǎn)率。所述方法包括以至少5g/L/天的容積生產(chǎn)率生產(chǎn)丁二醇。
【專利說明】—種用于控制丁二醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月31日提交的序號(hào)為61/470，172的美國申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該美國申請(qǐng)以引用的方式全文納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及通過微生物發(fā)酵含一氧化碳或含一氧化碳和氫氣的底物生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
【背景技術(shù)】
[0004]用于運(yùn)輸?shù)纳锶剂鲜怯形Φ钠吞娲?，并且作為低濃度摻和物迅速進(jìn)入燃料市場(chǎng)。源自天然植物來源的生物燃料比源自化石來源的那些(例如汽油)在環(huán)境方面更加可持續(xù)，它們的 使用使因燃料燃燒而釋放到大氣中的所謂化石二氧化碳(CO2)氣體的水平下降。此外，生物燃料可在許多地理區(qū)域局部產(chǎn)生，并且可起到減少對(duì)進(jìn)口化石能源的依賴的作用。適于用作生物燃料的醇包括乙醇、丁醇和2，3- 丁二醇。
[0005]乙醇正迅速地成為全球主要的富含氫的液體運(yùn)輸燃料。2002年全球的乙醇消耗量估計(jì)為108億加侖。由于歐洲、日本、美國和一些發(fā)展中國家對(duì)乙醇的興趣增加，燃料乙醇工業(yè)的全球市場(chǎng)也預(yù)計(jì)會(huì)在未來急劇增長。
[0006]丁二醇，包括1，2_ 丁二醇、1，3_ 丁二醇、1，4_ 丁二醇和2，3_ 丁二醇，相對(duì)于乙醇可被認(rèn)為具有許多種優(yōu)勢(shì)。與乙醇相似，丁二醇可被直接用作汽車燃料添加物。丁二醇還可被相對(duì)容易地轉(zhuǎn)化成許多其他具有潛在更高價(jià)值和/或更高能量的產(chǎn)物。例如，2，3- 丁二醇可在兩步法中被容易地轉(zhuǎn)變成可用作航空燃料的八碳二聚體。
[0007]2，3- 丁二醇的多能性源于其雙官能團(tuán)骨架，即2個(gè)羥基位于鄰近的碳原子上，使該分子很容易地轉(zhuǎn)化成例如丁二烯、保泰松(bUtadione)、3-羥基-2- 丁酮、甲基乙基甲酮等。這些化合物被用作基礎(chǔ)分子制造多種工業(yè)生產(chǎn)的化學(xué)制品。
[0008]此外，2，3-丁二醇可被用作內(nèi)燃機(jī)的燃料。它在若干方面更類似于汽油，而不是乙醇。隨著對(duì)生產(chǎn)和應(yīng)用環(huán)境可持續(xù)燃料的興趣的增強(qiáng)，對(duì)生產(chǎn)2，3- 丁二醇(經(jīng)常稱作生物丁醇)的生物學(xué)過程的興趣也增加了。
[0009]2，3-丁二醇可通過對(duì)含碳水化合物的原料進(jìn)行微生物發(fā)酵來生產(chǎn)(SyuMJ,Appl Microbiol Biotechno155:10-18(2001), OJn et al., Chinese J ChemEngl4 (I):132-136 (2006))。2，3-丁二醇還可通過對(duì)來自作物(例如甜菜、玉米、小麥和甘蔗)的生物質(zhì)進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)。然而，這些碳水化合物原料的成本受其作為人類食物或動(dòng)物飼料的價(jià)值的影響，并且種植產(chǎn)淀粉或蔗糖的作物用于生產(chǎn)2，3- 丁二醇并非在所有地理區(qū)域都是經(jīng)濟(jì)可持續(xù)的。因此，有動(dòng)力開發(fā)將更低成本的和/或更豐富的碳源轉(zhuǎn)化成2，3-丁二醇的技術(shù)。
[0010]一氧化碳(CO)是有機(jī)材料(例如煤或石油及石油衍生產(chǎn)品)不完全燃燒的主要副產(chǎn)品。雖然含碳前體完全燃燒產(chǎn)生僅有的終產(chǎn)物C02和水，但是一些工業(yè)過程需要升高的溫度，相對(duì)于C02更有利于積累一氧化碳。一個(gè)實(shí)例是需要高溫以生成所需鋼材質(zhì)量的鋼鐵工業(yè)。例如，據(jù)報(bào)道，澳大利亞的鋼鐵工業(yè)每年產(chǎn)生并釋放入大氣超500000噸的CO。
[0011]此外，CO也是合成氣的主要組分，其中各種量的CO和H2通過對(duì)含碳燃料進(jìn)行氣化而產(chǎn)生。例如,合成氣可通過分餾廢棄木頭和木材的有機(jī)生物質(zhì)來生產(chǎn)，以產(chǎn)生用于生產(chǎn)燃料和更復(fù)雜的化學(xué)制品的前體。
[0012]CO釋放入大氣可產(chǎn)生顯著的環(huán)境影響。另外，可能需要支付排放稅，這會(huì)增加工廠的成本。因?yàn)镃O是富含 反應(yīng)能的分子，其可被用作生產(chǎn)多種化學(xué)制品的前體化合物。然而，這種有價(jià)值的原料尚未被用于生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
[0013]本發(fā)明的目的是提供一種方法，其至少一定程度上克服了上述缺點(diǎn)或至少向公眾提供一種有用的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]在本發(fā)明的第一大方面中，提供了一種增加通過微生物發(fā)酵含CO和H2的底物的丁二醇生產(chǎn)效率的方法。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種控制通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二醇的方法，所述方法包括:
[0015]i)提供含CO和H2的底物；和
[0016]ii)在含一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生丁二醇；以及一種或多種副產(chǎn)物；
