一種用于治療蕁麻疹的cd20嵌合抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，包括以下步驟：A、從雜交瘤細胞中擴增抗鼠CD20抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因；B、從293E細胞中擴增人抗體的輕鏈、重鏈恒定區(qū)基因；C、將經(jīng)步聚A擴增后的抗鼠CD20抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因分別與經(jīng)步聚B擴增后的人抗體的輕鏈、重鏈恒定區(qū)基因連接，得到輕鏈、重鏈CD20嵌合抗體基因；D、將步聚C中得到輕鏈、重鏈CD20嵌合抗體基因分別克隆到PTY5真核表達載體。該方法制得的CD20嵌合抗體表達后具有細胞結(jié)合活性、用于治療蕁麻疹有效安全。
【專利說明】一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及嵌合抗體，具體涉及一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]CD20是一種非糖化的細胞膜跨膜磷蛋白，它由297個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為35 X 103，表達于95%以上正?；驉夯腂細胞表面。一直被認為是B系細胞表面特有的標識。⑶20抗原的表達嚴格限制在前B淋巴細胞的晚期和成熟B淋巴細胞，在造血干細胞、祖細胞和其它正常組織中無CD20抗原的表達。當B淋巴細胞分化為分泌抗體的漿細胞時，⑶20抗原的表達也隨之消失。人與鼠的⑶20同源性可達73%。雖然⑶20的功能仍沒有完全闡述清楚，但目前研究發(fā)現(xiàn)，CD20抗原是信號傳導復合物的一部分，其功能類似于鈣離子通道，參與調(diào)節(jié)B淋巴細胞的生長和分化，具體的作用包括抑制B細胞從Gl期進入S/G2+M期；動員胞內(nèi)的鈣儲存庫使鈣離子濃度升高；激活酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，使caspase活化。⑶20與抗⑶20抗體結(jié)合后內(nèi)化現(xiàn)象不明顯，因此細胞表面⑶20分子數(shù)量并不因為與抗體結(jié)合而大量減少。CD20也不會發(fā)生明顯細胞表面脫落的現(xiàn)象，在人體血清中無游離的CD20存在。因此CD20抗原是B細胞靶向治療的理想作用位點?，F(xiàn)在已將抗CD20單克隆抗體(mAb)以B細胞表面分子CD20為靶向，用于治療B細胞淋巴瘤，具有療效。
[0003]慢性蕁麻疹是一 種常見皮膚病，目前治療效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種表達后具有細胞結(jié)合活性、有效安全的用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法。
[0005]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn):
一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述用于治療蕁麻疹的⑶20嵌合抗體包括以下步驟::
A.從雜交瘤細胞中擴增抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因；
B.從293E細胞中擴增人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因和重鏈恒定區(qū)基因；
C.將經(jīng)步聚A擴增后的抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因、重鏈可變區(qū)基因分別與經(jīng)步聚B擴增后的人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因、重鏈恒定區(qū)基因連接，得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈⑶20嵌合抗體基因；
D.將步聚C中得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因分別克隆到PTY5真核表達載體。
[0006]本發(fā)明進一步的改進方案包括:
所述步聚A的具體方法是:以雜交瘤細胞的cDNA為模板，用引物\-F和'-R擴增輕鏈可變區(qū)基因，用引物Vh-F和Vh-R擴增重鏈可變區(qū)基因，其中Vl-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatggattttcaggtgcagattatc-3’，為 FcoRI 酶切位點， Vl-R 的基因序列:5’ -CCTCCGAAtttgatttccagcttggtcccc-3’ ,為重疊片段,
Vh-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatgggttggagcctcatcttgc-3’，為 AcoRI 酶切位點，
Vh-R的基因序列:5’ -(XTTGGtXa職職cggt職ccgtcccttr-3’ ,為重疊片段；
