裂殖壺菌誘變方法及其產(chǎn)生的變異株的制作方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝诵碌牧阎硥鼐儺愔?。具體而言，本申請?zhí)峁┝司哂蠨HA含量提高和/或生長速度加快的性質(zhì)的新的裂殖壺菌變異株，以及利用該菌株生產(chǎn)DHA的方法。此外，本申請?zhí)峁┝水a(chǎn)生本申請的新的裂殖壺菌變異株的方法，包括使裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射從而誘導(dǎo)菌株的誘變，以及在脂肪合成關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑(例如喹禾靈)的選擇壓力下，篩選通過紫外線誘變獲得的菌株中比天然裂殖壺菌菌株生長速度加快和DHA含量提高的株系。
【專利說明】裂殖壺菌誘變方法及其產(chǎn)生的變異株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及微生物遺傳育種技術(shù)和生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及用于生產(chǎn)DHA(二十二碳六烯酸)的微藻的變異株或突變株。
【背景技術(shù)】
[0002]DHA(二十二碳六烯酸，C22:6, ω-3)是一種必需脂肪酸，即人體不能自身合成且具有重要生理功能的長鏈脂肪酸。DHA是人的大腦和視網(wǎng)膜的主要組成成分。總DHA中的20%存在于大腦皮層中，總DHA中的高達(dá)50%存在于視網(wǎng)膜中。因此，DHA對神經(jīng)系統(tǒng)和視覺系統(tǒng)的發(fā)育和維持正常智力和視力功能中起重要作用。DHA還在預(yù)防心血管疾病、癌癥、炎癥等中具有重要的生理功能。另外，DHA還是多種海水魚類生長發(fā)育所需的必需脂肪酸，并且可以提高魚苗的成活率以及降低白化病發(fā)病率。傳統(tǒng)上DHA從魚油中獲得，但從魚油中提取多不飽和脂肪酸(PUFA)存在一些問題，例如產(chǎn)量不穩(wěn)定、得率低、成本高及存在其它《-6PUFA的污染，且隨著漁業(yè)資源的日益緊張，傳統(tǒng)的DHA資源已無法滿足DHA日益增長的市場需求。因此，開發(fā)DHA的新資源已成為新的研究熱點。
[0003]裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)是一種海洋微藻(或真菌樣微生物)，其已經(jīng)開發(fā)為生產(chǎn)DHA和其他多不飽和脂肪酸(PUFA)的商業(yè)資源。裂殖壺菌的生物安全性已被證實。Hammond等人在大鼠和兔子上對其進(jìn)行了一系列檢測，沒有發(fā)現(xiàn)副作用。
[0004]但是，在發(fā)酵過程中，裂殖壺菌難免發(fā)生菌株種質(zhì)退化，從而導(dǎo)致DHA產(chǎn)率下降。因此，繼續(xù)改進(jìn)菌株種質(zhì)(主要包括生長速度，尤其是DHA含量)對于促進(jìn)裂殖壺菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展是重要的。
[0005]乙酰輔A羧化酶(`ACC，EC6.4.1.2)是一種脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，而除草劑喹禾靈{2-[4-(6-氯-2-喹惡啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯}是該酶的抑制劑。在喹禾靈的存在下，細(xì)胞會因脂肪酸生物合成受阻而生長緩慢甚至死亡。
[0006]近年來，一些研究表明，喹禾靈能夠用于篩選誘變的微藻中EPA含量提高的株系。
[0007]Chaturvedi 等(2004)用 MNNG 對微綠球藻(Nannochloropsis oculata)進(jìn)行誘變，再篩選抗喹禾靈的株系。從篩選得到的株系獲得的結(jié)果表明EPA含量顯著提高。
[0008]此外，Chaturvedi等(2006)用EMS對微綠球藻進(jìn)行誘變，再篩選抗淺藍(lán)菌素及紅霉素的株系。得到的株系的EPA產(chǎn)率分別提高了 29%和12%。
[0009]Cao Xiaohong等(2007)用DMSO和喹禾靈處理娃藻平滑菱形藻(NitzschiaIaevis)，導(dǎo)致藻的EPA含量從3.00%提高到3.58%。
[0010]到目前為止，還沒有報道抗喹禾靈的裂殖壺菌突變株。即使存在這樣的裂殖壺菌突變株，也不清楚經(jīng)喹禾靈篩選后的突變株的EPA或DHA的含量是否得到提高。此外，到目前為止，并不清楚經(jīng)紫外線輻射誘導(dǎo)的裂殖壺菌突變株是否能夠在喹禾靈篩選中存活。