[0017]其中步驟(ii)中的丁醇生產(chǎn)率受步驟(i)中所述底物的組成的影響。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物是是一種或多種醇和/或一種或多種酸。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物是乙醇。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物是乙酸。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(i)的所述底物的H2組成會(huì)影響所述丁二醇生產(chǎn)率。
[0022]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供具有高H2濃度的底物可降低2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種通過微生物發(fā)酵增加丁二醇生產(chǎn)率的方法，所述方法包括:
[0024]⑴提供H2耗盡的含CO底物；
[0025](ii)在含有一種或多種一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中，厭氧發(fā)酵所述底物以產(chǎn)生丁二醇。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包含少于20體積％的H2、少于15體積％的H2、少于10體積％的H2、少于5體積％的H2或少于2體積％的H2。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，具體的H2攝取量為少于1000mmol/L/天、少于500mmol/L/天、少于 300mmo1 /I,/ 天、少于 200mmol/L/ 天或少于 1 OOmmol /I,/ 天。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，2，3-丁二醇生產(chǎn)率為至少20g/L/天、至少25g/L/天、至少30g/L/天、至少35g/L/天、至少40g/L/天或至少45g/L/天。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵液中所述2，3- 丁二醇的濃度為至少2g/L、至少4g/L、至少6g/L、至少8g/L或至少10g/L。[0030]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種降低通過微生物發(fā)酵的丁二醇生產(chǎn)率的方法，所述方法包括:
[0031](i)提供富含H2的底物；
[0032](ii)在含有一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中，厭氧發(fā)酵所述底物。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物包括至少20體積％的H2、至少25體積％的H2、至少30體積％的H2、至少35體積％的H2、至少40體積％的H2、至少45體積％的H2或約50體積％的H2。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，具體的H2攝取量為至少2500mmol/L/天、至少3000mmol/L/天、至少 3500mmol/L/ 天、至少 4000mnio1 /I,/ 天、至少 4500mmo1 /I,/ 天或至少 SOOOmmol /I,/天。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，2，3-丁二醇生產(chǎn)率為少于15g/L/天、少于10g/L/天、少于5g/L/天、少于3g/L/天或少于lg/L/天。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵液中2，3- 丁二醇的濃度為少于2g/L或少于lg/L或約 0g/Lo
[0037]在本發(fā)明第二大方面中，提供了一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種產(chǎn)物的方法，所述方法至少包括以下步驟:
[0038](a)提供含一氧化碳或含一氧化碳和氫氣的底物；和
[0039](b)在含有一種或多種一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌的培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器中，厭氧發(fā)酵所述底物以生產(chǎn)2，3- 丁二醇和一種或多種副產(chǎn)物；
[0040]其中2，3- 丁二醇生產(chǎn)率的增加與所述發(fā)酵罐中提供的細(xì)胞的年齡相關(guān)。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物為一種或多種醇和/或一種或多種酸。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物為乙醇。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種副產(chǎn)物為乙酸。
[0044]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用細(xì)胞再循環(huán)部件來增加所述生物反應(yīng)器中細(xì)胞的平均年齡。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解細(xì)胞再循環(huán)部件可包括但不限于細(xì)胞再循環(huán)膜或盤疊式離心分離機(jī)。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述生物反應(yīng)器中細(xì)胞的平均年齡增加時(shí)，2，3- 丁二醇生
產(chǎn)率增加。
[0046]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述反應(yīng)器中細(xì)胞的平均年齡較短時(shí)，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率被抑制。
