雜交恒定區(qū)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雜交恒定區(qū)及包含所述雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白。所述雜交恒定區(qū)至少包含IgG或IgA恒定區(qū)的CH2區(qū)和CH3區(qū)及Cμ恒定區(qū)的Cμ3區(qū)和Cμ4區(qū)。所述雜交體保留了兩種恒定區(qū)組分的性能。所述雜交體保留了Cμ恒定區(qū)的形成多價(jià)復(fù)合物的能力，例如，五聚體或六聚體結(jié)構(gòu)。IgG雜交體也保留了IgG的性能，包括與較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期相關(guān)聯(lián)的pH依賴性的FcRn結(jié)合，以及利于純化的特異性結(jié)合G蛋白。取決于同種型和亞型、抗原的本質(zhì)和額外存在的IgG?CH1和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，IgG雜交體也保留了這些性能：特異性結(jié)合蛋白A、效應(yīng)器功能ADCC、CDC和調(diào)理素作用。IgA雜交體保留了IgA的與Fc-α受體CD89的結(jié)合性能。
【專利說(shuō)明】雜交恒定區(qū)
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)是遞交于2011年9月26日的USSN61/539，416的非臨時(shí)申請(qǐng)案。
【背景技術(shù)】
[0003]抗體是由在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的B細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白(Schroeder etal.,J.Allergy Clin.1mmunol.125:S41-S52, 2010)。哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生五類抗體，即 IgM,IgD, IgG, IgA和IgE0人類可產(chǎn)生IgG的四個(gè)亞類(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)和IgA的兩個(gè)亞類(IgAl和IgA2)。每種抗體是由以單體形式存在的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構(gòu)成。這四條鏈通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)鍵的組合而彼此連接，形成一個(gè)Y形分子。在哺乳動(dòng)物中有兩種輕鏈的型，K和λ。重鏈存在幾種不同類型，由此定義了抗體的類。在人類中，μ重鏈被并入到IgM中，δ重鏈被并入到IgD中，y-l重鏈被并入到IgGl中，Y-2重鏈被并入到IgG2中，Y -3重鏈被并入到IgG3中，Y -4重鏈被并入到IgG4中，α -1重鏈被并入到IgAl中，α -2重鏈被并入到IgA2中，ε重鏈被并入到IgE中。這些抗體的單體形式具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且因此所述抗體對(duì)于抗原結(jié)合是二價(jià)的(divalent)。雖然IgG、IgD和IgE僅作為單體被產(chǎn)生，然而在缺少J鏈時(shí)，IgM作為六聚體被產(chǎn)生并因此對(duì)于抗原結(jié)合是十二價(jià)的(dodecavalent),而當(dāng)J鏈存在時(shí),形成十價(jià)的(decavalent)五聚體(Gilmour etal.，Trans.Med.18:167-174，2008)。有J鏈時(shí)，IgA形成四價(jià)的二聚體，而J鏈不存在時(shí)IgA是單體，但也有報(bào)道稱在無(wú)J鏈存在時(shí)可自發(fā)形成二聚的IgA(Johansen et al., Scand.J.1mmunol.52:240-248, 2000)。
[0004]截至2010年年底，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)28種單克隆抗體作為人類治療齊?。所有這些治療性抗體是IgG抗體或它們的衍生物。除了特異性抗原結(jié)合，IgG抗體還引發(fā)由 Fe 區(qū)介導(dǎo)的各種生 物學(xué)功能(Schroeder et al.supra;Desjarlais et al., Exp.Cell Res.317:1278-1285，2011)。在人類中，通過(guò)將所述Fe區(qū)結(jié)合到在NK細(xì)胞上表達(dá)的Fcy受體III型(CD16)，細(xì)胞結(jié)合的IgGl和IgG3抗體介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC) (Hulett et al.，Adv.1mmunol.57:1-127，1994)。同樣地，通過(guò) Fe 區(qū)與補(bǔ)體成分(complement components)相互作用，細(xì)胞結(jié)合的IgGl和IgG3抗體可有效地觸發(fā)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) (Bindon et al., J.Exp.Med.168:127-142,1988)。
[0005]人IgG抗體的所有四個(gè)亞類的Fe區(qū)與新生兒Fe受體(FcRn)結(jié)合,所述FcRn是由跨膜α鏈和β 2-微球蛋白組成的異源二聚體，所述結(jié)合是pH依賴性的，所述結(jié)合導(dǎo)致:將通過(guò)胞飲作用內(nèi)在化的IgG抗體從溶酶體中分解代謝降解中搶救，并使它們回收到循環(huán)中(Ghetie et al., Annu.Rev.1mmunol.18:739-766, 2000)。因此，IgG抗體表現(xiàn)在循環(huán)中的慢的清除，這導(dǎo)致了其在人類中長(zhǎng)的血清半衰期，通常是23天(Kindt et al., Chapter4, KubyImmunology, Sixth Edition, ff.H.Freeman&C0., 2006)。此外，所述 IgG 抗體的 Fe 區(qū)結(jié)合到蛋白A (除IgG3)和蛋白G,由此,通過(guò)蛋白A或蛋白G親和層析來(lái)純化IgG抗體是可倉(cāng)泛的(Andrew et al., Unit2.7, Chapter III, Current Protocols in Immunology, Johnffiley&Sons, Inc.1997)。[0006] 在細(xì)胞表面上的特定分子的二聚化通?？梢杂|發(fā)一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)。單克隆IgG抗體結(jié)合到位于細(xì)胞表面的PSMA (前列腺特異性膜抗原)蛋白增加了 PSMA的內(nèi)在化(internalization)速率(Liu et al., Cancer Res.58:4055-4060，1998)。I 型跨膜蛋白MUCl的內(nèi)在化和下調(diào)可以通過(guò)結(jié)合到小鼠IgGl抗體引發(fā)(Hisatsune et al., Biochem.Biophys.Res.Comm un.388:677-382，2009)?？?c_Met 的單克隆抗體使細(xì)胞表面的 c_Met 二聚化，并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖(Prat et al., J.Cell Sc1.111:237-247，1998)。類似地，單克隆抗-EPO受體抗體可通過(guò)使表面的EPO受體同源二聚化而用作細(xì)胞生長(zhǎng)激動(dòng)劑(Schneider et al.，Blood89:473-482，1997)。死亡受體 5 (DR5)是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員，然而，在細(xì)胞表面上的死亡受體5 (DR5)的抗體介導(dǎo)的二聚化并不總是觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而通過(guò)小鼠單克隆的抗_DR5IgG抗體和山羊抗小鼠IgG多克隆抗體的混合物介導(dǎo)的DR5的多聚化，例如，會(huì)引發(fā)在細(xì)胞質(zhì)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡(Griffithet al., J.1mmunol.162:2597-2605, 1999)。
[0007]J鏈存在時(shí)，IgM抗體為五聚體，在J鏈不存在時(shí)，IgM抗體為六聚體(Gilmouret al.，同上)。與IgG抗體相反(IgG抗體僅能二聚化抗原)，由于IgM抗體的十價(jià)或十二價(jià)的抗原結(jié)合能力，IgM抗體可以使細(xì)胞表面蛋白多聚化。Fas是TNFR超家族的成員(Cosman, Stem Cellsl2:440-455, 1994)，對(duì)Fas具有特異性的單克隆的IgM抗體能有效地誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡,這是由于表面的Fas蛋白的多聚化(Yonehara et al., J.Exp.Med.169:1747-1756, 1989)，然而，抗-Fas IgG抗體不能進(jìn)行所述誘導(dǎo)，除非它們是交聯(lián)的(Matsuno et al.，J.Rheumatol.29:1609-1614，2002)。相比于 IgG，IgM抗體具有更短的循環(huán)半衰期，在人類中通常為5天，因?yàn)樗鼰o(wú)法與FcRn結(jié)合(Kindt et al.，同上)。由于不與⑶16結(jié)合，IgM抗體也不能介導(dǎo)ADCC。此外，由于IgM不與蛋白A和蛋白G結(jié)合，因此IgM抗體不能通過(guò)蛋白A和蛋白G親和層析分別來(lái)純化(Gautam et al., Biotechnol.Adv.E-publication, July2011)o
[0008]多種結(jié)構(gòu)形式(structural formats)已被用于嘗試產(chǎn)生多價(jià)抗體的新形式(novel forms)。多價(jià)抗體工程的最新進(jìn)展總結(jié)在Cuesta等人的綜述文章(TrendsBiotech.，28:355-362, 2010)。優(yōu)選的多價(jià)IgG抗體能夠有效地在細(xì)胞表面上使抗原多聚化。同樣重要的是，通過(guò)Y重鏈的Fe區(qū)介導(dǎo)的性能例如ADCC、⑶C、調(diào)理素作用、pH依賴性的FcRn結(jié)合和結(jié)合到蛋白A和蛋白G的能力，仍舊保持在這些多價(jià)IgG抗體中。
[0009]為了產(chǎn)生多價(jià)IgG 抗體，Caron 等(J.Exp.Med.，176:1191-1195，1992)介紹了一種自人源化抗-CD33抗體IgGl/kappa抗體中的人Y-1重鏈的羧基末端起第四個(gè)位置絲氨酸-至-半胱氨酸替換，HuGl-M195。這種改造的HuGl-M195，稱為Hd-1gG抗體，被純化，并經(jīng)Ellman氏試劑處理，以使之交聯(lián)，和隨后阻斷過(guò)量的巰基位點(diǎn)。使用苯基瓊脂糖凝膠柱層析法將單體的HuGl-M195從Hd-1gG中消除。由此產(chǎn)生的Hd-1gG顯示了顯著改善的使⑶33分子內(nèi)在化的能力，而且比HuGl-M195在ADCC和⑶C中更有效。
[0010]通過(guò)復(fù)制人源化抗HER2的IgGl單克隆抗體(hu4D5)的重鏈中的VH-CHl區(qū)，Miller 等構(gòu)建了一個(gè)四價(jià) IgG 抗體(J.1mmunol., 170:4854-4861,2003)。所述被改造的 Y重鏈，從N末端到C末端，由以下組成洲、011、￥!1、011、鉸鏈、012和013區(qū)。一條輕鏈結(jié)合到所述改造的IgG中的所有四個(gè)VH-CHl區(qū)，形成了一個(gè)四價(jià)hu4D5抗體(TA-HER2)。相比于HER2-表達(dá)細(xì)胞上的親源(parental) 二價(jià)抗_hu4D5抗體，TA-HER2更快速地被內(nèi)在化。Miller等(出處同上)也構(gòu)建了一個(gè)四價(jià)抗_DR5IgG抗體，稱為TA-DR5，具有與TA-HER2 —樣的重鏈形式(heavy chain format)。TA-DR5觸發(fā)細(xì)胞凋亡的濃度比親源二價(jià)抗_DR5IgG單克隆抗體低100倍。
[0011]Rossi 等(Cancer Res.，68:8384-8392，2008)報(bào)道了采用對(duì)接和鎖定(Dock-and-Lock)方法構(gòu)建六價(jià)抗_Q)20IgG抗體，被認(rèn)定為Hex_hA20。為產(chǎn)生由6個(gè)Fab區(qū)和2個(gè)Fe區(qū)構(gòu)成的HeX-hA20，兩種組分被構(gòu)建并分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)。首先，A-激酶錨定蛋白(AD)的錨定結(jié)構(gòu)域被基因地(genetically)融合到人源化抗_CD20IgGl抗體(hA20)的重鏈的羧基末端。該構(gòu)建體被命名為CH3-AD2-1gG-hA20。其次，環(huán)AMP依賴性蛋白激酶(DDD)的對(duì)接結(jié)構(gòu)域被基因地(genetically)融合到h20的Fab片段的羧基末端。這種結(jié)構(gòu)被指定為 CHl-DDD2-Fab-hA20。CH3-AD2-1gG_hA20 和 CH1-DDD2-Fab_hA2O 分別由蛋白A和蛋白L親和層析純化。Hex-hA20通過(guò)以下方法得到:將純化的CH3-AD2-1gG_hA20和CHl-DDD2-Fab-hA20在氧化還原條件下進(jìn)行混合，然后用蛋白A純化。Hex_h20抑制⑶20-表達(dá)B淋巴細(xì)胞系的增殖，而不需要交聯(lián)抗體。Hex-h20保留了 hA20的ADCC活性，但失去了⑶C活性。
[0012]Yoo 等(J.Biol.Chem.，47:33771-33777，1999)構(gòu)建了變體的人抗-DNS IgG2抗體，其中，部分Y-2重鏈被替換為人α-1重鏈的相應(yīng)部分。在所述構(gòu)建的被稱為
YY Y-a tp的抗體中，18個(gè)氨基酸的多肽存在于人α-1重鏈的C-末端，稱為atp(也稱為α尾端(tailpiece )),被連接到人Y _2重鏈的C-末端。所述Y Y y-atp構(gòu)建體進(jìn)一步被改造以成為如下的三種變體IgG2抗體。在a y Y-atp中，所述Y _2重鏈的CHl區(qū)被替換為人a -1重鏈的對(duì)應(yīng)物。在a α yα tp中,CH1、鉸鏈和CH2區(qū)被替換為人a -1重鏈的對(duì)應(yīng)物。在Ya y-atp中，鉸鏈和CH2區(qū)被替換為人a -1重鏈的對(duì)應(yīng)物。這些構(gòu)建體被穩(wěn)定地表達(dá)于產(chǎn)生J鏈的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0。每種純化的Y Y Y-atp、a y y-a tp>a a y-atp和yα Y - a tp抗體均是單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體的混合物。所述混合物中五聚體和六聚體的組合百分比分別為:對(duì)于Y Y Y-atp為20%、對(duì)于a y Y - a tp 為 25%、對(duì)于 a α y - a tp 為 45%、對(duì)于 Y α y - a tp 為 32%。