[0011]發(fā)明概述
[0012]本申請的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過向裂殖壺菌實施紫外線輻射誘變、然后利用脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶(例如乙酰輔酶A羧化酶)的抑制劑(包括但不限于喹禾靈(Quizalofop))進(jìn)行定向篩選，能夠得到DHA含量增加的裂殖壺菌變異株或突變株。此外，與天然裂殖壺菌菌株相比，所獲得的變異株或突變株具有高DHA含量以及提高的生長速度。
[0013]因此，第一方面，本申請?zhí)峁┊a(chǎn)生與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壺菌變異株的方法，包括利用紫外線(UV)照射誘導(dǎo)裂殖壺菌突變從而產(chǎn)生突變株；使所述突變株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸；以及選擇與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量的裂殖壺菌突變株。
[0014]在本文公開的一個實施方案中，乙酰輔酶A羧化酶抑制劑是喹禾靈。在具體實施方案中，與天然裂殖壺菌菌株相比，所選擇到的DHA含量增加的變異株還具有加快的生長速度，從而使得DHA的生產(chǎn)效率較天然裂殖壺菌菌株得以提高。
[0015]在本文公開的另一實施方案中，相比于裂殖壺菌突變株的起始菌株或天然裂殖壺菌菌株，所述裂殖壺菌突變株的DHA含量提高。通常，相比于經(jīng)過UV輻射誘導(dǎo)的誘變、進(jìn)行或不進(jìn)行乙酰輔酶A羧化酶抑制劑篩選的裂殖壺菌突變株的起始菌株或天然裂殖壺菌菌株，所述裂殖壺菌突變株的DHA含量提高。
[0016]在第二方面，本申請?zhí)峁┝阎硥鼐儺愔?，例如?011年I月21日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)、保藏號為CCTCC M2011024的裂殖壺菌菌株2010-0321。
[0017]在一個實施方案中，與天然裂殖壺菌菌株相比，本文提供的變異株具有增加的DHA含量。在另一實施方案中，本文提供的變異株是通過本文公開的方法獲得的，該方法包括利用紫外線(UV)照射誘導(dǎo)裂殖壺菌突變從而產(chǎn)生突變株；使所述突變株與乙酰輔酶A羧化酶的抑制劑接觸；以及選擇與天然裂殖壺菌菌株相比具有增加的DHA含量和/或加快的生長速度的裂殖壺菌變異株。
[0018]在第三方面，本申 請?zhí)峁┥a(chǎn)DHA的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文公開的裂殖壺菌變異株，以及任選地包括從培養(yǎng)的裂殖壺菌變異株或其培養(yǎng)基的生物質(zhì)中收集DHA。在一個實施方案中，還涉及由此方法產(chǎn)生的生物質(zhì)。
[0019]在另一方面，本申請?zhí)峁┦称?。具體而言，所述食品含有根據(jù)本文公開的方法生產(chǎn)的生物質(zhì)(即，與天然裂殖壺菌菌株相比，具有增加的DHA濃度)或DHA。
[0020]附圖簡要說明
[0021]圖1顯示紫外線輻射對裂殖壺菌的致死作用。
[0022]圖2顯示喹禾靈濃度與裂殖壺菌的相應(yīng)致死率的關(guān)系。
[0023]圖3顯示對照菌株(或天然菌株)和一些變異株的生長速度和DHA含量。
[0024]圖4顯示對照菌株和3個變異株在50L發(fā)酵實驗中的生長速度和DHA含量。
[0025]圖5顯示對照菌株與變異株2010-0321的18S rRNA序列的比對結(jié)果。
[0026]發(fā)明詳細(xì)描述
[0027]本文所使用的術(shù)語“菌株”指從單一細(xì)胞或分離菌落獲得的微生物的任何培養(yǎng)物，通常為純的培養(yǎng)物，微生物例如是藻或微藻，包括裂殖壺菌。
[0028]本文所使用的術(shù)語參照菌株X的“變異株”或“突變株”指從參照菌株X得到的任何菌株。在本申請的語境中，術(shù)語“變異株”更特別地指主要通過對參照菌株X進(jìn)行突變和選擇而得到的菌株，而術(shù)語“突變株”更特別的指通過將隨機或定向誘變技術(shù)應(yīng)用于參照菌株X而得到的菌株。[0029]一旦突變株或變異株具有本文公開的各個方面的特征，尤其是與天然藻類或微藻類(特別是裂殖壺菌)相比具有更高的或增加的DHA含量時，其落入本申請請求保護(hù)的保護(hù)范圍中。