[0047]雖然本發(fā)明在廣義上如上文所限定，但本發(fā)明并不限于此，還包括以下描述提供實(shí)施例所屬的實(shí)施方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0048]現(xiàn)將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其中:
[0049]圖1的曲線圖示出在高氫氣攝取量的情況下生物反應(yīng)器中2，3- 丁二醇濃度的降低。
[0050]圖2的曲線圖證明在低氫氣攝取量的情況下生物反應(yīng)器中2，3- 丁二醇濃度的增加。
[0051]圖3的曲線圖示出在高氫氣攝取量的情況下生物反應(yīng)器中2，3-丁二醇生產(chǎn)的速率降低。
[0052]圖4的曲線圖證明在低氫氣攝取量的情況下生物反應(yīng)器中2，3- 丁二醇產(chǎn)生的速率增加。
[0053]圖5的曲線圖證明氫氣攝取量的增加與2，3- 丁二醇濃度的相應(yīng)降低。
[0054]圖6的曲線圖示出在42天內(nèi)氫氣攝取量與2，3_ 丁二醇濃度之間的相關(guān)性。
[0055]圖7的曲線圖示出雙反應(yīng)器系統(tǒng)的第一反應(yīng)器中2，3-丁二醇與細(xì)胞年齡之間的相關(guān)性。
[0056]圖8的曲線圖示出在不同的細(xì)胞年齡下雙反應(yīng)器系統(tǒng)的第二反應(yīng)器中2，3-丁二醇的濃度和容積生產(chǎn)率。
【具體實(shí)施方式】
[0057]以下是以一般形式給出的對(duì)本發(fā)明的描述，包括其優(yōu)選的實(shí)施方案。進(jìn)一步在下文標(biāo)題“實(shí)施例”下給出的公開內(nèi)容——提供了支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、本發(fā)明的方面的具體實(shí)例和實(shí)施本發(fā)明的工具——中舉例說明本發(fā)明。
[0058]本文使用的“丁二醇”是指所述二醇的所有結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體，包括1，2_ 丁二醇、1，3- 丁二醇、1，4- 丁二醇和2，3- 丁二醇及其立體異構(gòu)體。術(shù)語“2，3- 丁二醇”應(yīng)解釋為包括所述化合物的所有對(duì)映體形式和非對(duì)映體形式，包括(R，R)、(S，S)和內(nèi)消旋形式、外消旋形式、部分立體異構(gòu)純形式或基本立體異構(gòu)純形式。
[0059]術(shù)語“生物反應(yīng)器”包括由一個(gè)或多個(gè)容器和/或塔或管道排列組成的發(fā)酵裝置，其包括連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器(CSTR)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器(ICR)、滴流床反應(yīng)器(TBR)、鼓泡塔、氣升式發(fā)酵罐、靜態(tài)混合器或者適合氣體-液體接觸的其他容器或其他裝置。在一些實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器可包括第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，當(dāng)提到加入底物到生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中時(shí)，如果合適，應(yīng)該理解為加入到這些反應(yīng)器之一或兩者中。
[0060]術(shù)語“底物”和類似術(shù)語應(yīng)理解為包括，例如，其中一氧化碳和/或氫氣可被一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌菌株用于生長和/或發(fā)酵任何底物。
[0061]“含一氧化碳的氣態(tài)底物”或“至少含CO的氣態(tài)底物”包括含某一水平的一氧化碳的任何氣體。所述氣態(tài)底物通常會(huì)含有大比例的CO，優(yōu)選至少約10體積％至約95體積％的CO。
[0062]“含氫氣的氣態(tài)底物”包括含有某一水平的氫氣的任何氣體。
[0063]當(dāng)與發(fā)酵過程關(guān)聯(lián)使用時(shí)，術(shù)語“增加效率”、“效率增加”及其類似術(shù)語，包括，但不限于，增加以下的一個(gè)或多個(gè):催化所述發(fā)酵的微生物的生長速率、在提高的丁二醇濃度下生長速率和/或產(chǎn)物生產(chǎn)速率、消耗每體積底物產(chǎn)生的所需產(chǎn)物的體積、所需產(chǎn)物的生產(chǎn)速率或生產(chǎn)水平以及產(chǎn)生的所需產(chǎn)物與所述發(fā)酵的其他副產(chǎn)物相比的相對(duì)比例。
[0064]“丁二醇生產(chǎn)率”或“丁二醇生產(chǎn)的速率”是丁二醇的容積生產(chǎn)率。在連續(xù)系統(tǒng)中，容積生產(chǎn)率被計(jì)算為穩(wěn)定狀態(tài)丁二醇濃度與液體滯留時(shí)間的比率。在分批系統(tǒng)中，容積生產(chǎn)率被計(jì)算為丁二醇濃度和在分批系統(tǒng)中產(chǎn)生所述濃度所需的時(shí)間。容積生產(chǎn)率被記錄為g/L/ 天。[0065]除非上下文另有需要，本文使用的詞組“發(fā)酵”、“發(fā)酵過程”或“發(fā)酵反應(yīng)”及類似詞語，意圖涵蓋所述過程的生長階段和產(chǎn)物生物合成階段。
[0066]氫氣耗盡的底物
[0067]發(fā)明人令人驚訝地表明通過自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoentanogenum)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。尤其是，發(fā)明人已確定可通過某些因素控制2，3- 丁二醇的生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，發(fā)明人已經(jīng)證明了可通過控制所述氣態(tài)底物的氫氣組成增加或降低所產(chǎn)生的2，3-丁二醇的量。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，發(fā)明人已經(jīng)證明了所述生物反應(yīng)器中微生物細(xì)胞的年齡和微生物培養(yǎng)的生長階段會(huì)影響通過所述細(xì)胞產(chǎn)生的2，3- 丁二醇的量。