[0013]Sorensen 等(J.1mmunol.156:2858-2865, 1996)在人單克隆抗-NIP (3-硝基-4-羥基-5-1odophenulacetic酸)IgG3抗體變體的基礎(chǔ)上,制備了多價(jià)抗體，其中第一、第二和第三鉸鏈區(qū)域被刪除。所述變體IgG3抗體的Y-3重鏈兩個(gè)位置被改造。首先，人μ重鏈的C-末端中存在的18氨基酸多肽，稱為ytp(也稱為μ尾端(tailpiece))，被連接到重鏈的C-末端。第二，CH2區(qū)中第309位的一個(gè)亮氨酸殘基變成了一個(gè)半胱氨酸殘基。這種被改造的單克隆IgG3抗體，被稱為IgGL309C μ tp，在產(chǎn)生J鏈的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系J558L中表達(dá)，并使用NIP-瓊脂糖凝膠柱純化。據(jù)報(bào)道，相比親源IgG3抗體，IgGL309C μ tp具有相對(duì)差的分泌水平，并且很大一部分IgGL309Cy tp被保留在細(xì)胞內(nèi)。分析表明，五聚體和六聚體構(gòu)成所述純化的IgGL309Cy tp的81%。
[0014]Sorensen 等(Int.1mmunol., 12:19-27，2000)也改造了與上述相同白勺人抗-NIPIgG3抗體變體，通過(guò)取代Y-3重鏈的CH2和CH3區(qū)為人μ重鏈的包括μ tp的CH3和CH4區(qū)。這種改造的IgG3/IgM雜交分子的重鏈，稱為IgG-Cy 3-Cμ 4，自N-末端開(kāi)始，由抗-NIP VH區(qū)、人Y -3重鏈的CHl和第四鉸鏈區(qū)和人μ重鏈的包含μ tp的CH3和CH4區(qū)。IgG-Cy 3-C μ 4在產(chǎn)生J鏈的J558L細(xì)胞中表達(dá)并用NIP-瓊脂糖凝膠柱純化。在純化的IgG-Cy 3-Cμ 4中，六聚體和五聚體分別構(gòu)成了 14.0%和66.7%。因?yàn)镮gG-Cμ 3-Cμ 4沒(méi)有人Y -3重鏈的CH2和CH3區(qū)，它將缺乏Fe Y -介導(dǎo)的性能，例如ADCC、pH依賴性的FcRn結(jié)合和結(jié)合到蛋白A和蛋白G的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明提供了一種包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白，所述重鏈恒定區(qū)從N-端至C-端依次包含CH2區(qū)、CH3區(qū)、C μ 3區(qū)和C μ 4區(qū)，所述CH2區(qū)或CH3區(qū)是IgG或IgA的同種型。任選地，所述免疫球蛋白重鏈還包含位于所述CH2區(qū)N-端的鉸鏈區(qū)。任選地，所述免疫球蛋白重鏈還包含位于所述鉸鏈區(qū)N-端的CHl區(qū)。
[0016]任選地，所述抗體或融合蛋白是抗體，其中所述重鏈恒定區(qū)與重鏈可變區(qū)融合，并且所述抗體進(jìn)一步包括含有輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的輕鏈。任選地，所述抗體是多特異性抗體的組分，所述多特異性抗體包含多種由權(quán)利要求4定義的抗體，所述多種抗體具有不同的重鏈可變區(qū) 以及可選地，不同的輕鏈可變區(qū)；所述多種抗體通過(guò)所述C μ 3和C μ 4區(qū)集合于所述多特異性抗體中。
[0017]任選地，如上面提到的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgGl的區(qū)。任選地，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG2的區(qū)。任選地，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG3的區(qū)。任選地，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG4的區(qū)。任選地，若存在CHl區(qū)，所述CH1、CH2和CH3區(qū)是IgA的區(qū)。任選地，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，并且所述Cy 3區(qū)和C μ 4區(qū)是人Cy3和Cy4區(qū)。
[0018]任選地，所述抗體或融合蛋白是一種單鏈抗體，所述單鏈抗體包含與所述重鏈恒定區(qū)連接的單鏈Fv。任選地，所述單鏈抗體是多特異性抗體的組分，所述多特異性抗體包含多種單鏈抗體，其中所述多種單鏈抗體的所述單鏈Fv具有不同的VH區(qū)，并且所述多種單鏈抗體通過(guò)所述C μ 3和C μ 4區(qū)集合于所述多特異性抗體中。任選地，所述單鏈Fv具有相同的VL區(qū)。
[0019]任選地，抗體或融合蛋白是多聚體形式，所述多聚體包含一種單元的至少五個(gè)或六個(gè)拷貝，所述單元包含兩條所述重鏈和兩條所述輕鏈，所述拷貝通過(guò)所述C μ 3和C μ 4區(qū)集合于所述多聚體中。
[0020]可選地，在上述的抗體或融合蛋白中，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG，并且所述抗體或融合蛋白顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G、特異性結(jié)合蛋白A、表現(xiàn)出ADCC、表現(xiàn)出CDC和/或表現(xiàn)出調(diào)理素作用。
[0021]可選地，在上述的抗體或融合蛋白中，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgGl的區(qū)，并且所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及特異性結(jié)合蛋白A?？蛇x地，這些抗體顯示ADCC、⑶C和調(diào)理素作用。
[0022]可選地，在上述的抗體或融合蛋白中，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgG2或IgG4的區(qū)，并且所述抗體或融合蛋白顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及特異性結(jié)合蛋白A。
[0023]可選地，在上述的抗體或融合蛋白中，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgG3的區(qū)，并且所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn及特異性結(jié)合蛋白G。可選地，所述抗體或融合蛋白顯示ADCC、⑶C和調(diào)理素作用。
[0024]可選地，在上述的抗體或融合蛋白中，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgA,并且所述抗體與Fe α受體結(jié)合。
[0025]可選地，上述抗體或融合蛋白是一種融合蛋白，所述融合蛋白包含與異源多肽連接的所述免疫球蛋白重鏈?？蛇x地，述異源蛋白通過(guò)例如Gly-Gly-Ala-Ala的柔性連接器與所述恒定區(qū)的所述鉸鏈連接?？蛇x地，所述異源多肽是受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或與受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。可選地，所述融合蛋白是包含多種融合蛋白的多特異性復(fù)合體的組分，所述多種融合蛋白包含不同的異源多肽。
[0026]可選地，如上所述的抗體或融合蛋白是多特異性復(fù)合體，所述多特異復(fù)合體包含通過(guò)所述C μ 3和C μ 4區(qū)集合的抗體和融合蛋白。
[0027]可選地，如上所述的抗體或融合蛋白是人源化抗體、嵌合抗體、飾面抗體或人抗體。
[0028]可選地，如上所述的抗體或融合蛋白與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。
[0029]可選地，如上所述的抗體或融合蛋白是與⑶79a、⑶30或DR5特異性結(jié)合的抗體。
[0030]可選地，如上述的抗體或融合蛋白是一種是包含TNF- α受體、LFA_3或IL-1受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 的融合蛋白，或是包含TRAIL蛋白的融合蛋白。
[0031 ] 可選地，如上所述抗體或融合蛋白與毒性部分結(jié)合。
[0032]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種包含如上所述抗體或融合蛋白的藥物組合物。
[0033]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療癌癥的方法，所述方法包括對(duì)患有癌癥和有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的病人以有效的方案給予如上所述的抗體或融合蛋白。
[0034]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療免疫失調(diào)的方法，所述方法包括對(duì)患有免疫失調(diào)和有患免疫失調(diào)風(fēng)險(xiǎn)的病人以有效的方案給予如上所述的抗體或融合蛋白。
[0035]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備抗體和/或融合蛋白的多特異性復(fù)合體的方法，所述方法包括:a.用編碼多種由權(quán)利要求1定義的抗體和/或融合蛋白的一種或多種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述抗體和/或融合蛋白具有不同的特異性；其中所述抗體和/或融合蛋白被表達(dá)并通過(guò)所述Cu 3和Cu 4區(qū)被組裝在多特異性復(fù)合體中 '及h.從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離所述多特異性復(fù)合體?？蛇x地，所述多種抗體或多種融合蛋白中的每一種抗體或每一種融合蛋白由不同載體編碼。
[0036]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種包含雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白，所述雜交恒定區(qū)包含N-端的IgG恒定區(qū)片段和C-端的IgM恒定區(qū)片段；其中所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及由IgM恒定區(qū)介導(dǎo)的多聚化,所述多聚化至少形成五聚體或六聚體。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1:抗體表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0038]圖2:單體形式的重組抗體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039]圖3A-E:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的抗-⑶79a IgGl抗體的洗脫圖譜。
[0040]圖4:通過(guò)多價(jià)抗-⑶79a IgGl抗體誘導(dǎo)的Ramos細(xì)胞凋亡。[0041]圖5:pH依賴性的多價(jià)IgGl抗體與FcRn的結(jié)合。
[0042]圖6A-1:多價(jià)IgGl抗體與CD16的結(jié)合。
[0043]圖7A-D:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的抗_CD30IgGl抗體的洗脫圖譜。
[0044]圖8:通過(guò)多價(jià)抗-⑶30IgGl抗體引起的Karpas299細(xì)胞的細(xì)胞抑制。
[0045]圖9:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的多價(jià)抗_CD30IgGl抗體的洗脫圖譜。
[0046]圖10A-D:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的抗_DR5IgGl抗體的洗脫圖譜。
[0047]圖11:由多價(jià)抗_DR5IgGl抗體誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡。
[0048]圖12A-C:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的多價(jià)抗_CD79a IgG4抗體的洗脫圖譜。
[0049]圖13A-E:來(lái)自Superose6凝膠過(guò)濾柱的抗_CD79a IgG3抗體的洗脫圖譜。
[0050]圖14:pH依賴性的多價(jià) IgG3抗體與FcRn的結(jié)合。
[0051]圖15A-G:多價(jià)IgG3抗體與CD16的結(jié)合。
[0052]圖 16 的 A、B、C: gamma-1 (SEQ ID NOs: 15-18), y-2 (SEQ ID NOs: 19-22), Y-3(SEQ ID NOs:23-26), y-4 (SEQ ID NOs:27-30), a -1 (SEQ ID N0s:31_33)，α -2 (SEQID NOs:34-36), μ 重鏈恒定區(qū)(SEQ ID N0s:51_54)，和 J 鏈(SEQ ID NO:55)。18 氨基酸μ尾端在Cy序列中被畫(huà)了下劃線。顯示J鏈的前22個(gè)氨基酸是個(gè)被切除的(cleaved)信號(hào)肽。
[0053]圖17:六聚體結(jié)構(gòu)的(in hexameric conformation)具有雜交恒定區(qū)的實(shí)例性抗體。鏈間的二硫鍵由直線顯示。每個(gè)單體單元有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)形成自一條重鏈和一條輕鏈的可變區(qū)。六個(gè)單體單元是通過(guò)不同單體單元的Cy 3和Cy 4區(qū)之間的二硫鍵而彼此結(jié)合。包括所示化合價(jià)和二硫鍵結(jié)合模式的所述抗體僅是本發(fā)明的用以提供說(shuō)明的一個(gè)實(shí)施例。
[0054]圖 18:經(jīng) HuY0N007-MVIgGl 或 HuY0N007_IgGl 處理的具有 Ramos 的 CB17SCID 小鼠的存活數(shù)據(jù)。
[0055]定義
[0056]抗體或融合蛋白通常以分離的形式提供。這意味著抗體或融合蛋白通常是干擾蛋白或其他污染物(產(chǎn)生于生產(chǎn)或純化)的至少50%w/w的純度，但不排除這樣的可能，即所述的抗體與過(guò)量的一種(或多種)藥物上可接受的載體或其他介質(zhì)結(jié)合，以方便其使用。通常分離的單克隆抗體或其他的生物實(shí)體劑是純化后剩余的優(yōu)勢(shì)大分子種類。有時(shí)，抗體或融合蛋白通常是干擾蛋白或其他污染物(產(chǎn)生于生產(chǎn)或純化)的至少60、70、80、90、95或99%w/w的純度。通常，抗體或融合蛋白是其純化后剩余的主要大分子種類。
[0057]抗體或融合蛋白與其靶抗原的特異性結(jié)合意味著親非和力至少有106、107、108、IO9或IOkiM'特異性結(jié)合可檢測(cè)到更高的量級(jí)，且可從非特異性結(jié)合至少一個(gè)不相關(guān)靶標(biāo)的情況中區(qū)分。特異性結(jié)合可以是特定官能團(tuán)或特定空間配合(例如，鎖和鑰匙型)之間的鍵形成的結(jié)果，而非特異性結(jié)合通常是范德華力的結(jié)果。然而特異性結(jié)合并不必然意味著抗體或融合蛋白只結(jié)合一個(gè)且只有一個(gè)靶標(biāo)。