[0030]本文所使用的術(shù)語“食品”指用于向人類或動物提供營養(yǎng)的任何產(chǎn)品。具體而言，食品包括用于喂養(yǎng)嬰兒、兒童、青少年和成人的產(chǎn)品。本文公開的食品的全部或部分可以含有通過本文公開的方法獲得的至少一種生物質(zhì)或DHA。本文公開的食品也可以含有通常用于農(nóng)業(yè)或食品工業(yè)的其他成分，如添加劑、防腐劑、果類或果類提取物、調(diào)味劑、著色劑、增稠劑、谷類、巧克力等。
[0031]在具體的實施方案中，食品是乳制品。
[0032]本文所用術(shù)語“乳制品”，除了奶之外，還包括源自奶的任何產(chǎn)品，如奶粉、乳酪、冰淇淋、黃油、乳酪、酸奶、發(fā)酵奶；或源自奶的副產(chǎn)物，如抗乳血清和酪蛋白以及各種含有奶或奶組分作為主要成分的制備食品。奶通常來自奶牛，但是也可以來自其他哺乳動物，如山羊、母綿羊、母馬、駱駝或水牛。這些乳制品合并了通過本文公開的方法生產(chǎn)的DHA或生物質(zhì)。
[0033]適于作為本文公開的突變/誘變和/或篩選的起始菌株或天然/對照菌株包括異養(yǎng)的微藻類，包括裂殖壺菌屬的成員。裂殖壺菌屬的一個具體成員是Schizochytrium limacinum?？蓮脑S多公開可利用的來源獲得合適的生物，包括通過從自然環(huán)境收集。例如，可用于本申請的裂殖壺菌的包括Schizochytrium limacinumSR21、裂殖壺菌(S8) (ATCC20889)、裂殖壺菌(LC-RM) (ATCC18915)和 Schizochytriumlimacinum IF032693 (Honda et Yokochi,日本大阪微生物研究所(Institute forFermentation (IFO).0saka, Japan), 優(yōu)選 Schizochytrium limacinum SR21 或Schizochytrium limacinum IF032693。
[0034]本文所用的任何微生物或生物體的任何具體類型包括野生型菌株、突變株或重組株。
`[0035]本文所用的術(shù)語“生物質(zhì)”指藻類或微藻類(例如本文公開的裂殖壺菌或裂殖壺菌變異株等)的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物或細(xì)胞?；蛘撸g(shù)語“生物質(zhì)”指至少部分脫水的藻類或微藻類培養(yǎng)物、或脫水的培養(yǎng)物。
[0036]本文所用的術(shù)語“約”或“大致”，當(dāng)與數(shù)值一同使用時，指相比于參照數(shù)值變化1、5或10%以內(nèi)的任何數(shù)值。
[0037]本文所用的動詞“包含”及其變形詞以非限制性含義使用，表示后面的事項是包括在內(nèi)的，但是并不排除其他未具體提到的事項。
[0038]此外，使用不定冠詞“a”或“an”描述元件時，并不排除存在多個元件的可能性，除非上下文明確指示或暗示相反的情況。因此，不定冠詞“a”或“an”表示“至少一個”。
[0039]在裂殖壺菌突變的實施方案中，將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射約10秒-140秒(S)，優(yōu)選約20秒-120秒，更優(yōu)選約30秒至100秒，最優(yōu)選約70秒至90秒。在具體實施方案中，將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射的時間選自約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和90秒。收集活存的菌落并用于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑(例如喹禾靈)的定向篩選。
[0040]在一個實施方案中，將喹禾靈以一定濃度加入到培養(yǎng)基中來篩選喹禾靈抗性株。在篩選中使用的培養(yǎng)基中喹禾靈的濃度為約5 μ mol/L至約100 μ mol/L,或約10 μ mol/L至90 μ mol/L,或約50 μ mol/L至80 μ mol/L。在一個具體的實施方案中，培養(yǎng)基中喹禾靈的濃度選自約 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79和80 μ mol/L培養(yǎng)基。在一個具體實施方案中，喹禾靈的分子式為喹禾靈-p {(R)-2-[4-(6-氯-2-喹嚼啉)氧基]苯氧基]丙烯酸酯},例如精喹禾靈(Quizalofopethyl)。
[0041]在一個具體實施方案中，喹禾靈抗性裂殖壺菌菌落的篩選在含有喹禾靈的固體培養(yǎng)基中實施，然后從該固體培養(yǎng)基中挑選存活的菌落，并將其進(jìn)一步培養(yǎng)在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中，以驗證該菌落具有喹禾靈抗性。