[0068]已經(jīng)表明，可通過提供H2耗盡的底物來增加2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。發(fā)明人已經(jīng)證明，當(dāng)所述底物中氫氣的量有限時(shí)，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率增加。發(fā)明人確定了，當(dāng)所述氣態(tài)底物的氫氣組成為少于20體積％、少于15體積％、少于10體積％、少于5體積％或少于2體積％時(shí)，2，3- 丁二醇的產(chǎn)生增加。
[0069]還確定了 2，3- 丁二醇生產(chǎn)率和所述細(xì)菌培養(yǎng)物的氫氣攝取量之間的相關(guān)性。具體地，已經(jīng)表明，當(dāng)H2攝取量少于1000mmol/L/天、少于500mmol/L/天、少于300mmol/L/天、少于200mmol/L/天或少于100mmol/L/天時(shí),2，3-丁二醇生產(chǎn)率增加。
[0070]發(fā)明人已經(jīng)證明，當(dāng)氫氣攝取量有限時(shí)，2，3-丁二醇生產(chǎn)率為至少15g/L/天、至少20g/L/天、至少25g/L/天、至少30g/L/天、至少35g/L/天、至少40g/L/天或至少45g/L/天。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵液中2，3-丁二醇的濃度為至少28/1、至少48/1、至少68/L、至少8g/L或至少10g/L。
[0071]富含氫氣的底物
[0072]相應(yīng)地，已經(jīng)表明，增加所述氣態(tài)底物的H2組成對(duì)2，3- 丁二醇生產(chǎn)率有負(fù)面影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，2，3-丁二醇`生產(chǎn)率為少于10g/L/天、少于5g/L/天、少于3g/L/天或少于lg/L/天。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵液中2，3- 丁二醇的濃度為少于2g/L或少于lg/L或約0g/L。
[0073]利用具有增加的氫氣組成的底物進(jìn)行的發(fā)酵顯示出2，3- 丁二醇生產(chǎn)率降低。具有高于25體積％的H2、或高于30體積％的H2、或高于40體積％的H2、或高于45體積％的H2、或高于50體積％的H2的氫氣組成的底物對(duì)所述培養(yǎng)物的容積生產(chǎn)率有抑制效應(yīng)。
[0074]具體的H2攝取量增加同樣影響2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。在其中氫氣攝取量為至少2500mmol/L/ 天、至少 3000mmol/L/ 天、至少 3500mmol/L/ 天、至少 4000mnio1 /I,/ 天、至少4500mmol/L/天或至少5000mmol/L/天的培養(yǎng)物中，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率比在氫氣攝取量更低的培養(yǎng)物中低。
[0075]在本發(fā)明的第二方面中，已經(jīng)證明當(dāng)所述細(xì)菌培養(yǎng)物的生長已經(jīng)基本停止時(shí)，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率增加。發(fā)明人已經(jīng)令人吃驚地表明，培養(yǎng)物中所述細(xì)胞的年齡對(duì)所述細(xì)胞的容積生產(chǎn)率有影響。少于80小時(shí)的細(xì)胞的2，3- 丁二醇容積生產(chǎn)率明顯地低于更老的細(xì)胞的容積生產(chǎn)率。在平均細(xì)胞年齡高于90小時(shí)、或高于100小時(shí)或高于110小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)物中，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率高于6g/L/天、高于8g/L/天、高于10g/L/天、高于12g/L/天、高于14g/L/天或高于16g/L/天。
[0076]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述生物反應(yīng)器中的細(xì)胞的平均年齡較低時(shí)，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率較低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述生物反應(yīng)器中的細(xì)胞的平均年齡少于80小時(shí)、或少于60小時(shí)、或少于40小時(shí)、少于30小時(shí)、少于20小時(shí)或少于10小時(shí)時(shí)，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率較低。在一個(gè)實(shí)施方案中，2，3- 丁二醇生產(chǎn)率少于4g/L/天、少于3g/L/天、少于2g/L/天或少于lg/L/天。
[0077]此外，在具有較老細(xì)胞群的培養(yǎng)物中，2，3-丁二醇:乙醇的比率改善。在發(fā)酵過程中，已經(jīng)表明，該比率隨著培養(yǎng)物變老而改善，有利于2，3- 丁二醇生產(chǎn)。具有少于90小時(shí)的平均細(xì)胞年齡的細(xì)胞培養(yǎng)物表現(xiàn)出約1:10、或約1:15、或約1:20、或約1:25的2，3-丁二醇:乙醇比率。具有高于100小時(shí)的細(xì)胞平均年齡的細(xì)胞培養(yǎng)物表現(xiàn)出有利于2，3-丁二醇的顯著改善，比率為1:6、或約1:5、或約1:4、約1:3、約1:2或約1:1。