[0058]基本的抗體結(jié)構(gòu)單元是亞基的四聚體。每個(gè)四聚體包含兩對(duì)相同的多肽鏈，每對(duì)多肽鏈有一個(gè)“輕”鏈(約25kDa)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個(gè)可變區(qū)來(lái)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別，可變區(qū)約100至110或更多的氨基酸。該可變區(qū)最初被表達(dá)時(shí)連接到一個(gè)可分裂的信號(hào)肽上。沒(méi)有信號(hào)肽的可變區(qū)，有時(shí)也被稱為成熟的可變區(qū)。因此，例如，輕鏈成熟可變區(qū)，意味著沒(méi)有輕鏈信號(hào)肽的輕鏈可變區(qū)。然而，提及可變區(qū)并不意味著信號(hào)序列必然存在；實(shí)際上，本發(fā)明的抗體或融合蛋白一旦表達(dá)和分泌，信號(hào)序列就被切割。一對(duì)重鏈和輕鏈可變區(qū)定義了抗體的結(jié)合區(qū)。輕鏈和重鏈的羧基端部分分別定義了輕鏈和重鏈恒定區(qū)。每所述重鏈恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能。在IgG抗體中，所述重鏈恒定區(qū)被分成CHl、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。在IgA中，所述重鏈恒定區(qū)被分成CHl、CH2和CH3。CHl區(qū)通過(guò)二硫鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合到輕鏈恒定區(qū)。鉸鏈區(qū)提供了抗體的結(jié)合區(qū)和效應(yīng)器區(qū)之間的靈活性，并且還提供了一個(gè)四聚體亞基中兩個(gè)重鏈恒定區(qū)之間分子間二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。所述CH2和CH3區(qū)是效應(yīng)器功能和FcRn結(jié)合的主要位點(diǎn)。在IgM抗體中，μ重鏈恒定區(qū)(Cu )被細(xì)分為四個(gè)區(qū)域Cy 1，Cy 2，Cy 3和Cy 4。所述Cμ 3和Cμ 4區(qū)，有時(shí)與一個(gè)或多個(gè)J鏈組合，在天然IgM抗體和本發(fā)明的抗體或融合蛋白中提供了多聚化的功能。μ尾端(tailpiece)是一個(gè)位于IgM重鏈恒定區(qū)C-末端的18個(gè)氨基酸長(zhǎng)的多肽。J鏈存在時(shí)，IgM多聚化形成一個(gè)五聚體結(jié)構(gòu)，J鏈不存在時(shí)，IgM多聚化形成一個(gè)六聚體結(jié)構(gòu)。
[0059]輕鏈被分類為為K或λ輕鏈。重鏈被分類為Y、μ、α、δ或ε ,并定義對(duì)應(yīng)抗體的同種型(isotype)分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)一個(gè)約12個(gè)或12個(gè)以上的氨基酸的“J”區(qū)連接，同時(shí)重鏈還包括一個(gè)約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸 “D” 區(qū)。(通常參見(jiàn) Fundamental Immunology (Paul, ff., ed., 2nd ed.RavenPress, N.Y.，1989) ,Ch.7)(在此為所有目的并入?yún)⒖?。
[0060]每個(gè)輕/重鏈對(duì)的成熟可變區(qū)可形成的抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此,一個(gè)完整的抗體具有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在天然抗體中，所述結(jié)合位點(diǎn)是一樣的。然而，雙特異抗體可以被制備，其中，兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是不同的(參見(jiàn)例如Songsivilai and Lachmann, Clin.Exp.1mmunol., 79:315-321 (1990);Kostelny et al.，J.1mmunol.，148:1547-53 (1992))。 可變區(qū)全表現(xiàn)出相對(duì)保守的骨架區(qū)(FR)的相同的通用結(jié)構(gòu)，所述骨架區(qū)通過(guò)3個(gè)高變區(qū)連接，所述的高變區(qū)也叫互補(bǔ)決定區(qū)或⑶Rs。源自每個(gè)對(duì)(pair)的兩條鏈的⑶Rs是由框架區(qū)對(duì)準(zhǔn)，以使之結(jié)合到特定的抗原表位。從N-末端至C-末端，輕鏈和重鏈均包括結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配與Kabat《免疫學(xué)重要的蛋白質(zhì)的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(國(guó)立衛(wèi)生研究院，Bethesda, MD, 1987 和 1991)中的定義或 Chothia&Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ; Chothia 等，Nature342:878-883 (1989)的定義是一致的。Kabat還提供了一種廣泛使用的編號(hào)慣例(Kabat編號(hào))，其中，不同重鏈可變區(qū)或不同輕鏈可變區(qū)之間的相應(yīng)殘基被分配了相同的編號(hào)。盡管Kabat編號(hào)可用于抗體恒定區(qū)，但如本發(fā)明的情況，EU索引(EU index)被更普遍地使用。
[0061] 多聚化單元(multimerization unit)是指本發(fā)明的并入了雜交(hybrid)恒定區(qū)的抗體或融合蛋白的單體單元(monomeric unit),通過(guò)其IgM部分經(jīng)受多聚化。所述多聚化單元本身可以是一或二價(jià)的。在單特異性(mono-specific) 二價(jià)抗體單元中，兩條重鏈和兩條輕鏈?zhǔn)窍嗤摹Ｔ陔p特異性(bispecific) 二價(jià)抗體單元中，具有兩個(gè)不同的重鏈和輕鏈對(duì)，所述兩個(gè)重鏈和輕鏈對(duì)具有不同結(jié)合特異性?？贵w單元也可以是含有單一重鏈和輕鏈組合的一價(jià)抗體，如單鏈抗體的情況，其中，重鏈和輕鏈可變區(qū)分子內(nèi)配對(duì)。融合蛋白單元可以是單體的(monomeric)、包含一種融合蛋白的兩個(gè)拷貝的同型二聚體(homodimer ic)、包含不同融合蛋白異源二聚體(heterodimer ic)。
[0062]多聚化指至少兩個(gè)多聚化單元的聯(lián)合，更通常5或6個(gè)這樣的單元通過(guò)雜交恒定區(qū)的Cy部分聯(lián)合。含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白的多聚化有時(shí)會(huì)形成比普通IgM的五聚體或六聚體結(jié)構(gòu)更高過(guò)更低序(order)結(jié)構(gòu)。有時(shí),這類多聚化的特征在于通過(guò)多聚化形成一個(gè)具有至少約五或六個(gè)單元的復(fù)合體。
[0063]化合價(jià)(valency)是指結(jié)合區(qū)的數(shù)量或者換言之，能被抗體或融合蛋白結(jié)合的靶抗原分子的最大數(shù)目。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的同型二聚體IgG抗體有兩個(gè)化合價(jià)。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的IgM抗體具有10或12化合價(jià)，取決于是形成五聚體還是六聚體結(jié)構(gòu)(即五或六個(gè)IgM的元，每個(gè)單元均是含有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的四聚體)。本發(fā)明的抗體或融合蛋白(其中的單體單元是二價(jià)的)可以有10個(gè)或12個(gè)化合價(jià)，然而抗體或融合蛋白(其中單體單元是一價(jià))可具有5或6個(gè)化合價(jià)?；蟽r(jià)可以在這些值中變化，這是因?yàn)榫哂须s交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白有時(shí)會(huì)形成比常規(guī)的IgM的五聚體或六聚體結(jié)構(gòu)更高序或更低序的結(jié)構(gòu)。這些化合價(jià)是理論最大值。在實(shí)踐中，由于空間位阻的限制，結(jié)合的抗原的拷貝數(shù)可能小于理論上的最大值。
[0064]如果所有其抗原(或配體)結(jié)合區(qū)具有相同的特異性，本發(fā)明的抗體或融合蛋白是單特異性的抗體。如果它的抗原結(jié)合區(qū)包括至少兩種不同的特異性，該抗體或融合蛋白是多特異性的。多特異性的抗體或融合蛋白中的不同特異性的數(shù)量可以為2至多達(dá)所述抗體或融合蛋白的最大價(jià)數(shù)(例如，10或12)。在由通過(guò)相同細(xì)胞培養(yǎng)的抗體或融合蛋白群體中，不同特異性的數(shù)目在不同的所述群體中是變化的。
[0065]術(shù)語(yǔ)“抗體”包括任何形式的具有至少一個(gè)結(jié)合區(qū)(包含單價(jià)片段)抗體、兩條重鏈和兩條輕鏈的二價(jià)四 聚體單元、以及更高序的復(fù)合物，特別是一價(jià)或二價(jià)單元的五聚體和六聚體。所述抗體可以是單特異性的，在這種情況下，所有結(jié)合區(qū)具有相同特異性，或者所述抗體可以是多特異性，在這種情況下，所述結(jié)合位點(diǎn)具有至少兩種特異性。抗體片段通常包括一個(gè)重鏈可變區(qū)和雜交重鏈恒定區(qū)，也可以包括一個(gè)輕鏈可變區(qū)。例如，抗體片段可以包括從N-末端到C末端的輕鏈可變區(qū)，肽間隔區(qū)，重鏈可變區(qū)和本發(fā)明的雜交重鏈恒定區(qū)。另一個(gè)片段包含重鏈可變區(qū)(結(jié)合區(qū))和雜交重鏈恒定區(qū)和無(wú)輕鏈(即，Dab或納米抗體)。同樣地，融合蛋白包括單體或二聚的融合蛋白單元，或更高序的復(fù)合物，特別是五聚體和六聚體。
[0066]術(shù)語(yǔ)“表位”是指位于抗原上的能與抗體結(jié)合的位點(diǎn)?？乖砦豢捎梢粋€(gè)或多個(gè)蛋白三級(jí)折疊的并列的連續(xù)的氨基酸或不連續(xù)的氨基酸形成。由連續(xù)氨基酸形成的抗原表位(也稱為線性表位)通常暴露于變性劑后保留，而由三級(jí)折疊形成的抗原表位(也稱為構(gòu)象表位)通常經(jīng)變性劑處理后通常消失。一些抗體結(jié)合到終端-特異性表位，意味著:相比與其他多肽融合的多肽(這導(dǎo)致失去自由終端)，抗體優(yōu)先結(jié)合到具有自由終端的多肽?？乖砦坏莫?dú)特空間構(gòu)象中通常包括至少為3個(gè)，更通常為5個(gè)或8-10個(gè)氨基酸?？乖砦华?dú)特空間構(gòu)象的測(cè)定方法包括,例如，X-射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振,見(jiàn),例如EpitopeMapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E.Morris,Ed.(1996)o
[0067]術(shù)語(yǔ)“抗原”或“靶抗原”是指通過(guò)抗體或融合蛋白結(jié)合的靶標(biāo)分子?？乖梢允侨魏伍L(zhǎng)度的(天然的、合成的或重組表達(dá))蛋白質(zhì)、核酸或其他分子中的碳水化合物?？乖ㄊ荏w、配體(ligands)、反受體(counter receptors)和外殼蛋白。[0068]在一個(gè)融合蛋白中的異源多肽是不天然地連接至免疫球蛋白恒定區(qū)的多肽。這樣的多肽可以是全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或其片段，該片段有足夠的長(zhǎng)度以保持其可以跟與所述全長(zhǎng)蛋白質(zhì)結(jié)合的抗原特異性地結(jié)合。例如，異源多肽可以是受體胞外結(jié)構(gòu)域或其配體。
[0069] 識(shí)別相同或重疊抗原表位的抗體可被簡(jiǎn)單的免疫分析法檢定，該免疫分析法顯示一個(gè)抗體相對(duì)于另一個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶抗原的能力?？贵w的對(duì)應(yīng)抗原表位也可以通過(guò)結(jié)合于抗原的抗體的X-射線晶體學(xué)來(lái)確定，以鑒定接觸殘基。或者，如果可減少或消除一種抗體結(jié)合的抗原所有氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有相同的抗原表位。如果可減少或消除一種抗體結(jié)合的抗原某些氨基酸突變類型也可減少或消除另一種抗體的結(jié)合，則這兩種抗體具有重疊的抗原表位。
[0070]抗體間的競(jìng)爭(zhēng)由試驗(yàn)分析來(lái)確定，其中被測(cè)的抗體抑制參照抗體(referenceantibody)與共有抗原的特異結(jié)合(見(jiàn),如Junghans等,Cancer Res.50:1495, 1990)。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)分析中，若過(guò)量的被測(cè)試抗體(例如，至少2x、5x、10x、20x或IOOx)抑制至少50%，但優(yōu)選為75%、90%或99%參照抗體的結(jié)合，則被測(cè)試抗體與參照抗體競(jìng)爭(zhēng)。由競(jìng)爭(zhēng)法確定的抗體(競(jìng)爭(zhēng)性抗體)包括與參照抗體具有相同結(jié)合抗原表位的抗體，及與一個(gè)毗鄰抗原表位(由于空間位阻發(fā)生，該毗鄰抗原表位充分接近與參照抗體結(jié)合的抗原表位)結(jié)合的抗體。
[0071]術(shù)語(yǔ)“患者”包括接受預(yù)防或治療處理的人類和其他哺乳動(dòng)物受試者。
[0072]為了對(duì)氨基酸替換的保守性和非保守性進(jìn)行分類，氨基酸分組如下:組I (疏水性側(cè)鏈):甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸亮，氨酸、異亮氨酸；組II (中性親水性側(cè)鏈):半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III (酸性側(cè)鏈):天冬氨酸、谷氨酸；組IV (基本側(cè)鏈):天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；組V (影響鏈定位的殘基):甘氨酸、脯氨酸；組VI (芳香側(cè)鏈):色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守的替換涉及同一類氨基酸之間的替換，非保守替換構(gòu)成一類氨基酸的成員被另一類氨基酸的成員替換。
[0073]序列一致性百分率根據(jù)Kabat編號(hào)法則(對(duì)可變區(qū))或EU編號(hào)法則(對(duì)恒定區(qū))對(duì)抗體序列進(jìn)行最大比對(duì)。如果受試抗體區(qū)域(如一條輕鏈或一條重鏈的完整的成熟可變區(qū))與一個(gè)參照抗體的相同序列比對(duì)，比對(duì)后，受試抗體與參照抗體相同序列百分率為受試抗體與參照抗體中占據(jù)相同位置的氨基酸數(shù)量除以兩個(gè)區(qū)域的比對(duì)位置的總數(shù)，缺口不算在內(nèi)，乘以100以轉(zhuǎn)換成百分率。
[0074]“包括”的一個(gè)或多個(gè)例舉元素的組合物或方法還囊括其它沒(méi)有特別例舉的元素。例如，一個(gè)包括抗體的組合物，該組合物可以僅含有該抗體，也可與其它成分相結(jié)合。