[0042]按照與天然菌株(例如裂殖壺菌菌株)相比具有加快的生長速度和增高的DHA含量，進(jìn)一步篩選所選擇的抗喹禾靈的菌落。
[0043]由此，通過包括UV暴露和喹禾靈篩選的本文公開的方法獲得的裂殖壺菌變異株與天然裂殖壺菌菌株或起始裂殖壺菌菌株相比，可以產(chǎn)生的DHA的量較高或增加。在具體實施方案中，在3-7天或5天的培養(yǎng)物或生物質(zhì)中，裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量高于天然菌株或起始菌株至少約 10、20、25、30、35、40%，或至少約 20、25、30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70%ο在一個實施方案中，基于裂殖壺菌變異株的生物質(zhì)干重，裂殖壺菌變異株產(chǎn)生DHA的量為至少 1.0% (w/w)，2.0% (w/w)，3.0% (w/w)，3.5% (w/w)，4.0% (w/w)，4.5% (w/w)，5.0% (w/w)，5.5% (w/w)，6.0% (w/w)或 6.5% (w/w)。
[0044]在另一實施方案中，優(yōu)選在3-7天的培養(yǎng)、更優(yōu)選在5天的培養(yǎng)中，所篩選的裂殖壺菌變異株的生長速度高于天然菌株或起始菌株至少約3、4、5、6、7、8、9、10%。
`[0045]在本申請的其他實施方案中，與天然菌株或起始菌株相比，所篩選的裂殖壺菌變異株在不同的培養(yǎng)條件下(例如不同的葡萄糖濃度、不同的氮源以及不同的PH值)具有穩(wěn)定的生長速度和大量產(chǎn)生DHA的能力。
[0046]在任選的實施方案中，可以對裂殖壺菌變異株的18S RNA進(jìn)行分析，以鑒定相對于天然菌株或起始菌株的遺傳變異。
[0047]在一個實施方案中，裂殖壺菌變異株的例子包括但不限于菌株321-1、2010_0321和303-11，特別是菌株2010-0321。
[0048]在一個實施方案中，為了生產(chǎn)具有較大量DHA的生物質(zhì)，將本文公開的裂殖壺菌變異株在適合裂殖壺菌培養(yǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，特別是選自菌株321-1、2010-0321、303-11的菌株，或它們的任意組合，或者菌株2010-0321。
[0049]在本文公開的實施方案中，培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域公知的培養(yǎng)方法來制定，包括在美國專利5，130，242和美國專利7，022，512公開的方法(將其全部以引用的方式并入本文)，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定最佳培養(yǎng)條件。在其它實施方案中，可以在任何適合的發(fā)酵罐(例如提供氧來源的攪拌釜發(fā)酵罐或氣升式發(fā)酵罐)中進(jìn)行培養(yǎng)?？梢砸砸欢ǖ乃綌嚢栉⑸?，使得溶解氧的濃度足夠支持培養(yǎng)物生長和DHA產(chǎn)生，同時，攪拌不剪切或以其它方式損害微生物。溶解氧的合適的水平為至少10%的空氣飽和水平。更特別地，將溶解氧水平保持在大約10%至約50%的空氣飽和水平。本文公開的方法中所用的示例性的發(fā)酵罐可以提供IVVM通氣比率，轉(zhuǎn)速為70-100rpm。[0050]在一個實施方案中，發(fā)酵罐的容量為至少10至60升，例如10、20、30、40、50或60
升。也可以使用容量高至100或150升的發(fā)酵罐。
[0051]可以在任何適于維持微生物存活的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。具體而言，可在約15°C至約34°C溫度下培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地，將培養(yǎng)溫度保持在約20°C至約28°C，更優(yōu)選約22°C至約27 V。
[0052]在一個實施方案中，發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基的pH可以為4-10,例如5-8,優(yōu)選6-7。
[0053]通常，發(fā)酵持續(xù)10天或更少，或9天或更少，或8天或更少。在一些實施方案中，發(fā)酵持續(xù)時間可以是4、5、6或7天或至少4、5、6或7天。