[0078]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用細(xì)胞保留裝置來增加所述生物反應(yīng)器中的細(xì)胞的平均年齡。細(xì)胞保留裝置在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而示例性細(xì)胞保留裝置包括錯(cuò)流膜和/或中空纖維膜。
[0079]微牛物
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種微生物選自一氧化碳營養(yǎng)產(chǎn)乙酸細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，所述微生物選自自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、揚(yáng)氏梭菌(Clostridium Ijungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、Clostridium drakei> 幾味梭菌(Clostridium scatologenes)、Clostridium coskati1、游泥丁酸桿菌(Butyribacteriumlimosum)、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、Alkalibaculum bacchi1、Blautia producta、粘液真桿菌(Eubacterium limosum)、熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏產(chǎn)醋桿菌(Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
[0081]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，用于所述發(fā)酵的一種或多種微生物為自產(chǎn)乙醇梭菌。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述自產(chǎn)乙醇梭菌為具有以鑒定保藏號(hào)19630保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(German Resource Centre for Biological Material, DSMZ)的菌株的鑒定特征的自產(chǎn)乙醇梭菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述自產(chǎn)乙醇梭菌為具有DSMZ保藏號(hào)DSMZ23693的鑒定特征的自產(chǎn)乙醇梭菌。
[0082]本發(fā)明方法中使用的細(xì)菌的培養(yǎng)可使用本領(lǐng)域知曉的任意數(shù)量的使用厭氧細(xì)菌培養(yǎng)和發(fā)酵底物的方法進(jìn)行。示例性技術(shù)在本文件“實(shí)施例”部分提供。舉例來說，可使用以下使用氣態(tài)底物進(jìn)行發(fā)酵的文章中一般性描述的那些方法:κ.T.Klasson, Μ.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy (1991).Bioreactors for synthesis gasfermentations resources.Conservation and Recycling, 5;145-165 ；K.T.Klasson, M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1991).Bioreactor design for synthesisgas fermentations.Fuel.70.605—614 ；K.T.Klasson, M.D.Ackerson, E.C.Clausen andJ.L.Gaddy(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology.14; 602-608 ；J.L.Vega, G.M.Antorrena, E.C.Clausenand J.L.Gaddy(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon MonoxideConversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793 ；J.L.Vega, E.C.Clausen and J.L.Gaddy (1989).Study of gaseous substratefermentations: Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784 ； 和 J.L.Vega, E.C.Clausen andJ.L.Gaddy (1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Resources, Conservation and Recyling.3.149-160。在含碳水化合物的底物上培養(yǎng)細(xì)菌的方法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。
[0083]底盤
[0084]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用自產(chǎn)乙醇梭菌對(duì)含碳水化合物的底物進(jìn)行微生物發(fā)酵來生產(chǎn)2，3-丁二醇。應(yīng)理解，有很多本領(lǐng)域已知的適于發(fā)酵的碳水化合物的實(shí)例，以及許多用于發(fā)酵所述碳水化合物底物的方法類型的實(shí)例。舉例來說，適合的底物可包括但不限于單糖例如葡萄糖和果糖、低聚糖例如蔗糖或乳糖、多糖例如纖維素或淀粉。雖然可預(yù)計(jì)到所有這些碳水化合物底物(及其混合物)都適用于本發(fā)明中，但優(yōu)選的碳水化合物底物為葡萄糖、果糖和蔗糖(及其混合物)。