[0075]術(shù)語(yǔ)“抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性”，或ADCC，是一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制，所述機(jī)制取決于抗體包被的靶細(xì)胞(即結(jié)合抗體的細(xì)胞)與具有細(xì)胞溶解活性(也稱為效應(yīng)細(xì)胞)的免疫細(xì)胞之間的相互作用。這樣的效應(yīng)細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。ADCC是由結(jié)合到細(xì)胞的抗體的Fe區(qū)與Fe Y受體之間的相互作用觸發(fā)，所述Fe Y受體尤其是Fe Y RI和Fe y RIII，位于如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞上。靶細(xì)胞通過(guò)吞噬作用或細(xì)胞溶解除去，這取決于介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的類型。經(jīng)抗體包被的靶細(xì)胞的死亡的發(fā)生是效應(yīng)器細(xì)胞活性的結(jié)果。
[0076]術(shù)語(yǔ)調(diào)理素作用(opsonization)也被稱為“抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用”，或ADCP，是指經(jīng)由全部或部分吞噬性免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)將被抗體包被的細(xì)胞的內(nèi)在化(internalized)過(guò)程,其中所述吞曬性免疫細(xì)胞結(jié)合到免疫球蛋白Fe區(qū)。
[0077]術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或CDC是指一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制，其中與標(biāo)靶結(jié)合的抗體的Fe效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域激活一系列最終在標(biāo)靶細(xì)胞膜上形成孔洞的酶反應(yīng)。典型地，抗原-抗體復(fù)合物(如被抗體包被的靶細(xì)胞)結(jié)合并激活補(bǔ)體成分Clq，從而激活導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。補(bǔ)體的活化還可能導(dǎo)致補(bǔ)體成分沉積在所述靶細(xì)胞表面，通過(guò)結(jié)合白細(xì)胞上的補(bǔ)體受體(例如，CR3)而促進(jìn)ADCC。
[0078]pH依賴性的抗體與FcRn受體的結(jié)合是指，相比在pH7.5時(shí)，pH6.0使抗體更強(qiáng)烈地結(jié)合于受體。在通過(guò)胞飲作用內(nèi)在化后，在核內(nèi)體(endosomes)中低pH值環(huán)境下的FcRn結(jié)合可以將IgG抗體從溶酶體中分解代謝降解中解救出來(lái)。被解救的IgG抗體然后在中性pH中從FcRn釋放出，并被回收到循環(huán)里。這樣的pH依賴性FcRn結(jié)合是IgG抗體(也包括本發(fā)明的含有雜交恒定區(qū)的抗體和融合蛋白)血清半衰期長(zhǎng)的基礎(chǔ)(Ghetie et al., Annu.Rev.1mmunol.18:739-766,2000)。例如，人IgG抗體在pH6.0時(shí)結(jié)合到人類新生兒Fe受體(FcRn)，然而它們?cè)趐H為7.5時(shí)的結(jié)合十分弱。IgG抗體中的FcRn結(jié)合位點(diǎn)位于在CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的連接處。由于在pH6.0或7.5時(shí)，μ重鏈不與FcRn結(jié)合，所以天然IgM抗體不能利用FcRn介導(dǎo)途徑將抗體從溶酶體的降解中解救出來(lái)，因此，IgM抗體一般比天然IgG抗體具有更短的半衰期。
[0079]人源化抗體是經(jīng)基因工程改造過(guò)的抗體，其中源自非人“供體”抗體的CDRs被嫁接于(grafted into)人“受體”抗體序列(見(jiàn)例如Queen, US5, 530, 101及 5，585，089 ；ffinter, US5, 225，539 ；Carter, US6, 407，213 ；Adair, US5, 859，205 ；及Foote, US6, 881, 557) ο所述受體抗體序列可為例如成熟人抗體序列、所述序列的組合物、人抗體序列的共有序列(consensus sequence)或種系區(qū)域序列(germline regionsequence)0因此，人源化抗體是這樣一種抗體，其具有完全或?qū)嵸|(zhì)上源自供體抗體的部分或全部CDRs，和完全或?qū)嵸|(zhì)上源自人抗體序列的可變區(qū)框架序列及恒定區(qū)(若存在的話)。類似地，人源化重鏈具有至少一、二及通常所有三個(gè)完全或?qū)嵸|(zhì)上源自供體抗體重鏈的CDRs，及實(shí)質(zhì)上源自人重鏈可變區(qū)框架及恒定區(qū)序列的重鏈可變區(qū)框架序列及重鏈恒定區(qū)(若存在的話)。類似地，人源化輕鏈具有至少一、二及通常所有三個(gè)完全或?qū)嵸|(zhì)上源自供體抗體輕鏈的CDRs，及實(shí)質(zhì)上源自人輕鏈可變區(qū)框架及恒定區(qū)序列的輕鏈可變區(qū)框架序列及輕鏈恒定區(qū)(若存在的話)。不同于奈米抗體(nanobodies)及dAb,人源化抗體包含人源化重鏈及人源化輕鏈。當(dāng)人源化抗體中的CDR與非人抗體中的對(duì)應(yīng)CDR之間的對(duì)應(yīng)殘基(如Kabat定義)具有至少60%、85%、90%、95%或100%的一致性時(shí)，該人源化抗體中的CDR則實(shí)質(zhì)上源自該非人抗體中的對(duì)應(yīng)CDR。當(dāng)抗體鏈的可變區(qū)框架序列或抗體鏈的恒定區(qū)與由Kabat定義的對(duì)應(yīng)殘基具有至少85%、90%、95%或100%的一致性時(shí)，則抗體鏈的可變區(qū)框架序列或抗體鏈的恒定區(qū)其實(shí)質(zhì)上源自人的可變區(qū)框架序列或人的恒定區(qū)。
[0080] 雖然人源化抗體通常納入所有六個(gè)來(lái)自小鼠抗體的⑶Rs (優(yōu)選地，由Kabat定義)，其也可以由少于所有源自小鼠抗體的CDRs(例如至少3、4或5CDRs)制備(例如Pascalis et al., J.1mmunol.169:3076, 2002;Vajdos et al., Journal of Molecular Biology,320:415-428，2002;Iwahashi et al.，Mol.1mmunol.36:1079-1091，1999;Tamura etal,Journal of Immunology，164:1432-1441，2000)。[0081]嵌合抗體(chimeric antibody)是這樣的抗體,其中非人抗體(例如小鼠)的輕鏈及重鏈的成熟可變區(qū)與人輕鏈及重鏈恒定區(qū)組合(combined)。該抗體實(shí)質(zhì)上或完全保留該小鼠抗體的結(jié)合特異性，且具有大約三分之二的人序列。
[0082]飾面抗體(veneered antibody)是一種人源化抗體的類型,其保留非人抗體的一些及通常所有的CDRs及一些非人可變區(qū)框架殘基，但用源自人抗體序列對(duì)應(yīng)位置的殘基來(lái)取代其他可能貢獻(xiàn)B-或T-細(xì)胞表位(例如暴露的殘基)的可變區(qū)框架殘基(Padlan，Mol.1mmunol.28:489, 1991)。結(jié)果是這樣一種抗體,其⑶Rs完全或?qū)嵸|(zhì)上源自非人抗體,而該非人抗體的可變區(qū)框架由于所述取代而更似人。
[0083]人抗體(human antibodies)可以分離自人,或來(lái)自人免疫球蛋白基因的表達(dá)(如，在基因小鼠中、體外試驗(yàn)或噬菌體展示)。用于制備人抗體的方法包括三源雜交瘤方法(Oestberg et al., Hybridoma2:361-3 67 (1983)、Oestberg 的美國(guó)專利第 4, 634, 664 號(hào)、及Engleman等人之美國(guó)專利第4，634，666號(hào))、使用轉(zhuǎn)基因小鼠(該小鼠含有人免疫球蛋白基因)(見(jiàn)例如 Lonberg et al., W093/12227 (1993) ;US5, 877, 397, US5, 874, 299, US5, 814，318，US5, 789，650，US5, 770，429，US5, 661，016，US5, 633，425，US5, 625，126，US5, 569，825，US5, 545，806，Nature148, 1547-1553(1994)，Nature Biotechnologyl4, 826 (1996)，Kucherlapati, W091/10741 (1991))及噬菌體展示方法(見(jiàn)例如 Dower et al.，W091/17271 及McCafferty et al.，W092/01047, US5, 877，218，US5, 871，907，US5, 858，657，US5, 837，242，US5, 733，743 及 US5, 565，332)。
[0084]蛋白A最初是在細(xì)菌Staphylococcus aureus細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的40_60kDa的表面蛋白。蛋白A高親和力地特異性結(jié)合至人類IgGl、IgG2和IgG4的以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A不與人IgG3或IgA或IgM結(jié)合。蛋白A可用于抗體的親和純化
[0085]蛋白G是65kDa的(G148蛋白G)和58kDa的(C40蛋白G)鏈球菌細(xì)胞表面蛋白。它包含一個(gè)對(duì)于IgG結(jié)合不需要的血清白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它往往被刪除。蛋白G特異性結(jié)合所有人類IgG同種型，但非IgA或IgM。G蛋白對(duì)于抗體純化也是有用的。
【具體實(shí)施方式】
[0086]1.概要
[0087]本發(fā)明提供一種雜交恒定區(qū)與含有所述雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白。所述雜交恒定區(qū)至少包括IgG或IgA恒定區(qū)的CH2和CH3區(qū)，以及C μ恒定區(qū)的Cy3和Cy4區(qū)。所述雜交體保留了兩者組分恒定區(qū)的特性。所述雜交體保留了Cy恒定區(qū)的形成多價(jià)復(fù)合體(complexes)的能力，如五聚體或六聚體結(jié)構(gòu)(如圖17所示)。IgG雜交體也保留IgG的特性，包括PH依賴性的FcRn結(jié)合，這與相對(duì)長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期相關(guān)聯(lián)，也包括與蛋白G的特異性結(jié)合，而這利于純化。取決于同種型和亞型、抗原的實(shí)質(zhì)和額外的IgG CHl的和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的存在，IgG雜交體也保留了與蛋白A特異性結(jié)合的性能，效應(yīng)器功能ADCC，CDC和調(diào)理素作用。IgA雜交體保留了 IgA的結(jié)合于人Fe-α受體CD89 (Swiss Prot P24071)的性倉(cāng)泛。
[0088]IgG效應(yīng)器功能、相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期、易于純化及IgM的多聚化能力的結(jié)合導(dǎo)致了抗體或融合蛋白具備這些性能的新穎的組合。例如，一些這樣的抗體或融合蛋白可有效地使細(xì)胞表面上的受體或配體多聚，相對(duì)于具有IgG同種型(isotype)的抗體,這樣的抗體或融合蛋白保持甚至提高Fe Y -介導(dǎo)的性能，例如ADCC、⑶C、調(diào)理素作用、pH依賴性的FcRn結(jié)合、以及與蛋白A和蛋白G結(jié)合的能力。相比與傳統(tǒng)的IgG、IgM或IgA抗體，不同同種型的性能的組合對(duì)于治療癌癥和其他疾病提供了更大效力的可能性。
[0089]IgM抗體的多聚化能力還提供了用于制備抗體和融合蛋白的多特異性復(fù)合體的形式(format),其中，具有不同特異性的單元(units)通過(guò)IgM的恒定區(qū)之間的結(jié)合而聯(lián)系在一起。
[0090]上述的優(yōu)點(diǎn)可以不通過(guò)體外(in vitro)操作而實(shí)現(xiàn)，這不同于涉及制備核酸構(gòu)建體以用于表達(dá)雜交抗體或融合蛋白。
[0091]I1.雜交恒定區(qū)的成分
[0092]雜交恒定區(qū)包括IgG或IgA部分和Cy部分。所述IgG或IgA部分至少包括IgG或IgA的CH2和CH3區(qū)。所述CH2和CH3區(qū)至少部分地負(fù)責(zé)FcRn結(jié)合、蛋白A、G結(jié)合、ADCC，CDC和調(diào)理素作用。所述IgG部分優(yōu)選還包括鉸鏈區(qū)和/或CHl區(qū)。所述鉸鏈區(qū)提供了抗體或融合蛋白的結(jié)合區(qū)和效應(yīng)器區(qū)之間的靈活性，并有助于有效的效應(yīng)器功能如ADCC、調(diào)理素作用和⑶C。所述鉸鏈區(qū)還是將一對(duì)IgG重鏈連結(jié)在一起的二硫鍵位點(diǎn)。所述CHl區(qū)與輕鏈恒定區(qū)結(jié)合，并通常包含了多種形式(formats)，其中，具有輕鏈恒定區(qū)的輕鏈?zhǔn)谴嬖诘?，但是它也可以在融合蛋白或單鏈抗體形式(無(wú)輕鏈恒定區(qū))中被省略。根據(jù)區(qū)的Kabat劃分，IgA不具有鉸鏈區(qū)。然而，IgA中相接這些區(qū)之間的邊界的CHl和CH2的殘基提供了有效作為鉸鏈區(qū)的靈活性。CHl優(yōu)選被包含于具有抗體輕鏈恒定區(qū)的IgA融合體中，否則，所述CHl優(yōu)選被省略。
[0093]所述Cμ部分包括Cμ恒定區(qū)的Cy 3和Cy 4。Cu部分負(fù)責(zé)多聚化多個(gè)單價(jià)或二價(jià)結(jié)合單元以形成一個(gè)多價(jià)復(fù)合體。盡管本發(fā)明的實(shí)施并不要求理解機(jī)制，但我們認(rèn)為，所述雜交抗體或融合蛋白的多聚化的發(fā)生與天然IgM抗體具有類似的方式，即通過(guò)不同單體的Cy 3區(qū)之間的鏈間二硫鍵和不同單體的μ尾端之間的鏈間二硫鍵而多聚化。一些IgM抗體的多聚體還包含結(jié)合到μ尾端的J鏈。在有一個(gè)或多個(gè)J鏈時(shí)，IgM可形成五聚體結(jié)構(gòu)，在無(wú)J鏈時(shí)，IgM可形成六聚體結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道，六聚體IgM抗體比五聚體具有更強(qiáng)的CDC。對(duì)于IgM，雖然本發(fā)明的抗體和融合蛋白被認(rèn)為可以形成五聚體或六聚體，其他非五聚體或六聚體形式的更大或更小的多聚體也可以形成。
[0094]上面提及的成分從N末端到C末端的順序?yàn)?IgG或IgA CHl區(qū)(如果存在的話)、IgG鉸鏈區(qū)(如果存在的話)，IgG或IgA CH2區(qū)、IgG或IgA CH3區(qū)、Cy 3區(qū)和Cy 4區(qū)。
[0095]通常,所有的IgG或IgA區(qū)具有相同的同種型(isotype)和亞型(subtype)。也就是說(shuō)，所有的IgG區(qū)是來(lái)自IgGU IgG2、IgG3或IgG4，并且所有IgA區(qū)來(lái)自IgAl或IgA2。
[0096]優(yōu)選地，所述IgG或IgA區(qū)是人IgG或IgA區(qū)。同樣，所述C μ 3和C μ 4區(qū)優(yōu)選是人的。圖16A、B、C顯示了人IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgM重鏈恒定區(qū)的序列，成分被描述為CH1、鉸鏈、CH2、CH3、Cy 1、C μ 2、C μ 3和C μ 4和J鏈。然而，來(lái)自其他物種的區(qū)也可以被使用，包括非人靈長(zhǎng)類、駱駝科、軟骨魚(yú)，小鼠或大鼠。