所述步聚B的具體方法是:以293E細胞的cDNA為模板，用引物CfF和CfR擴增輕鏈恒定區(qū)基因，用引物Ch-F和Ch-R擴增重鏈恒定區(qū)基因，其中
Cl-F 的基因序列:5’ -AAATCAAAttcRRaRRRRRRaccaaRRtR-S'，為重疊片段,
Cl-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcaacactctcccctgttgaag-3’，為 BamWl 酶切位點，
Ch-F 的基因序列:5，_CCGTCTGTRRCC￡l￡lRRR￡lCC￡lCRRtC￡lC—,為重疊片段，
Ch-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcatttacccggagacagggag-3'，為 BamWl 酶切位點。
[0007]所述步聚C中通過重疊延伸PCR技術(shù)實現(xiàn)擴增后的輕鏈可變區(qū)基因和擴增后的輕鏈恒定區(qū)基因的連接，以及實現(xiàn)擴增后的重鏈可變區(qū)基因和擴增后的重鏈恒定區(qū)基因的連接。
[0008]所述步聚D的具體方法為:將輕鏈基因、重鏈基因分別用內(nèi)切酶EcoR1、內(nèi)切酶BamHI進行雙酶切，分別克隆到用同樣酶進行雙酶切的載體pTY5中，構(gòu)建成重組表達載體，輕鏈基因、重鏈基因構(gòu)建成的重組表達載體分別為ρΤΥ5-⑶20Η和ρΤΥ5-⑶20L。
[0009]所述雜交瘤細胞的cDNA和所述293Ε細胞的cDNA通過下述方法得到:分別提取雜交瘤細胞和293E細胞的細胞RN`A，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，_20°C保存。
[0010]所述⑶20嵌合抗體通過protein A柱親和層析,得到高純度的抗⑶20嵌合抗體。
[0011]所述雜交瘤細胞培養(yǎng)于改良型快速雜交瘤細胞培養(yǎng)基中；所述293E細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清和雙抗；雜交瘤細胞和293E細胞均培養(yǎng)于37°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:篩選獲取抗CD20單克隆細胞株的基礎(chǔ)上，擬克隆其重鏈和輕鏈的基因片段，構(gòu)建重組真核表達載體，并最終表達、純化，表達的抗體具有細胞結(jié)合活性，治療蕁麻疹安全有效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是PCR電泳圖，
其中:1:VL 384bp ；2:CL 324bp ；3:VH 420bp ；4:CH 314bp ；
5:VL + Cl 708bp ；6:VH + Ch 734bp。
[0014]圖2是^boR1、fe?HI雙酶切電泳圖；
M: λ -EcoT14 I digest DNA Marker ；1:pTY5_CD20H ；2:pTY5_CD20L。
[0015]圖3是PCR鑒定圖；
I:VL + Cl 708bp ；2:VH + Ch 734bp。
[0016]圖4是SDS-PAGE檢測抗體圖。
[0017]圖5是表達抗體的流式細胞術(shù)檢測圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法作進一步描述:
實施例1:
A、引物設(shè)計設(shè)計合成針對鼠輕、重鏈可變區(qū)序列的引物；設(shè)計合成針對輕、重鏈恒定區(qū)的引物。
[0019]Vl-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatggattttcaggtgcagattatc-3’ ,為 FcoRI 酶切位點，
Vl-R 的基因序列:5’ -CCTCCGAAtttgatttccagcttggtcccc-3’ ,為重疊片段,
Vh-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatgggttggagcctcatcttgc-3’，為 AcoRI 酶切位點，
Vh-R的基因序列:5’ -(XTTGGtXa職職cggt職ccgtcccttr-3’ ,為重疊片段；
Cl-F 的基因序列:5’ -AAATCAAAttcRRaRRRRRRaccaaRRtR-S'，為重疊片段,
Cl-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcaacactctcccctgttgaag-3’，為 BamWl 酶切位點，
Ch-F 的基因序列:5，_CCGTCTGTRRCC￡l￡lRRR￡lCC￡lCRRtC￡lC—,為重疊片段，
Ch-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcatttacccggagacagggag-3'，為 BamWl 酶切位點。
[0020]其中輕鏈可變區(qū)基因；Cf-輕鏈恒定區(qū)基因；VH—重鏈可變區(qū)基因；CH—重鏈恒定區(qū)基因。