[0054]任選地，發(fā)酵持續(xù)時間可以為150-200小時，例如，160-190小時，或170-180小時。
[0055]在一些實施方案中，本文公開的培養(yǎng)裂殖壺菌變異株的方法中使用的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，其可以包含在商業(yè)操作規(guī)模上能促進(jìn)生長和DHA產(chǎn)生的組分，包括美國專利5，130, 242和美國專利7，022，512中列出的組分，通過引用的方式將上述文獻(xiàn)整體并入本文。
[0056]具體而言,本文公開的用于培養(yǎng)裂殖壺菌變異株以生產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基包含碳源和有機或無機氮源。
[0057]在一實施方案中，碳源包括葡萄糖、各種淀粉、糖蜜、粉碎的玉米或其組合。在一實施方案中，氮源可以包括但不限于硝酸鹽、尿素、銨鹽、氨基酸、酵母浸膏等。培養(yǎng)基中還可以提供可同化的磷源(例如，磷酸鹽)和/或硫源(例如，硫酸鹽)。
[0058]培養(yǎng)基還可以含有其它的輔助發(fā)酵的物質(zhì)，例如螯合劑(例如檸檬酸)，抗發(fā)泡劑(例如大豆油)，維生素(例如硫胺和/或核黃素)，以及必需的催化金屬(例如堿土金屬，例如鎂或鈣，或鋅或鐵和/或諸如銅`和鈷的其他金屬)。
[0059]在另一實施方案中，培養(yǎng)基還可以含有微生物生長因子，其是未規(guī)定的或規(guī)定的能增強單細(xì)胞微生物的異養(yǎng)生長的化合物。
[0060]用于培養(yǎng)裂殖壺菌的不例性培養(yǎng)基可以參見Jiang and Chen, Process Biochemistry35 (2000) 1205-1209;Jiang and Chen, Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology, (1999)Vol.23, 508-513;Vazhappilly and Chen,Journal of the American OilChemists Society, (1998)Vol.75，N0.3p393_397。
[0061]作為一個例子,本文公開的方法中使用的培養(yǎng)基包含:葡萄糖40_60g/L ;酵母浸膏 10-15g/L ;谷氨酸 4-8g/L ;氯化鈉 2.4-4.0g/L ;硫酸鎂 3.0-6.0g/L ;硫酸銨 3.0-6.0g/L0在一實施方案中，本文公開的方法中使用的培養(yǎng)基由以下組成:葡萄糖40-60g/L ;酵母浸膏10-15g/L ;谷氨酸鈉4-8g/L ;氯化鈉2.4-4.0g/L ;硫酸鎂3.0-6.0g/L ；以及硫酸銨
3.0-6.0g/Lo本文中使用的培養(yǎng)基的一個實例由以下組成:葡萄糖60g/L ;酵母浸膏15g/L ；谷氨酸鈉4g/L ;氯化鈉3g/L ;硫酸鎂5g/L ;以及硫酸銨5g/L。
[0062]可以通過例如離心、絮凝或過濾的手段來收獲生物體或生物質(zhì)，并可立即處理或干燥用于以后處理。任選地，可以提取脂質(zhì)。本文中使用的術(shù)語“脂質(zhì)”包括磷脂、游離脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰甘油、二?；视王ァ熙；视王ァ⑷苎字⒅舅猁}、磷脂、固醇和固醇酯、類胡蘿卡素、葉黃素(例如，氧合類胡蘿素)、碳?xì)浠衔?、以及本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他脂質(zhì)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的，本文公開的DHA可為這些不同脂質(zhì)的形式，并且不限于游離的脂肪酸，其可以是本文公開的食品中的形式。根據(jù)使用的提取技術(shù)，可提取脂質(zhì)的不同形式或組分。
[0063]可用有效量的溶劑提取脂質(zhì)。在提取中所用的合適的溶劑中，通常用極性溶劑(例如，氯仿/甲醇)提取極性脂質(zhì)(例如，磷脂)，通常用非極性溶劑(例如，己烷)提取中性脂質(zhì)(例如，三酰甘油)。具體的溶劑可以為純己烷。己烷與干生物質(zhì)的合適的比例為大約4升己烷/千克干生物質(zhì)。在具體實施方案中，將己烷與生物質(zhì)在攪拌反應(yīng)容器中、在大約50°C的溫度下、混合大約2小時。混合后，將生物質(zhì)過濾并與含油的己烷分離。通過蒸餾技術(shù)從油中移除己烷。常規(guī)的含油種子加工設(shè)備適合用于實施過濾、分離和蒸餾。如果需要或適合于具體應(yīng)用，可進(jìn)行額外的加工步驟。