[0097]提及人IgG、IgA和IgM區(qū)(即，CH1、鉸鏈、CH2、CH3、C μ 3和C μ 4)或J-鏈?zhǔn)侵杆鍪纠孕蛄小⑺鼈兊耐N異型(allotypes)或同族同種異性(isoallotypes)、或其他與示例性序列具有90、95、98或99%序列一致性的變體序列,和/或與所述示例性序列不同，不同之處在于:對(duì)于CHl、CH2、CH3、Cy 3和Cy 4和J-鏈具有至多1、2，、3、4、5、10或15個(gè)氨基酸缺失、取代或插入，對(duì)于IgGl、2或4鉸鏈區(qū)，具有1、2或3個(gè)氨基酸缺失、取代或插入，對(duì)于IgG3鉸鏈區(qū)，具有至多1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸缺失。取代若存在的話，最好是保守的。人類恒定區(qū)顯示了不同個(gè)體之間同種異型變異(allotypic variation)和同族同種異型變異(isoallotypic variation),即，在一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),恒定區(qū)可以在不同個(gè)體中不同。同族同種異型與同種異型的區(qū)別在于，識(shí)別一種同種異型的血清可以結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)其它同種型(isotype)的非多態(tài)性區(qū)域。提及人恒定區(qū)，其包括具有任何天然同種異型(包括同族同種異型)的恒定區(qū)，或包括具有占據(jù)天然同種異型中的多態(tài)位點(diǎn)的殘基的任何排列的恒定區(qū)。非人類的恒定區(qū)序列由例如Swiss-Prot or Genbank databases提供。提及非人恒定區(qū)，其同樣包括同種異型或同族同種異型變異體，和它們的排列(permutations)，或不同于天然序列的其它變異體序列。變異的范圍是由序列一致性和/或關(guān)于非人恒定區(qū)的天然序列的取代數(shù)目來(lái)定義，這類似于上述關(guān)于人恒定區(qū)的變異體。Eu編號(hào)法則用于定義同種異型間的或不同物種間的對(duì)應(yīng)位置，或用于定義突變的位置。
[0098]輕和/或重鏈的氨基或羧基末端的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，如重鏈的C-末端賴氨酸，可能丟失或部分或全部其分子被衍生化。取代可以在恒定區(qū)進(jìn)行，以減少或增加效應(yīng)器功能，例如補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或ADCC (參見(jiàn)，例如Winter et al., US PatentN0.5, 624, 821; Tso et al., US Patent N0.5, 834, 597; and Lazar et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA103:4005，2006)或以延長(zhǎng)在人類中的半衰期(見(jiàn)，例如，Hinton et al., J.Biol.Chem.279:6213，2004)示例性的取代包括在250位的Gln和/或在428位的Leu(EU編號(hào))，用以增加抗體的半衰期。234，235，236和/或237任何位置的取代會(huì)降低對(duì)于Fe Y受體的親和力，尤其是Fe Y RI受體(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6624821)。任選地，人IgG的234、236和/或237位由丙氨酸取代，及235位由谷氨酰胺取代(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5，624，821)。
[0099]如果使用鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈的一部分可以被合成的連接器取代。這融合蛋白中是經(jīng)常的，其中融合蛋白的結(jié)合區(qū)通過(guò)一個(gè)鉸鏈區(qū)連接到CH2和CH3IgG或IgA恒定區(qū)，在所述鉸鏈區(qū)中，例如高達(dá)10個(gè)N-末端殘基被合成的柔性的連接器取代。Gly-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Leu-Ala-Ala-Ala_Ala和它們的多聚體是這樣的連接器的例子。所述鉸鏈區(qū)也可以通過(guò)合成的連接器被整個(gè)取代或整個(gè)被刪除而無(wú)取代。
[0100] 一些可能的例外是如下面討論的:合成的連接器取代了部分或全部鉸鏈區(qū)、一個(gè)或一些氨基酸取代用以增強(qiáng)或抑制效應(yīng)器功能或FcRn結(jié)合、或N-末端被附加上結(jié)合區(qū)，而優(yōu)選的是，雜交恒定區(qū)僅包含上面提及的CH1、鉸鏈、CH2、CH3、C μ 3和C μ 4區(qū)，而不含其他序列。然而，其他的序列，如六組氨酸標(biāo)簽(hexa-histidine tag),可以被添加,但不是必要的。
[0101]II1.抗體的性能
[0102]上述含有雜交重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白的性能取部分決于同種型、CHl和鉸鏈(如果存在)及CH2和CH3區(qū)的亞型、是否存在CHl和/或鉸鏈區(qū)及所述抗體或融合蛋白結(jié)合的抗原的性質(zhì)。
[0103]含有雜交恒定區(qū)的抗體和融合蛋白保留了至少Cy 3和Cy 4的能力以使單價(jià)或二價(jià)單元多聚以形成更高的價(jià)，或保留了 IgG或IgA抗體的至少一種性能。當(dāng)CH1、鉸鏈(如果存在)、CH2和CH3是IgG來(lái)源的，那么所述抗體保留至少IgG樣的蛋白G結(jié)合、pH依賴性FcRn結(jié)合性能，及特異性結(jié)合靶抗原的能力。[0104]同種型或亞型的選擇取決于所需的性能。對(duì)于非雜交抗體，如果需要強(qiáng)效應(yīng)器功能(通常是針對(duì)癌細(xì)胞、病原體)，那么選擇IgGl或IgG3，如果需要弱的或不需要CDC、ADCC和調(diào)理素作用(這種情況可能是抑制受體-配體相互作用)，那么選擇gG2或IgG4。
[0105] 當(dāng)CHl和鉸鏈區(qū)(如果存在的話)、CH2和CH3區(qū)是人類IgGl，那么含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白具有以下性能:pH依賴性FcRn結(jié)合、特異性結(jié)合到蛋白A和蛋白G，并且可以具有效應(yīng)器功能，諸如取決于結(jié)合的抗原的ADCC、CDC、調(diào)理素作用。如果結(jié)合的抗原是表面受體(例如，在細(xì)胞或病毒上)，所述效應(yīng)器功能通常存在。如果所述抗原通常是可溶形式，則效應(yīng)器功能通常不針對(duì)可溶性抗原表達(dá)，但是可以通過(guò)將所述抗原以結(jié)合形式(例如，細(xì)胞表面上)表達(dá)來(lái)證明。
[0106]當(dāng)所述CHl和鉸鏈區(qū)(如果存在的話)、CH2和CH3區(qū)是人類IgG2、IgG4的，那么含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白至少具有PH依賴性FcRn結(jié)合和特異性結(jié)合到蛋白A和蛋白G的性能。人IgG2和IgG4同種型普遍缺乏⑶C。IgG4針對(duì)結(jié)合的抗原具有一定的ADCC和調(diào)理作用，但是弱于人IgGl或IgG3。
[0107]當(dāng)所述CHl和鉸鏈區(qū)(如果存在的話)、CH2和CH3區(qū)是人類IgG3，那么含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白至少顯示PH依賴性FcRn結(jié)合和特異性結(jié)合到蛋白G的性能。該抗體或融合蛋白還可能顯示效應(yīng)器功能，如ADCC、CDC、調(diào)理素作用，這取決于結(jié)合的抗原是表面抗原還是可溶的，正如IgGl的情況。
[0108]含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白如果存在CDC、ADCC或調(diào)理素作用，那么相比于可供比較的含有常規(guī)IgG恒定區(qū)的抗體或融合蛋白，所述CDC、ADCC或調(diào)理素作用的水平有時(shí)相同(在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi))或有時(shí)更聞。
[0109]IV.抗體和融合蛋白的形式(formats)
[0110]雜交恒定區(qū)可以被并入單特異性抗體、融合蛋白、以及多特異性復(fù)合體。對(duì)于單特異性抗體的表達(dá)，雜交重鏈恒定區(qū)可以鏈接到重鏈可變區(qū)，并且與包含可變區(qū)和恒定區(qū)的輕鏈一起表達(dá)。所述重鏈和輕鏈通過(guò)重鏈CHl區(qū)和輕鏈恒定區(qū)彼此結(jié)合以形成異源二聚體。二個(gè)異源二聚體然后通過(guò)鉸鏈、重鏈的IgG或IgA部分的CH2和CH3區(qū)聯(lián)合，以四聚體單元，正如常規(guī)抗體的情況。四聚體單元可以通過(guò)所述單元的重鏈恒定區(qū)的Cy部分的聯(lián)合而多聚。所述重鏈恒定區(qū)可以通過(guò)不同鏈的Cy 3區(qū)之間的二硫鍵聯(lián)合，和/或不同鏈的μ尾端之間的二硫鍵聯(lián)合。
[0111]對(duì)于單特異性單鏈抗體，重鏈和輕鏈可變區(qū)被表達(dá)為通常通過(guò)肽間隔區(qū)隔開(kāi)的同一條鏈(參見(jiàn)，例如US5，260, 203, US5869203, US6, 291，159)。肽間隔的長(zhǎng)度決定了重鏈和輕鏈可變區(qū)是否分子內(nèi)(intramolecularly)聯(lián)合形成一種單元(該單元含有一條輕鏈可變區(qū)及一條分子內(nèi)配對(duì)的重鏈可變區(qū))或分子間(intermolecularly)聯(lián)合形成四聚體單元(該四聚體單元有兩個(gè)輕鏈可變區(qū)和兩個(gè)重鏈可變區(qū)，每個(gè)輕鏈可變區(qū)分子間地結(jié)合到重鏈可變區(qū))。在兩種情況下，所述單元可以通過(guò)與重鏈可變區(qū)連接的雜交恒定區(qū)的Cy部分而多聚。通過(guò)Cu部分的二硫鍵的多聚化可以導(dǎo)致含有至少約五或六個(gè)單元的復(fù)合物的形成。
[0112]所述雜交恒定區(qū)可以用于任何類型的工程抗體(engineered antibody),包括嵌合的、人源化的、飾面的或人抗體。所述抗體可以是單克隆抗體、或基因工程化的多克隆抗體制備物(參見(jiàn)US6，986，986)。
[0113]對(duì)于融合蛋白，雜交恒定區(qū)被表達(dá)為連接至異源多肽。所述異源多肽提供了一個(gè)在恒定區(qū)的N-末端的結(jié)合區(qū)，有時(shí)也簡(jiǎn)稱為結(jié)合區(qū)。IgG或IgA的CHl區(qū)通常不包括在融合蛋白的恒定區(qū)內(nèi)。IgG鉸鏈區(qū)可以包括在內(nèi)或不被包括在內(nèi)。在一些融合蛋白中，部分或全部鉸鏈區(qū)被合成的連接器肽(linker peptide)替換,所述連接器肽賦予了融合蛋白的結(jié)合部與所述雜交恒定區(qū)之間的靈活性。
[0114]融合蛋白的結(jié)合區(qū)(binding region)可以是任何迄今為止生產(chǎn)的用于其它融合蛋白中的結(jié)合部(binding portion)的類型。結(jié)合區(qū)的實(shí)例是細(xì)胞受體的胞外結(jié)構(gòu)域,或它們的配體或反受體(例如，TNF- α受體、LFA3或IL-1受體或Trail)。
[0115]抗體和融合蛋白均可以以多特異性形式表達(dá)，即作為一個(gè)復(fù)合體，該復(fù)合體含有不同靶特異性的抗體或融合蛋白單元。個(gè)體的特異性通過(guò)恒定區(qū)的Cu部分的多聚化而相聯(lián)合。在一個(gè)復(fù)合體中的不同特異性的數(shù)目可以是，例如2、3、4、5，、6、7、8、9、10、11或12。不同特異性的單元的組合可以發(fā)生在兩個(gè)水平。在第一個(gè)水平，二價(jià)多聚化單元可以像雙特異性抗體或異源二聚體融合蛋白那樣包含兩個(gè)結(jié)合特異性。在組合的第二個(gè)水平，不同特異性的多聚化單元可以通過(guò)Cu介導(dǎo)的多聚化彼此結(jié)合。這種多聚化生成至少約五個(gè)或六個(gè)單元的復(fù)合體。
[0116]當(dāng)結(jié)合特異性的上述兩個(gè)水平聚合，本發(fā)明的方法使得至少約10個(gè)(五聚體)或12 (六聚體)的特異性結(jié)合在一個(gè)相同復(fù)合體中。雖然在許多應(yīng)用中，這個(gè)特異性的數(shù)量多于需要，但本發(fā)明的方法在特異性需求較少的應(yīng)用中提供了優(yōu)勢(shì)(例如，僅有2)。因?yàn)樵诘诙€(gè)水平中特異性被組合，統(tǒng)計(jì)學(xué)上更可能是所形成的任何復(fù)合體包括每個(gè)所需特異性的至少一個(gè)單元。相反，當(dāng)通過(guò)常規(guī)方法表達(dá)雙特異性抗體時(shí)，多特異性單元的形成會(huì)與單特異性單元的形成相競(jìng)爭(zhēng)，這導(dǎo)致抗體異質(zhì)群體，其中有些是雙特異性的，但其中有相當(dāng)多的是單特異性。
[0117]在抗體的多特異性形式中，所述單元通常包含不同的重鏈可變區(qū)。輕鏈可變區(qū)也可以是不同的。然而，也可以選擇(例如，使用噬菌體展示)含有相同輕鏈可變區(qū)的具有不同結(jié)合特異性的抗體。此類抗體可以以多特異性形式組合，其中，所述單元具有不同的重鏈可變區(qū)，但相同的輕鏈可變區(qū)。
[0118]多特異性抗體或融合蛋白可包括對(duì)于在靶標(biāo)(例如，癌細(xì)胞或病原體)上的抗原的結(jié)合特異性，也包括對(duì)于在效應(yīng)細(xì)胞(例如，T-細(xì)胞上的CD3)上的抗原的結(jié)合特異性。樣的多特異性復(fù)合體在靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞之間形成一座橋，并促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用或調(diào)理素作用活性。多特異性抗體或融合蛋白可另外或可選地包括對(duì)于在同一靶標(biāo)(例如，腫瘤細(xì)胞或病原體)上的兩個(gè)不同抗原的結(jié)合特異性。相比僅對(duì)單一抗原具有特異性的抗體或融合蛋白，這些抗體或融合蛋白對(duì)靶細(xì)胞具有更強(qiáng)的選擇性毒性。其它的多特異性抗體或融合蛋白包括對(duì)于受體和其配體或反受體的結(jié)合區(qū)。相比僅能單獨(dú)結(jié)合受體或配體/反受體的抗體或融合蛋白，這些抗體或融合蛋白可發(fā)揮更大的抑制作用。這些特異性中的任何一個(gè)和其他特異性均可組合在一個(gè)相同的多特異性復(fù)合體中。
[0119]V.基因工程和表達(dá)
[0120]含有雜交重鏈恒定區(qū)鏈的抗體或融合蛋白通過(guò)重組表達(dá)產(chǎn)生。雜交恒定區(qū)是通過(guò)將編碼IgG或IgA部分的DNA片段框內(nèi)(in-frame)融合編碼Cμ部分的DNA片段。優(yōu)選地，IgG或IgA部分的CH3外顯子的最后一個(gè)氨基酸被框內(nèi)融合到(fused in frame to)Cy 3外顯子的第一個(gè)氨基酸。編碼雜交恒定區(qū)的片段的N-末端可以被融合到編碼結(jié)合區(qū)(binding region)的DNA片段，當(dāng)是抗體的情況下,所述結(jié)合區(qū)是重鏈可變區(qū)，當(dāng)是融合蛋白的情況下，所述結(jié)合區(qū)是其他結(jié)合區(qū)(例如，一個(gè)細(xì)胞表面受體的細(xì)胞外區(qū)域)。在單鏈抗體中，編碼至少輕鏈可變區(qū)的DNA構(gòu)建體可以框內(nèi)融合編碼重鏈的片段?？蛇x地，所述輕鏈可分別表達(dá)，既可作為與重鏈相同的載體中的不同表達(dá)單元，也可作為單獨(dú)載體上的表達(dá)單元。如在常規(guī)抗體的產(chǎn)生中，編碼抗體鏈或融合蛋白的DNA片段通?？刹僮鞯卦贜-末端被連接到編碼信號(hào)肽的DNA片段，以使之分泌。