[0085]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可發(fā)酵糖可依例如US20070031918中所述通過預(yù)處理和糖化的過程從纖維素生物質(zhì)和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)得到。生物質(zhì)是指任何纖維素或木質(zhì)纖維素材料，包括包含纖維素并任選還包含半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖和/或單糖的材料。生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘留物、都市固體廢物、工業(yè)固體廢物、來自制紙業(yè)的污泥、庭院廢物、木材和林業(yè)廢物。
[0086]然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可商購的果糖被用作所述發(fā)酵的碳源和能量來源。
[0087]在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用含一氧化碳或含一氧化碳和氫氣的底物，優(yōu)選含一氧化碳或含一氧化碳和氫氣的氣態(tài)底物。所述氣態(tài)底物優(yōu)選為廢氣，所述廢氣作為工業(yè)過程的副產(chǎn)品獲得，或獲自一些其他來源例如內(nèi)燃機(jī)(例如汽車)廢氣。在某些實(shí)施方案中，所述工業(yè)過程選自鐵金屬產(chǎn)品制`造例如鋼鐵廠、有色金屬產(chǎn)品制造、石油精煉過程、煤炭氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)和焦炭制造。在這些實(shí)施方案中，可使用任何合適的方法，在所述底物被排放到大氣之前將其從所述工業(yè)過程中捕獲。取決于所述氣態(tài)底物的組成，還可能需要在將其引入所述發(fā)酵之前，對(duì)其進(jìn)行處理以去除任何不需要的雜質(zhì)，例如塵粒。例如，可利用已知方法過濾或洗滌所述氣態(tài)底物。
[0088]在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所述氣態(tài)底物可來自生物質(zhì)的氣化。所述氣化過程涉及生物質(zhì)在限制供應(yīng)的空氣或氧氣中部分燃燒。所得的氣體一般主要包含CO和H2,以及微量體積的C02、甲烷、乙烯和乙烷。例如，可將在糧食的提取和加工過程得到的生物質(zhì)副產(chǎn)品(如從甘蔗中得到糖、從玉米或谷物中得到淀粉)或由林業(yè)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生的非食物生物質(zhì)廢物氣化，以產(chǎn)生適用于本發(fā)明的含CO氣體。
[0089]所述底物一般含有大比例的CO，例如至少約20體積％到約100體積％的C0、40體積％到95體積％的C0、40體積％到60體積％的CO和45體積％到55體積％的CO。在具體實(shí)施方案中，所述底物含有約25體積％、或約30體積％、或約體積35%、或約40體積％、或約45體積％、或約50體積％的CO，或約55體積％的CO、或約60體積％的CO。含有更低濃度(例如6%)的CO的底物，也可以是合適的，尤其是當(dāng)H2和CO2也存在時(shí)。
[0090]在具體實(shí)施方案中，CO以足夠發(fā)生2，3- 丁二醇生產(chǎn)的水平提供。在具體實(shí)施方案中，提供CO使具體的攝取速率維持在至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少 0.Bmmol /g/min、或至少 0.7mmo1 /g/min、或至少 0.8mmo1 /g/min、或至少 0.Qmmol /g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解供應(yīng)CO特別是氣態(tài)CO以達(dá)到所需的攝取速率的方法。然而，舉例來說，一些因素例如增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的氣體滯留(gas hol-up)會(huì)增加可被所述微生物培養(yǎng)物用于轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的CO的量。此外，以更快的速率或更高的分壓供應(yīng)CO也會(huì)增加發(fā)酵液中的CO可用性。
[0091]為了改善2，3-丁二醇發(fā)酵的效率，所述底物一般含有小比例的H2，例如少于20體積％的H2、少于15體積％的H2、少于10體積％的H2、少于5體積％的H2、少于2體積％的H2或基本上沒有H2。
[0092]已經(jīng)證明，過量的H2對(duì)2，3- 丁二醇生產(chǎn)率有抑制作用。已經(jīng)表明，H2攝取量高于 0.10mmol/g/min、或高于 0.llmmol/g/min、或高于 0.12mmol/g/min、或高于 0.1 Smmol /g/min會(huì)抑制2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。
[0093]在具體實(shí)施方案中，以耗盡的水平供應(yīng)H2以提高2，3- 丁二醇生產(chǎn)率。在具體實(shí)施方案中，供應(yīng)H2使具體攝取速率為少于0.09mmol/g/min、或少于0.08mmol/g/min、或少于 0.07mmol/g/min、或少于 0.05mmol/g/min、或少于 0.01 mmol/g/min η
[0094]所述氣態(tài)底物還可含有一些CO2，例如約I體積％到約80體積％，或I體積％到約30體積％。在一個(gè)實(shí)施方案中,其含有約5體積％到約10體積％。在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述氣態(tài)底物含有約20體積％的CO2。
[0095]一般地，將所述一氧化碳以氣態(tài)加入到所述發(fā)酵反應(yīng)中。但是，不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明受限于以該狀態(tài)加入所述底物。例如，所述一氧化碳可以以液體提供。例如，可用含有一氧化碳的氣體使液體飽和，然后將該液體加入到生物反應(yīng)器中。這可用標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)。舉例來說，可以使用微氣泡 分散發(fā)生器(Hensirisak et.al.Scale-up of microbubbledispersion generator for aerobic fermentation;Applied Biochemistry andBiotechnology VolumelOl, Number3/0ctober,2002)。