脂質(zhì)回收的可選方法描述在下列文獻(xiàn)中，將這些文獻(xiàn)通過引用整體并入本文:發(fā)明名稱為“Method for the Fractionation of Oil andPolar Lipid-Containing Native Raw Materials” 的 PCT 國際申請公開 WO 01/76715 ;發(fā)明名稱為“Method For The Fractionation Of Oil And Polar Lipid-Containing NativeRaw Materials Using Alcohol And Centrifugation” 的 PCT 國際申請公開 W001/76385 ;發(fā)明名稱為 “Solventless Extraction Process” 的 PCT 國際申請公開 W000/153512。
[0064]雖然利用具體的生物和方法描述了本申請，但是意圖包括根據(jù)本文的教導(dǎo)可獲得的所有生物和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的范圍和實質(zhì)的情況下，能夠任何替換、修改和優(yōu)化。而且，本文所涉及的諸如步驟、條件以及菌株等要素可根據(jù)需要任意組合，從而實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0065]提供以下實施例僅僅出于示例性說明的目的，并不意圖限制所要求保護(hù)的主題的范圍。
實施例
[0066]實施例1紫外線輻射對裂殖壺菌的突變作用
[0067]Schizochytrium limacinum SR21在以下實施例中被用作對照或天然菌株。將Schizochytrium limacinum SR21接種于培養(yǎng)皿上,分別暴露于紫外線福射O秒(對照)、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒、90秒和100秒(實驗組)。輻射后，將培養(yǎng)皿避光放置24h，對每個培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。對照組的菌落數(shù)定義為100%，相應(yīng)地計算各實驗組的致死率(圖1)。從圖1可以看出，隨著輻射時間的延長，裂殖壺菌的致死率隨之增高，顯示出劑量依賴效應(yīng)。具體地，選用70秒-90秒的輻射時間(裂殖壺菌的致死率為60%-80%)在裂殖壺菌中進(jìn)行誘變。
[0068]所用培養(yǎng)條件為:
[0069]A培養(yǎng)基組成如下:
[0070]葡萄糖55g/L
[0071]酵母浸膏10g/L
[0072]谷氨酸鈉5g/L
[0073]氯化鈉2.4g/L
[0074]硫酸鎂4.0g/L
[0075]硫酸銨4.0g/L
[0076]余量為水。
[0077]B培養(yǎng)溫度:22-27°C ；以及[0078]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0079]實施例2對裂殖壺菌的喹禾靈篩選
[0080]在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入精喹禾靈，添加濃度分別為O μ mol/L、10 μ mol/L、30 μ mol/L、50 μ mol/L、70 μ mol/L、80 μ mol/L 和 90 μ mol/L。將對照組(O μ mol/L)的菌落數(shù)定義為100%。對各組菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)，基于對照組中的菌落數(shù)計算致死率(圖2)。從圖2可以看出，在實驗范圍內(nèi)，裂殖壺菌的致死率與喹禾靈的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。選用50 μ mol/L到80 μ mol/L的喹禾靈濃度進(jìn)行抗性菌株篩選。
[0081]為方便操作，在培養(yǎng)基中添加喹禾靈，接種在紫外線輻射中存活的菌株以進(jìn)行進(jìn)一步定向篩選。
[0082]所篩選出的菌株可在含有喹禾靈的液體或半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)以確認(rèn)其具有喹禾靈抗性。
[0083]培養(yǎng)條件為:
[0084]A培養(yǎng)基組成如下:
[0085]葡萄糖60g/L
[0086]酵母浸膏15g/L
[0087]谷氨酸鈉4g/L
[0088]氯化鈉3g/L
[0089]硫酸鎂5.0g/L
[0090]硫酸銨5.0g/L
[0091]余量為水。