[0121]對(duì)于構(gòu)建一個(gè)編碼多種成分的構(gòu)建體，其所融合的遺傳元件的順序并不重要。例如，編碼重鏈可變區(qū)的DNA片段可以連接到編碼雜交恒定區(qū)的IgG部分的DNA，也可以連接到編碼IgM部分的DNA,或編碼雜交恒定區(qū)的片段可以首先被彼此連接(linked to oneanother first)。所述片段還可以在重疊PCR類型反應(yīng)(overlapping PCR-type reaction)中，通過(guò)加入編碼各個(gè)片段的重疊寡核苷酸被同時(shí)連接。在實(shí)踐中，一旦編碼雜交恒定區(qū)的表達(dá)載體被制備，所述同一載體可用于插入任何重鏈可變區(qū)或在融合蛋白情況下(有時(shí)是輕鏈可變區(qū))的其他結(jié)合區(qū)，而不需要再創(chuàng)建編碼雜交恒定區(qū)的DNA片段。
[0122]哺乳動(dòng)物細(xì)胞是用于表達(dá)編碼發(fā)明的抗體或融合蛋白的核苷酸片段的優(yōu)選宿主(見(jiàn) Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987))。許多能夠分泌完整異源蛋白質(zhì)的合適的宿主細(xì)胞系如今已被開(kāi)發(fā)，并包括CHO細(xì)胞系，各種COS細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，L細(xì)胞和包括SP2/0和NSO的非抗體產(chǎn)生(non-antibody-producing)骨髓瘤。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是非人的。用于產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以是或不是內(nèi)源性表達(dá)J鏈。如果內(nèi)源J鏈不被表達(dá)或表達(dá)水平不足，宿主細(xì)胞可以被遺傳修飾以表達(dá)J鏈(即，通過(guò)引入一個(gè)構(gòu)建體編碼它)。然而，也可以使用不表達(dá)J鏈的宿主細(xì)胞。帶或不帶J鏈的細(xì)胞選擇影響著所產(chǎn)生的抗體或融合蛋白的化合價(jià)(例如，帶J鏈的為五聚體，不帶J鏈的為六聚體)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或融合蛋白從單克隆細(xì)胞系中表達(dá)。
[0123]這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括:表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子(Queen et al., Immunol.Rev.89:49 (1986)),和必要的加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是來(lái)自內(nèi)源基因、巨細(xì)胞病毒、SV40，腺病毒、牛乳頭瘤病毒等的啟動(dòng)子。見(jiàn)Co et al.，J.1mmunol.148:1149(1992)。
[0124]細(xì)胞轉(zhuǎn)染了編碼所述要被表達(dá)的抗體或融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)載體。對(duì)于多鏈抗體，重鏈和輕鏈可以表達(dá)在相同或不同的載體上。為表達(dá)多特異性復(fù)合體，編碼該復(fù)合體(即，不同的抗體或融合蛋白)成分的DNA可以在相同或不同的載體上。
[0125]抗體或融合蛋白鏈被表達(dá)，加工以去除信號(hào)肽，組裝和從宿主細(xì)胞分泌。據(jù)認(rèn)為，多聚化和與J鏈聯(lián)合至少主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，由此，分泌的抗體或融合蛋白主要是多聚體，尤其是通過(guò)雜交恒定區(qū)的Cu部分將5個(gè)或6個(gè)單元聯(lián)合的多聚體。
[0126]抗體或融合蛋白可通過(guò)常規(guī)的抗體純化方法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中進(jìn)行純化。如果雜交恒定區(qū)包括IgG部分，則該純化可以包括使用蛋白A或蛋白G作為親和試劑的層析步驟。如果雜交恒定區(qū)包括IgA部分,可用Jacalin lectin親和層析法來(lái)代替。常規(guī)抗體純化方法，如離子交換，輕磷灰石色譜法或高效液相色譜法也可用(一般參見(jiàn)，Scopes, ProteinPurification(Springer-Verlag, NY, 1982))。
[0127] V1.靶標(biāo)[0128]含有雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白可以被定向于任何靶分子。所述抗體或融合蛋白尤其適用于表面結(jié)合的革巴蛋白(surface-bound target proteins)(例如,在細(xì)胞或病毒上)，其中，所述祀蛋白的團(tuán)聚(aggregation)誘導(dǎo)所需的反應(yīng)。所希望的反應(yīng)可以是，例如，清除具有靶標(biāo)的細(xì)胞或病毒、通過(guò)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制受體結(jié)合于配體或反受體，或內(nèi)在化結(jié)合有毒劑的抗體或融合蛋白。抗體或融合蛋白可以被制備成具有與現(xiàn)有的商業(yè)抗體或融合蛋白相同的靶標(biāo)，或所述抗體或融合蛋白可以是商業(yè)抗體或融合蛋白的衍生版本，其中現(xiàn)有的恒定區(qū)已被本發(fā)明的雜交恒定區(qū)取代。通過(guò)與目標(biāo)配體(該目標(biāo)配體與表面結(jié)合的抗原結(jié)合)結(jié)合，所述抗體或融合蛋白還可以直接團(tuán)聚表面結(jié)合的抗原。
[0129]為了說(shuō)明作用的一種可能的機(jī)制，本發(fā)明的對(duì)腫瘤壞死因子受體超家族的成員具有特異性的、包含雜交重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白被制備。這種受體需要三聚化來(lái)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于所述抗體是多價(jià)的(例如，五聚體或六聚體)，它可以使腫瘤細(xì)胞的表面上抗原多聚化，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和/或生長(zhǎng)停滯。這樣的多價(jià)抗體用于治療癌癥的功效可以通過(guò)小鼠異種移植模型(mouse xenograft models)或其他合適的癌癥的動(dòng)物模型來(lái)研究。
[0130]為了說(shuō)明 另一種機(jī)制，本發(fā)明的包含雜交重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白被制備，其對(duì)于免疫細(xì)胞上表達(dá)的抗原具有特異性，所述免疫細(xì)胞例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞。這樣的抗體可以使免疫細(xì)胞表面上的抗原多聚化，并觸發(fā)正?；虍惓５男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。可替換地，這樣的抗體可以觸發(fā)細(xì)胞表面抗原的內(nèi)在化。這樣的免疫細(xì)胞的功能得到增強(qiáng)或抑制，這取決于抗原、細(xì)胞類型和結(jié)合的表位，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。這樣的抗體用于治療免疫系統(tǒng)疾病的功效可以在適當(dāng)?shù)捏w外系統(tǒng)中進(jìn)行研究，或在免疫失調(diào)的動(dòng)物模型中進(jìn)行研究。
[0131]為了說(shuō)明另一種機(jī)制，包含雜交重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白被制備，其對(duì)于由病原體表達(dá)的抗原具有特異性，所述病原體如傳染性細(xì)菌、酵母、真菌或病毒。所述抗體使傳染性微生物或病毒無(wú)效(例如，通過(guò)ADCC，CDC,調(diào)理素作用，或通過(guò)抑制病原體和細(xì)胞受體之間的相互作用，或者通過(guò)體毒性部分(toxic moiety)連接到抗體的作用)。這樣的抗體用于治療傳染性疾病的功效可以在適當(dāng)?shù)捏w外系統(tǒng)中進(jìn)行研究，或在傳染的動(dòng)物模型中進(jìn)行研究。
[0132]感興趣的標(biāo)靶包括:腫瘤細(xì)胞上的受體和它們的配體或反受體(例如⑶3、⑶20、CD22、CD30、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、DR4、DR5、EGFR、CA-125/Muc_16、MCl 受體、PEM 抗原、gp72、EpCAM、Her_2、VEGF 或 VEGFR、神經(jīng)節(jié)苷脂⑶3、CEA、AFP、CTLA-4、alphaV beta3、HLA-DRlObeta、SK-1)。其它感興趣的靶標(biāo)是自身抗體或介導(dǎo)自身免疫性疾病的T-細(xì)胞亞群。其他感興趣的靶標(biāo)是生長(zhǎng)因子受體(例如，F(xiàn)GFR、HGFR、PDGFR, EFGR，NGFR和VEGFR)及其配體。其它祀標(biāo)是G-蛋白受體并包括物質(zhì)K受體(substance K receptor)、血管緊張素受體、α和β腎上腺素受體、血清素受體，和PAF受體。參見(jiàn),例如,Gilman, Ann.Rev.Biochem.56:625649(1987)。其他靶標(biāo)包括離子通道(例如，鈣，鈉，鉀通道)、毒蕈堿受體、乙酰膽堿受體、GABA受體、谷氨酸鹽受體和多巴胺受體(見(jiàn)Harpold, U.S.Pat.N0.5, 401, 629and U.S.Pat.N0.5，436，128)。其它革巴標(biāo)是粘附蛋白(adhesion proteins)如整合素、選擇素、和免疫球蛋白超家族成員(見(jiàn)Springer, Nature346:425433 (1990).0sborn, Cell62:3(1990) ;Hynes, Cell69:11 (1992) )0 其它靶標(biāo)是細(xì)胞因子，如白介素 IL-1 貫穿至最新的IL-37、腫瘤壞死因子、干擾素、和腫瘤生長(zhǎng)因子β、集落刺激因子(CSF)和粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。見(jiàn)人細(xì)胞因子:Handbook for Basic&ClinicalResearch (Aggrawal et al.eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass.1991)。其它革巴標(biāo)是淀粉樣肽(amyloidogenic peptides),如Abeta, α -突觸核蛋白或朊病毒肽。其它祀標(biāo)是激素、酶、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信使，例如，腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase)、脒環(huán)化酶(guanylcyclase)和磷脂酶C。靶標(biāo)分子可以是人類的，哺乳動(dòng)物的或細(xì)菌的。其它靶標(biāo)是抗原，如來(lái)自病毒和細(xì)菌的微生物病原體的和腫瘤的蛋白質(zhì)、糖蛋白和碳水化合物。
[0133]一些商業(yè)抗體和它們的祀標(biāo)的例子包括:alemtuzumab、0)52、rituximab、CD20、trastuzumab Her/neu、nimotuzumab、cetuximab、EGFR、bevacizumab、VEGF>palivizumab、RSV> abciximab、GpIIb/IIIa、infliximab、adalimumab、certolizumab、golimumab TNF-alpha、baciliximab、daclizumab、IL-2、omalizumab、IgE、gemtuzumab、CD33、natalizumab、VLA-4、vedolizumab alpha4beta7、belimumab、BAFF> otelixizumab、teplizumab CD3、ofatumumab、ocrelizumab CD20、epratuzumab CD22、alemtuzumumabCD52、eculizumab C5、canakimumab IL—lbeta、mepolizumab IL—5、reslizumab、tocilizumab IL-6R、ustekinumab、briakinumab IL-12, 23。商業(yè)融合蛋白的實(shí)例包括:結(jié)合TNF- α的依那西普(etanercept)、alefacept (LFA3_Fc融合體，其結(jié)合⑶2)、TAC1-Fc 融合體(其結(jié)合 BAFF 和 APRIL)、abatacept (CTLA-4-Fc，其結(jié)合 CD80and CD86)、romiplostim(與Fe融合的血小板生成素的肽類似物)。所述任何商用的抗體或融合蛋白可被修改，將現(xiàn)有的重鏈恒定區(qū)替換為本發(fā)明的雜交恒定區(qū)。另外，雜交恒定區(qū)可以被連接到與上述任何商業(yè)抗體或融合蛋白有相同靶特異性(例如，如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法測(cè)定)的其它抗體。
[0134]VI1.免疫偶聯(lián)物
[0135]抗體或融合蛋白可以偶聯(lián)于毒性劑。毒性劑可以是細(xì)胞毒性的(cytotoxic)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的(cystostatic)。毒性劑一些例子包括:抗微管蛋白劑、auristatin類、DNA小溝結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷基化劑(例如，鉬絡(luò)合物，如順鉬，單(鉬)，雙(鉬)和三核鉬絡(luò)合物和卡鉬(carboplatin))、蒽環(huán)類、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝藥、化療增敏劑、duocarmycins、喜樹(shù)堿、依托泊苷、氟化嘧唳、離子載體、lexitropsins、亞硝基脲、、platinols、預(yù)成形的化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素、放射增敏劑、類固醇、紫杉烷類、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、長(zhǎng)春花生物堿，或類似物。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)性抗體(radioconjugated antibodies)。例子包括:212B1、1311、131In、9CIY 和 186Re?？贵w，所述抗體與毒性劑的偶聯(lián)物可以使用很多多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑制備，如N-琥珀酰亞胺3-2-吡啶基二硫代)丙酸酯(STOP)、亞氨基噻吩(iminothiolane, IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(諸如dimethyl adipimidate HCl )、活性酯類(如，雙琥拍酰亞胺辛二酸酯(disuccinimidylsuberate))、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(如，對(duì)(p-疊氮苯甲?；?己二胺，bis (p-azidobenzoyl)hexanediamine)、雙-重氮衍生物(如雙(對(duì)_重氮苯甲酰基-乙二胺，bis-(p-diazonium benzoyl)-ethylenediamine)、二異氰酸酯(如甲苯 2，6_ 二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)。毒性劑也可以通過(guò)連接器(linker)連接到抗體，所述連接器可以在細(xì)胞內(nèi)的條件下被切割(US2003-0083263，2005-0238649和2005-0009751)。對(duì)于上述毒性劑，它們?cè)诩?xì)胞中內(nèi)在化(internalized)是唯一有效的或最有效的。本發(fā)明的抗體或融合蛋白可通過(guò)結(jié)合到細(xì)胞受體而被內(nèi)在化，例如，細(xì)胞受體的交聯(lián)可促進(jìn)內(nèi)在化。