[0096]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明人已經(jīng)確定，可通過發(fā)酵第一底物和第二底物生產(chǎn)2，3-丁二醇。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)提供第一底物(優(yōu)選碳水化合物，更優(yōu)選果糖)和第二底物(優(yōu)選含CO的底物)時(shí)，將產(chǎn)生2，3- 丁二醇。
[0097]在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明人已經(jīng)確定，可通過第一底物產(chǎn)生2，3- 丁二醇，并且當(dāng)所述第一底物被完全消耗時(shí)，可將所述第一底物用第二底物代替，繼續(xù)產(chǎn)生2，3- 丁二醇。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一底物為果糖，并且當(dāng)所述果糖被完全消耗時(shí)，可提供含CO的底物。發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，2，3-丁二醇仍繼續(xù)產(chǎn)生。發(fā)明人還考慮，如果需要，可交替所述第一底物和第二底物。例如，如果第一底物不可用，可使用變換的底物，直至所述第一底物的可用性改善。
[0098]:1--養(yǎng)基
[0099]應(yīng)理解，為了發(fā)生細(xì)菌生長和底物到丁二醇的發(fā)酵，除了所述底物外，需要向所述生物反應(yīng)器進(jìn)料合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基。營養(yǎng)培養(yǎng)基會(huì)含有足以使所用的微生物生長的組分，例如維生素和礦物質(zhì)。適于自產(chǎn)乙醇梭菌生長的厭氧培養(yǎng)基在本領(lǐng)域是已知的，如例如 Abrini 等所描述(Clostridium autoethanogenum, sp.Nov., An Anaerobic BacteriumThat Produces Ethanol From Carbon Monoxide;Arch.Microbiol., 161:345-351(1994))。下文“實(shí)施例”部分提供了合適的培養(yǎng)基的其他實(shí)例。
[0100]發(fā)酵條件
[0101]為了發(fā)生所述底物到丁二醇的發(fā)酵，所述發(fā)酵應(yīng)需要在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行。應(yīng)考慮的反應(yīng)條件包括溫度、培養(yǎng)基流速、pH、培養(yǎng)基氧化還原電勢(shì)、攪拌速率(如果使用連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器)、接種物水平、確保底物水平不成為限制而將所述底物引入所述反應(yīng)器的最大底物濃度和速率、以及為避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
[0102]發(fā)明人已經(jīng)確定，在一個(gè)未控制pH的實(shí)施方案中，未出現(xiàn)對(duì)2，3- 丁二醇產(chǎn)生的有
吾影響。
[0103]生物反應(yīng)器
[0104]發(fā)酵反應(yīng)可在如上文所述的任何合適的生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器可包括在其中培養(yǎng)所述微生物的第一生長反應(yīng)器，和向其中進(jìn)料來自所述生長反應(yīng)器的發(fā)酵液并在其中產(chǎn)生大部分發(fā)酵產(chǎn)物(例如2，3- 丁二醇)的第二發(fā)酵反應(yīng)器。
[0105]細(xì)胞保留裝置
[0106]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述生物反應(yīng)器被配置為能夠積累細(xì)胞，從而增加所述反應(yīng)器中所述細(xì)胞的平均年齡。細(xì)胞保留裝置在本領(lǐng)域是眾所周知的，而示例性細(xì)胞保留裝置包括錯(cuò)流膜和/或中空纖維膜。
[0107]產(chǎn)物回收
[0108]所述發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生在營養(yǎng)培養(yǎng)基中含有所需產(chǎn)物(例如丁二醇)和/或一種或多種副產(chǎn)物(例如乙醇、乙酸、丁酸)以及細(xì)菌細(xì)胞的發(fā)酵液。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物包括 2，3-丁二醇。
[0109]可通過本領(lǐng)域已知的方法，例如分餾或蒸發(fā)、全蒸發(fā)和萃取發(fā)酵從所述發(fā)酵液回收2，3- 丁二醇或者含有2，3- 丁二醇和一種或多種其他醇的混合醇流。也可使用本領(lǐng)域中已知的方法從所述發(fā)酵液中回收副產(chǎn)物例如酸，包括乙酸和丁酸。例如，可使用包括活性炭過濾器或電滲析的吸附系統(tǒng)。
[0110]在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過以下方式從所述發(fā)酵液回收2，3-丁二醇和副產(chǎn)物:將一部分所述發(fā)酵液從所述生物反應(yīng)器連續(xù)移出，從所述發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞(例如，通過過濾方便地)，以及從所述發(fā)酵液回收2，3-丁二醇和任選的其他醇和酸。醇可通過例如蒸餾而方便地回收，酸可通過例如吸附在活性炭上而回收。將所分離的微生物細(xì)胞優(yōu)選返回到所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中。還優(yōu)選將去除所述一種或多種醇和一種或多種酸后剩下的無細(xì)胞滲透液返回到所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中?？蓪⒘硗獾臓I養(yǎng)素(例如B族維生素)加入到所述無細(xì)胞滲透液中以補(bǔ)充所述營養(yǎng)培養(yǎng)基，然后將其返回至所述生物反應(yīng)器。