[0092]B培養(yǎng)溫度:22-27°C ；以及
[0093]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0094]實施例3天然菌株和變異株在生長速度和DHA含量上的差異
[0095]按照實施例2篩選和確認(rèn)后，獲得超過200株喹禾靈抗性裂殖壺菌菌株。然后，以生長速度加快和DHA含量提高為指標(biāo)，進(jìn)一步對這些喹禾靈抗性裂殖壺菌菌株篩選兩輪。第一輪后篩選出20-50株,第二輪后篩選出3株。篩選出的三個菌株中的每一個在生長速度和DHA含量上都高與對照(天然)菌株大于10%。
[0096]所用培養(yǎng)條件為:
[0097]A培養(yǎng)基組成如下:
[0098]葡萄糖60g/L
[0099]酵母浸膏15g/L
[0100]谷氨酸鈉4g/L
[0101]氯化鈉3g/L
[0102]硫酸鎂5.0g/L
[0103]硫酸銨5.0g/L
[0104]余量為水。
[0105]B培養(yǎng)溫度:22-27°C ；以及
[0106]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0107]圖3顯示出對照菌株(最左側(cè))和經(jīng)過紫外輻射誘變和隨后的喹禾靈篩選的部分變異株的生物質(zhì)和DHA含量。從圖3中看出，某些突變株在生長速度和DHA含量上都低于對照菌株，如321-6、321-7和321-8 ;某些突變株在生長速度和DHA含量上與對照菌株無顯著差異，如321-4、321-5、321-19。在多個突變株中，DHA含量提高，如321-1、2010_0321、321-12、321-13、321-14、321-15、321-16、321-17 和 321-18。321-1 和 2010-0321 表現(xiàn)突出，比對照菌株的生長速度分別提高了 10.5%和31.5%，DHA含量分別提高了 64.5%和66.4%。
[0108]除這兩個突變株之外，突變株303-11也表現(xiàn)出良好的生長速度和DHA含量。
[0109]挑選321-1、2010-0321和303-11這3個變異株進(jìn)行實施例4_7中的測試，以驗證通過本申請的方法獲得的變異株具有DHA含量高、生長速度快的性質(zhì)，并能夠在不同的培養(yǎng)條件下穩(wěn)定保持上述性質(zhì)。
[0110]實施例4-7的實驗中所用的通用培養(yǎng)條件為:
[0111]A培養(yǎng)基組成如下:
[0112]葡萄糖60g/L
[0113]酵母浸膏15g/L
[0114]谷氨酸鈉4g/L
[0115]氯化鈉3g/L
[0116]硫酸鎂5.0g/L
[0117]硫酸銨5.0g/L
[0118]余量為水。
`[0119]B培養(yǎng)溫度:22-27°C ;以及
[0120]C 初始 pH:5.0-7.0。
[0121 ] D50L發(fā)酵罐，通氣比率為1VVM，轉(zhuǎn)速為70~100RPM，
[0122]E培養(yǎng)周期4-7天。
[0123]實施例4對照菌株與321-1、2010-0321及303-11在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)的生長速度和DHA含量
[0124]除了葡萄糖濃度之外，培養(yǎng)條件與上文所述的通用培養(yǎng)條件相同。
[0125]為了比較對照(天然)菌株和突變菌株321-1、2010-0321和303-11對不同培養(yǎng)條件的反應(yīng)并進(jìn)一步證實篩選出的菌株超過對照菌株的優(yōu)勢，進(jìn)行了一系列測試和比較。在本實施例中，比較了在不同碳源濃度下培養(yǎng)的對照菌株和突變菌株的生長速度和DHA含量，其中用不同測試濃度
[0126]的碳源替換原始培養(yǎng)基中的碳源。從表1可以看出，在不同的葡萄糖濃
[0127]度(50g/L、60g/L和70g/L)條件下，3個突變株中觀察到的結(jié)果優(yōu)于對照
[0128]菌株，其中結(jié)果最好的是2010-0321，其次是321-1和303-11。
[0129]表1對照菌株和3個突變菌株在不同葡萄糖濃度條件下的生長速度和
[0130]DHA 含量
[0131]
【權(quán)利要求】
1.裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)變異株,其被指定為2010-0321并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2011024。