[0136]VII1.治療方法和藥物組合物
[0137]本發(fā)明的抗體或融合蛋白可用于治療癌癥，這些癌癥包括上述商業(yè)抗體已被用來(lái)治療的那些。所述方法可用于治療實(shí)體瘤(solid tumors)，尤其是血液惡性腫瘤，例如白血病(例如T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞性白血病)，淋巴瘤(Hodgkin’s或Non-Hodgkin’s)，或多發(fā)性骨髓瘤。實(shí)體瘤包括皮膚的(例如黑素瘤)，卵巢的，子宮內(nèi)膜的，膀胱的，乳腺的，直腸的，結(jié)腸的，胃的，胰腺的，肺的，胸腺的，腎的和腦的。
[0138]本發(fā)明的抗體和融合蛋白也可用于抑制各種不希望的免疫應(yīng)答，包括那些在上文中提到的已經(jīng)用商業(yè)抗體抑制的。
[0139]一類可由本發(fā)明的抗體或融合蛋白治療的免疫失調(diào)是移植排斥。當(dāng)同種異體細(xì)胞或器官(例如，皮膚，腎，肝，心臟，肺，胰腺和骨髓)移植到宿主(即供體和受者是來(lái)自相同物種的不同的個(gè)體)，宿主的免疫系統(tǒng)可能針對(duì)移植體中外源抗原(宿主抗移植體疾病，host-versus-graft disease)裝載免疫應(yīng)答,這導(dǎo)致移植組織的破壞。本發(fā)明的抗體對(duì)于在受體中阻斷異體抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是特別有用的。
[0140]本發(fā)明的抗體或融合蛋白的一個(gè)相關(guān)的用途是調(diào)節(jié)涉及“移植體抗宿主(graftversus host)”病(GVHD)的免疫應(yīng)答。GVHD是潛在的致命疾病，它發(fā)生于免疫活性細(xì)胞(immunocompetent cells)被轉(zhuǎn)移到同種異體接受者時(shí)。在這種情況下,供體的免疫活性細(xì)胞可能攻擊受體中的組織。皮膚、腸上皮細(xì)胞和肝組織中是頻繁的目標(biāo)，在GVHD過(guò)程中可能被破壞。當(dāng)免疫組織被移植時(shí)，例如骨髓移植，該疾病產(chǎn)生了一個(gè)特別嚴(yán)重的問(wèn)題；但在其他情況下，包括心臟和肝臟移植，GVHD也被報(bào)道不太嚴(yán)重。
[0141]另一種需要免疫抑制的情況是治療自身免疫性疾病如I型糖尿病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、P Itiple硬化癥(μ ltiple sclerosis)、僵人綜合征(stiff man syndrome)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無(wú)力和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在這些疾病中，身體產(chǎn)生細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答來(lái)抵抗其自身抗原，這導(dǎo)致抗原的破壞和潛在的后果嚴(yán)重和/或致命的的結(jié)果。自身免疫性疾病通過(guò)施用本發(fā)明的抗體或融合蛋白中的一種來(lái)治療。
[0142]其他可被本發(fā)明的抗體或融合蛋白治療的免疫失調(diào)包括:哮喘、過(guò)敏癥、腹腔疾病(celiac disease)、牛皮癬和眼色素層炎。腹腔疾病，牛皮癬和眼色素層炎是自身免疫性疾病。
[0143] 所述抗體或融合蛋白還可以用于治療病原性感染，如病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物或真菌感染。病毒性感染的一些實(shí)例包括HIV、肝炎(A、B或C)、皰疹病毒(例如，VZV、HSV-l、HAV-6、HSV-1I, CMV和Epstein Barr病毒)、腺病毒、XMRV病毒、流感病毒、蟲(chóng)媒病毒、?？刹《?、鼻病毒、柯薩奇病毒、cornovirus、呼吸道合胞病毒、腿腺炎病毒、輪狀病毒、麻疫病毒、風(fēng)疫病毒、細(xì)小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、MLV-相關(guān)病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲(chóng)媒病毒性腦炎病毒(arboviral encephalitisvirus)。細(xì)菌性感染的一些實(shí)例包括衣原體、立克次體細(xì)菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、pneumonococc1、腦膜炎球菌和conococc1、克雷伯氏菌屬、變形桿菌、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、軍團(tuán)菌、白候桿菌、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風(fēng)、肉毒桿菌、炭疽菌、瘟疫、鉤端螺旋體、Lymes疾病細(xì)菌、鏈球菌或奈瑟氏球菌。致病性真菌的一些實(shí)例包括念珠菌、曲霉屬，隱球菌菌、組織胞漿菌、肺孢子菌和穗霉菌。原生動(dòng)物的例子包括隱孢子蟲(chóng)、賈第鞭毛蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)。
[0144] 抗體或融合蛋白以有效的方案實(shí)用意味著施用的劑量和路徑，它們可以延遲發(fā)作、降低嚴(yán)重程度、抑制進(jìn)一步惡化，和/或改善至少一種跡象或失調(diào)的癥狀。如果患者已經(jīng)經(jīng)受失調(diào)，方案(regime)可以被稱為治療上的有效方案。如果患者相對(duì)于一般群體具有提高的失調(diào)(disorder)的風(fēng)險(xiǎn)但又尚未經(jīng)歷癥狀，所述可以被稱為預(yù)防上的有效方案。在一些實(shí)例中，治療上的或預(yù)防上的功效可以相比于同一病人的歷史對(duì)照或過(guò)去經(jīng)歷而在個(gè)體患者中被觀察。在其他實(shí)例中，治療上的或預(yù)防上的功效可以相比于未經(jīng)治療的對(duì)照群體患者而在一個(gè)群體中的臨床前或臨床試驗(yàn)中證明。
[0145]示例性的抗體或融合蛋白的劑量是0.01-20,或者0.5-5,或者0.01-1,或者0.01-0.5，或 0.05-0.5mg/kg 體重(例如，0.1,0.5，1，2，3，4 或 5mg/kg)或 10-1500 毫克作為
固定劑量。劑量取決于患者狀況和對(duì)先前治療的反應(yīng)，如果有的話，治療是預(yù)防性的還是治療性的，所述失調(diào)是否為急性或慢性，及其他因素。
[0146]施用可以是腸胃外，靜脈內(nèi)，口服，皮下，動(dòng)脈內(nèi)，顱內(nèi)，鞘內(nèi)，腹膜內(nèi)，外用，鼻內(nèi)或肌內(nèi)。通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下給藥而施用到體循環(huán)是優(yōu)選的。靜脈內(nèi)給藥可以是，例如，通過(guò)輸注一段時(shí)間如30-90分鐘。
[0147]給藥頻率依賴于抗體或融合蛋白在循環(huán)中的半衰期、患者情況、給藥途徑等因素。該頻率可以是每天，每周，每月，每季度，或以不規(guī)則的間隔，這響應(yīng)于患者情況和治療的失調(diào)的進(jìn)展的變化。示例的用于靜脈內(nèi)給藥的頻率是介于每周和每季度之間經(jīng)歷一個(gè)連續(xù)的治療，盡管更多或更少的給藥頻率也是可能的。對(duì)于皮下給藥，示例性的給藥頻率為每天至每月，盡管更多或更少的給藥頻率也是可能的。
[0148]給藥劑量的數(shù)目取決于所述失調(diào)是急性或慢性的、和對(duì)于治療的失調(diào)的應(yīng)答。對(duì)于急性失調(diào)或慢性失調(diào)的急性發(fā)作，I和10之間的劑量通常是足夠的。對(duì)于急性失調(diào)或慢性失調(diào)的急性發(fā)作，有時(shí)單次推注劑量，任選地以分開(kāi)的形式，是足夠的。對(duì)于急性失調(diào)或急性發(fā)作的復(fù)發(fā)，可重復(fù)治療。對(duì)于慢性失調(diào)，抗體可以定期施用，如至少1，5年或10年內(nèi)的每周、每?jī)芍堋⒚吭?、每季、?個(gè)月，或患者的一生。
[0149]對(duì)于胃腸外給藥的藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的，基本上等滲，并在GMP條件下生產(chǎn)。藥物組合物可以以單位劑量形式(unit dosage form)來(lái)提供(即，單次給藥的劑量)。藥物組合物可以使用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或輔料進(jìn)行配制。劑型(formulation)取決于所選擇的給藥途徑。對(duì)于注射，抗體可在水溶液中配制，優(yōu)選在生理相容的緩沖液如Hank氏溶液，林格氏溶液或生理鹽水或乙酸鹽緩沖液(以減少注射部位的不適感)。該溶液可以含有配制劑(formulatory agents)如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。作為一種選擇，抗體可以是凍干形式，在使用前與合適的載體構(gòu)造，例如，無(wú)菌無(wú)熱原水。
[0150]本發(fā)明的抗體可以與有效針對(duì)所治療的失調(diào)的其他治療方法結(jié)合起來(lái)治療。對(duì)于治療免疫失調(diào)，常規(guī)治療包括:肥大細(xì)胞脫顆粒抑制劑、皮質(zhì)類固醇、非類固醇消炎藥，以及更強(qiáng)的抗炎藥物，如咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、瘤可寧、FK506和環(huán)孢菌素。生物抗炎劑，如
Tysabri? (那他珠單抗)或Humira? (阿達(dá)木單抗)，也可以被使用。當(dāng)治療癌癥時(shí)，本
發(fā)明的抗體可與化療、放療、干細(xì)胞治療、外科手術(shù)或用其它生物制劑一起使用，所述生物制劑例如針對(duì)HER2抗原的Herceptin? (曲妥珠單抗)、針對(duì)VEGF的Avastin? (貝伐單抗)、對(duì)EGF受體的抗體如Erbitux? (西妥昔單抗)和Vectibix? (帕尼單抗)。化療劑包括:苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺或苯丙氨酸氮芥、卡鉬、道諾霉素，多柔比星，伊達(dá)比星，和米托蒽醌，氨甲喋呤，氟達(dá)拉濱和阿糖胞苷，依托泊苷或拓?fù)涮婵?，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿。對(duì)于感染，治療可與抗生素、抗病毒劑、抗真菌或抗原生動(dòng)物劑或類似物一起使用。
[0151]IX.其他應(yīng)用
[0152]在臨床診斷或治療或研究的情況下，所述抗體或融合蛋白可用于檢測(cè)靶分子。例如，所述抗體可用于檢測(cè)癌癥相關(guān)的抗原，用于作為患者正經(jīng)受免疫介導(dǎo)的的并需要治療的失調(diào)的指示。該抗體也可以作為研究試劑而出售，用于檢測(cè)靶標(biāo)和對(duì)各種刺激的響應(yīng)。在這些用途中，抗體或融合蛋白可以用突光分子、自旋標(biāo)記分子、酶或radioisotypes標(biāo)記，并且可以跟與執(zhí)行測(cè)定必要的試劑一起以試劑盒的形式提供。所述抗體或融合蛋白還可以用于純化它們的靶抗原，例如，通過(guò)親和層析。
[0153]所有以上和以下引用的專利申請(qǐng)、網(wǎng)站、其出版物、注冊(cè)號(hào)等以全文引用的方式并入，其引用程度就如同將每一項(xiàng)特定且個(gè)別地以全文引用的方式并入。如果不同版本的序列在不同時(shí)期結(jié)合了不同注冊(cè)號(hào)，則所述版本及其注冊(cè)號(hào)以本申請(qǐng)的有效申請(qǐng)日為準(zhǔn)。如果適用，關(guān)于所述的注冊(cè)號(hào)，有效申請(qǐng)日意味著比實(shí)際申請(qǐng)日更早或優(yōu)先申請(qǐng)的申請(qǐng)日。同樣，如果不同版本的公開(kāi)文本、網(wǎng)站等公開(kāi)于不同時(shí)間，則以最接近本申請(qǐng)有效申請(qǐng)時(shí)間的版本為準(zhǔn)，除非另有說(shuō)明。本發(fā)明的任何功能，步驟，元件，實(shí)施例可以結(jié)合任何其他使用，除非另有說(shuō)明。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)圖示和實(shí)施例描述了本發(fā)明的一些細(xì)節(jié)，以便于清楚和理解，很明顯某些實(shí)施某些變化和修改也是在權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)的。
[0154]實(shí)施例
[0155]實(shí)施例1:表達(dá)載體