[0111]并且，如果在回收2，3- 丁二醇和/或副產(chǎn)物的過程中調(diào)整了所述發(fā)酵液的pH，那么應(yīng)將pH重新調(diào)整至與所述發(fā)酵生物反應(yīng)器中的發(fā)酵液的pH相似，然后再將其返回至所述生物反應(yīng)器。
[0112]現(xiàn)將參考以下非限制性實(shí)施例，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0113]實(shí)施例
[0114]實(shí)施例1
[0115]材料和方法
【權(quán)利要求】
1.一種控制通過微生物發(fā)酵至少含CO和H2的底物的2，3- 丁二醇生產(chǎn)速率的方法，所述方法包括: a.將所述底物傳送至包含至少一種一氧化碳營養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)物生物反應(yīng)器中，厭氧發(fā)酵所述至少含CO和H2的底物，以產(chǎn)生2，3- 丁二醇和至少一種副產(chǎn)物；和 b.控制所述底物中的氫氣濃度，控制2，3-丁二醇的產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述副產(chǎn)物選自醇、酸及其混合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述醇是乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中將所述底物中的氫氣濃度限制為少于20%的H2而增加2，3- 丁二醇的生產(chǎn)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中將所述底物中的氫氣濃度維持為高于20%的H2而降低2，3- 丁二醇的生產(chǎn)量。
6.權(quán)利要求4的方法，其中2，3-丁二醇的生產(chǎn)量為至少15g/L/天。
7.權(quán)利要求6的方法，其中2，3-丁二醇的生產(chǎn)量是至少30g/L/天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其中所述一氧化碳營養(yǎng)細(xì)菌選自自產(chǎn)乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、揚(yáng)氏梭菌(Clostridium Ijungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium rag sdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、Clostridium drake1、幾B未梭菌(Clostridium scatologenes)、Clostridium coskati1、派泥丁 酸桿菌(Butyribacterium limosum)、甲基營養(yǎng)丁酸桿菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)> Alkalibaculum bacchi1、Blautia producta、粘液真桿菌(Eubacterium limosum)、熱醋穆爾氏菌(Moorellathermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏產(chǎn)醋桿菌(Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)?
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述一氧化碳營養(yǎng)細(xì)菌是自產(chǎn)乙醇梭菌。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述一氧化碳營養(yǎng)細(xì)菌為以登記號(hào)DSM23693保藏于德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)的自產(chǎn)乙醇梭菌菌株。
11.權(quán)利要求4的方法，其中所述氫氣組成為少于5體積％的H2。
12.權(quán)利要求4的方法，其中提供所述底物使得維持所述培養(yǎng)物的具體氫氣攝取速率為少于0.09mmol H2/克細(xì)菌細(xì)胞干量/分鐘。
13.權(quán)利要求12的方法，其中維持所述培養(yǎng)物的具體氫氣攝取速率為少于0.05mmolH2/克細(xì)菌細(xì)胞干重/分鐘。
14.權(quán)利要求12的方法，其中維持所述培養(yǎng)物的具體氫氣攝取速率為少于0.01mmolH2/克細(xì)菌細(xì)胞干重/分鐘。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物反應(yīng)器還包括細(xì)菌細(xì)胞保留裝置，從而增加所述細(xì)胞的平均年齡并增加2，3- 丁二醇的生產(chǎn)量。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞保留裝置選自錯(cuò)流膜和中空纖維膜。
17.權(quán)利要求5的方法，其中提供所述底物使得維持所述培養(yǎng)物的具體氫氣攝取速率為高于0.1Ommol H2/克細(xì)菌細(xì)胞干重/分鐘。
【文檔編號(hào)】C12P7/16GK103582703SQ201280026205
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月31日
【發(fā)明者】S·D·辛普森, C·科利特, C·D·米哈爾西, J·J·科諾利, G·W·沃特斯 申請(qǐng)人:新西蘭郎澤科技公司