2.如權(quán)利要求1所述的裂殖壺菌變異株，其中與天然裂殖壺菌菌株相比，所述裂殖壺菌變異株具有DHA含量提高和/或生長速度加快的性質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的裂殖壺菌變異株，其中與天然裂殖壺菌菌株相比，所述裂殖壺菌變異株具有不同的蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)的氨基酸組成和/或脂肪酸的組成。
4.產(chǎn)生裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)變異株的方法,所述方法包括: 通過將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射，在該裂殖壺菌菌株中進(jìn)行誘變，從而產(chǎn)生突變株； 使所述突變株與乙酰輔酶A羧化酶抑制劑接觸；以及 選取與天然裂殖壺菌菌株相比，具有提高的DHA含量和/或加快的生長速度的裂殖壺菌變異株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述乙酰輔酶A羧化酶抑制劑為喹禾靈。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述變異株具有提高的DHA含量和加快的生長速度。
7.如權(quán)利要求4-6中任一項所述的方法，其中所述變異株具有不同的蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)的氨基酸組成和/或脂肪酸的組成。
8.如權(quán)利要求4-7中任一項所述的方法，其中將裂殖壺菌菌株暴露于紫外線輻射的時間為約30秒-約100秒，或約70秒-約90秒。
9.如權(quán)利要求4-8中任一項所述的方法，其中喹禾靈的使用濃度為約ΙΟμπιοΙ/L-約90 μ mol/L,或約 50 μ mol/L-約 80 μ mol/L。
10.如權(quán)利要求4-9中任一項所述的方法，其中所述裂殖壺菌變異株被指定為2010-0321并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2011024。
11.生產(chǎn)DHA的方法，包括: 將權(quán)利要求1_3中任一項所述的裂殖壺菌變異株或通過權(quán)利要求4-10中任一項所述的方法產(chǎn)生的裂殖壺菌變異株在適合培養(yǎng)裂殖壺菌菌株以產(chǎn)生DHA的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；以及任選地 從培養(yǎng)的裂殖壺菌變異株或其培養(yǎng)基的生物質(zhì)中收集DHA。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述條件包括 含有約50-70g/L的碳源和10-20g/L氮源的培養(yǎng)基； 約20-約28°C或約22-約27°C的培養(yǎng)溫度；和/或 3-10的pH值，例如4-8或5-7。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含以下組分，單位為g/L: 葡萄糖 50-70， 酵母浸膏10-30， 谷氨酸鈉10-20，
氯化鈉 2.4-4.0， 硫酸鎂 3.0-6.0， 硫酸銨 3.0-6.0。
14.通過權(quán)利要求11-13中任一項所述方法產(chǎn)生的生物質(zhì)。
15.包含權(quán)利要求14所述的生物質(zhì)或從所述生物質(zhì)中提取的DHA的食品，其中所述食品包括用于喂養(yǎng)嬰兒、兒童、青少年和成人的產(chǎn)品，或所述食品是乳制品。
16.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的裂殖壺菌變異株或權(quán)利要求4-13中任一項所述的方法，其中在3-7天的培養(yǎng)期或5天的培養(yǎng)期中，所述裂殖壺菌變異株產(chǎn)生的DHA的量高于天然裂殖壺菌菌株至少約 10、20、25、30、35、40%，或約 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70%。
17.如權(quán)利要求1-3和16中任一項所述的裂殖壺菌變異株或權(quán)利要求4-13和16中任一項所述的方法，其中在3-7天的培養(yǎng)期或5天的培養(yǎng)期中，所述裂殖壺菌變異株的生長速度高于天然裂殖 壺菌菌株至少約3、4、5、6、7、8、9、10%。
【文檔編號】C12R1/645GK103827289SQ201280029881
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】伯翰, 周潔 申請人:法國羅凱特兄弟公司