[0156]在這項(xiàng)工作中的基因克隆、形成突變和質(zhì)粒構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)。參見(jiàn) Sambrook 和 Russel(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), Kostelny et al.(Int.J.Cancer93:556-565, 2001)，和 Cole et al.(J.1mmunol.159:3613-3621，1997)，其在此引入作為參考。[0157]為了制備小鼠抗人⑶79a單克隆抗體9G6的嵌合的IgGl形式(Ch9G6_IgGl)，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCh9G6-1gGl (圖1)被構(gòu)建成包含下列基因成分。從圖1的pCh9G6-1gGl的Sal I位點(diǎn)順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng),質(zhì)粒包含重鏈轉(zhuǎn)錄單元,所述重鏈轉(zhuǎn)錄單元起始自人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(圖中的CMV-P)，以啟動(dòng)該抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV啟動(dòng)子之后是:小鼠抗-人⑶79a單克隆抗體9G6的重鏈可變區(qū)外顯子(9G6VH)(其側(cè)翼為SpeI位和HindIII位點(diǎn))，含有人Y-1重鏈恒定區(qū)的基因組序列，它包括CHl (CHl(丫1))、鉸鏈(11 ( Y 1))XH2 (CH2 (丫1))和013 (CH3 ( Y I))外顯子與插入的內(nèi)含子，和人Y-1重鏈基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。在重鏈基因序列之后，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元自CMV啟動(dòng)子(CMV-P)起始，其次是小鼠抗-人⑶79a單克隆抗體9G6的輕鏈可變區(qū)(9G6VL)外顯子(側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn))，含有人κ鏈的恒定區(qū)外顯子(CL)(它前面有一部分內(nèi)含子)，在CL外顯子后是人K鏈基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。所述輕鏈基因之后是SV40早期啟動(dòng)子(SV40-P)、大腸桿菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位點(diǎn)的片段(SV40-A)。最后，所述質(zhì)粒包含質(zhì)粒pUC19的一部分，它包括細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(pUC ori)和β內(nèi)酰胺酶基因(β內(nèi)酰胺酶)。圖中的箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。
[0158]產(chǎn)生抗-人CD79a單克隆IgG抗體9G6的小鼠雜交瘤在JN Biosciences公司(Mountain View, CA)制備，使用重組人⑶79a蛋白作為免疫原，并按照標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備。VH和VL序列通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序測(cè)定，如Tsurushita等人描述的方法(Methods36:69-83，2005)。Spe1-Hind III片段中的9G6VH基因被設(shè)計(jì)成一個(gè)外顯子，所述外顯子包括在編碼區(qū)的3’末端的剪接供體信號(hào)。包含信號(hào)肽、由PCh9G6-1gGl中VH外顯子編碼的9G6VH的氨基酸序列如下所示。成熟的9G6VH序列開(kāi)始于SEQ ID NO:1的第20位。
[0159]9G6VH 的氨基酸序列(SEQ ID NO:1):
[0160]MGWSRIFLFLLSITAGVHCQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSTSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYP ⑶⑶ TNYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSVDSAVYFCERFYYGNTFAMDYWGQGTSVTVSS
[0161]在Nhe1-EcoRI片段內(nèi)的9G6VL基因也被設(shè)計(jì)成一個(gè)外顯子，該外顯子包括在編碼區(qū)的3’末端的剪接供體信號(hào)。含有信號(hào)肽、由PCh9G6-1gGl中的VL外顯子編碼的9G6VL的氨基酸序列如下所示。成熟9G6VL序列開(kāi)始于SEQ ID NO:2的第20位。
[0162]9G6VL 的氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
[0163]MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKR
[0164]PCh9G6-1gGl中編碼的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如下所示。
[0165]在pCh9G6_IgGl中編碼的重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO: 3):
[0166]ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0167]在pCh9G6_IgGl中編碼的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如下所示。
[0168]在pCh9G6_IgGl中編碼的輕鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO:4):
[0169]TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0170]表達(dá)載體pCh9G6_IgGl被改造，以構(gòu)建新的表達(dá)載體PCh9G6_IgGl/M，以這樣的方式，編碼人μ重鏈CH3和CH4區(qū)(分別為Cy 3和Cy 4)的cDNA衍生的片段被框內(nèi)融合到(fused in frame to)pCh9G6_IgGl鉸鏈區(qū)中的最后一個(gè)氨基酸。Cy 3和Cy 4的氨基酸序列如下所示。
[0171]人μ 重鏈的 Cy 3 和 Cy 4 (SEQ ID NO:5):
[0172]DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDffNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
[0173] 在PCh9G6-1gGl/M 中，人 Y-1 重鏈的 CH2 和 CH3 外顯子被刪除。pCh9G6_IgGl的輕鏈序列并未在pCh9G6-1gGl/M中被改造。PCh9G6_IgGl/M的結(jié)構(gòu)示意圖顯示于圖1。PCh9G6-1gGl/M中編碼的重鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)從N-末端到C-末端包括:人Y -1重鏈的CHl和鉸鏈區(qū)、Cy 3和Cy 4區(qū)。的氨基酸序列如下所示。
[0174] PCh9G6-1gGl/M 中編碼的重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO:6):
[0175]
【權(quán)利要求】
1.一種包含免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的抗體或融合蛋白，所述重鏈恒定區(qū)從N-端至C-端依次包含CH2區(qū)、CH3區(qū)、C μ 3區(qū)和C μ 4區(qū)，所述CH2區(qū)或CH3區(qū)是IgG或IgA的同種型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其中所述免疫球蛋白重鏈還包含位于所述CH2區(qū)N-端的鉸鏈區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其中所述免疫球蛋白重鏈還包含位于所述鉸鏈區(qū)N-端的CHl區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或融合蛋白，其是抗體，其中所述重鏈恒定區(qū)與重鏈可變區(qū)融合，并且所述抗體進(jìn)一步包括含有輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的輕鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體，所述抗體是多特異性抗體的組分，所述多特異性抗體包含多種由權(quán)利要求4定義的抗體，所述多種抗體具有不同的重鏈可變區(qū)以及可選地，不同的輕鏈可變區(qū)；所述多種抗體通過(guò)所述Cy 3和Cy 4區(qū)集合于所述多特異性抗體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgGl的區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG2的區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG3的區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG4的區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CH1、CH2和CH3區(qū)是IgA的區(qū)。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)，并且所述C μ 3區(qū)和C μ 4區(qū)是人Cy 3和Cy 4區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其是單鏈抗體，所述單鏈抗體包含與所述重鏈恒定區(qū)連接的單鏈Fv。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，所述抗體是多特異性抗體的組分，所述多特異性抗體包含多種由權(quán)利要求12定義的單鏈抗體，其中所述多種單鏈抗體的所述單鏈Fv具有不同的VH區(qū)，并且所述多種單鏈抗體通過(guò)所述Cu 3和Cu 4區(qū)集合于所述多特異性抗體中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述單鏈Fv具有相同的VL區(qū)。
15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白是多聚體形式，所述多聚體包含一種單元的至少五個(gè)或六個(gè)拷貝，所述單元包含兩條所述重鏈和兩條所述輕鏈，所述拷貝通過(guò)所述Cy 3和Cy 4區(qū)集合于所述多聚體中。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是IgG，并且所述抗體或融合蛋白顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G、特異性結(jié)合蛋白A、表現(xiàn)出ADCC、表現(xiàn)出CDC和/或表現(xiàn)出調(diào)理素作用。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgGl的區(qū)，并且所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及特異性結(jié)合蛋白A。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體，所述抗體顯示ADCC、CDC和調(diào)理素作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgG2或IgG4的區(qū)，并且所述抗體或融合蛋白顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及特異性結(jié)合蛋白A。
20.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgG3的區(qū)，并且所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn及特異性結(jié)合蛋白G。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白顯示ADCC、CDC和調(diào)理素作用。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，若存在CHl區(qū)，所述CHl區(qū)、CH2和CH3區(qū)是人IgA，并且所述抗體與Fe α受體結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其是融合蛋白，所述融合蛋白包含與異源多肽連接的所述免疫球蛋白重鏈。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中所述異源蛋白通過(guò)例如Gly-Gly-Ala-Ala的柔性連接器與所述恒定區(qū)的所述鉸鏈連接。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，其中所述異源多肽是受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或與受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的融合蛋白，所述融合蛋白是包含多種融合蛋白的多特異性復(fù)合體的組分，所述多種融合蛋白包含不同的異源多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白是多特異性復(fù)合體，所述多特異復(fù)合體包含通過(guò)所述Cy 3和Cy 4區(qū)集合的抗體和融合蛋白。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其中所述抗體是人源化抗體、嵌合抗體、飾面抗體或人抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其是與CD79a、CD30或DR5特異性結(jié)合的抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其是包含TNF-α受體、LFA-3或IL-1受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，其是包含TRAIL蛋白的融合蛋白。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或融合蛋白，所述抗體或融合蛋白與毒性部分結(jié)合。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的抗體或融合蛋白，其中所述毒性部分是細(xì)胞毒性的。
35.包含由權(quán)利要求1定義的抗體或融合蛋白的藥物組合物。
36.一種治療癌癥的方法，所述方法包括對(duì)患有癌癥和有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的病人以有效的方案給予權(quán)利要求1所定義的抗體或融合蛋白。
37.一種治療免疫失調(diào)的方法，所述方法包括對(duì)患有免疫失調(diào)和有患免疫失調(diào)風(fēng)險(xiǎn)的病人以有效的方案給予權(quán)利要求1所定義的抗體或融合蛋白。
38.一種制備抗體和/或融合蛋白的多特異性復(fù)合體的方法，所述方法包括: a.用編碼多種由權(quán)利要求1定義的抗體和/或融合蛋白的一種或多種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述抗體和/或融合蛋白具有不同的特異性；其中所述抗體和/或融合蛋白被表達(dá)并通過(guò)所述C μ 3和C μ 4區(qū)被組裝在多特異性復(fù)合體中；及 b.從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離所述多特異性復(fù)合體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述多種抗體或多種融合蛋白中的每一種抗體或每一種融合蛋白由不同載體編碼。
40.一種包含雜交恒定區(qū)的抗體或融合蛋白，所述雜交恒定區(qū)包含N-端的IgG恒定區(qū)片段和C-端的IgM恒定區(qū)片段；其中所述抗體顯示pH依賴性結(jié)合FcRn、特異性結(jié)合蛋白G及由IgM恒定區(qū)介 導(dǎo)的多聚化，所述多聚化至少形成五聚體或六聚體。
【文檔編號(hào)】C12N15/13GK103974977SQ201280047037
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月26日
【發(fā)明者】J.·云·曹, 鶴下直哉 申請(qǐng)人:Jn生物科學(xué)有限責(zé)任公司