[0021]B、細胞培養(yǎng)雜交瘤細胞培養(yǎng)于改良型快速雜交瘤細胞培養(yǎng)基中；293E細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，NS-1細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，均含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清和雙抗；培養(yǎng)于37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱內(nèi)含有體積分數(shù)為5%的C02。
[0022]C、RNA提取與cDNA合成分別收集雜交瘤細胞和293E細胞，按TRIZOL的說明書進行提取細胞總RNA，測OD和電泳檢測RNA質(zhì)量，按RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，保存于-20°C備用。
[0023]D、抗體輕、重鏈基因的調(diào)取與克隆以來源于雜交瘤細胞的cDNA為模板，用引物Vl-F和VfR、Vh-F和Vh-R分別擴增輕、重鏈可變區(qū)基因；以來源于293E細胞的cDNA為模板，用引物Q-F和Q-R、Ch-F和Ch-R分別擴增輕、重鏈恒定區(qū)基因。上述序列測序驗證正確后，通過重疊延伸PCR技術(shù)，連接可變區(qū)和恒定區(qū)，得到完整抗體基因，結(jié)果如圖1所示，擴增大小正確，測序驗證后，序列顯示為抗體基因。再次測序驗證，然后將輕、重鏈基因用內(nèi)切酶feoR1、分別進行雙酶切，分別克隆到用同樣酶進行雙酶切的載體pTY5中，結(jié)果如圖2所示，克隆到表達載體后，雙酶切鑒定無誤。測序結(jié)果顯示，所克隆片段為鼠輕鏈可變區(qū)加人輕鏈恒定區(qū)，所調(diào)取抗體恒定區(qū)輕鏈為K型；另一片段為鼠重鏈可變區(qū)加人重鏈恒定區(qū)，所調(diào)取抗體恒定區(qū)重鏈為IgGl型。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細胞，于平板(氨芐抗性)37°C過夜培養(yǎng)后，分別挑取單克隆菌株鑒定測序。構(gòu)建好的重組表達載體分別命名為PTY5-CD20H 和 pTY5-CD20L。
[0024]E、轉(zhuǎn)染和鑒定轉(zhuǎn)染前一天接種細胞:用胰酶消化293E細胞后，調(diào)細胞濃度為
2.5X IO5個/ml，每孔1.0 ml接種24孔板，置37。。含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞貼壁生長達到底面積70%。轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000說明書進行，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為I μ g，培養(yǎng)4小時后更換DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后收集細胞提取RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR鑒定抗體基因轉(zhuǎn)錄情況。PCR結(jié)果如圖3所示，顯示能特異擴增目的片段。這說明攜帶抗體輕、重鏈基因的表達載體成功轉(zhuǎn)染進293E細胞，并能表達抗體基因。
[0025]F、蛋白表達純化及初步測定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293E細胞，搖瓶培養(yǎng)，4一7天收獲培養(yǎng)基上清，PiOteinA柱純化抗體。操作方法參照說明書進行，純化后用分光光度計測OD值推算濃度，以SDA-PAGE測定蛋白的純度、分子量，在還原條件下的SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示，顯示有2條帶，分子量約為23kDa和51kDa，與設(shè)計的輕重鏈分子量相符合，表明成功獲得了蛋白質(zhì)為IgGl型的完整抗體分子。[0026]G、嵌合抗體表達的ELISA檢測以羊抗人κ多抗于4°C包被酶標板過夜,用含1%BSA的PBST在37°C進行封閉2小時。分別加入嵌合抗體的表達上清和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的上清，以人IgG參考品作為陽性對照。37°C孵育30min后用PBST洗5次，再加入HRP標記的羊抗人Fe抗體，37°C孵育30min后用PBST洗5次。再加入TMB顯色，酶標儀讀取450/630雙波長讀數(shù)。轉(zhuǎn)染3天后，夾心ELISA測定上清中嵌合抗體的含量，通過與陽性參考品比較，上清中抗體的含量在15-24 ng/ml之間。
[0027]H、流式細胞術(shù)檢測抗體結(jié)合活性收集NS-1細胞，每管5 X IO5個，用PBS洗一遍，離心收集細胞；各管加表達抗體，室溫反應I小時，設(shè)置陰性對照；離心收集細胞，用PBS洗一遍，加二抗FITC-羊抗小鼠IgG (1:500)，室溫避光反應I小時；離心收集細胞，用PBS洗一遍，各管用300 μ I PBS重懸，上機檢測；流式檢測結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染了嵌合基因的細胞培養(yǎng)上清能與NS-1細胞結(jié)合，具有親本鼠源抗體結(jié)合效果。這表明所表達的嵌臺抗體具有正確的抗原結(jié)合特性，井且含有人抗體恒定區(qū)序列。
[0028]本實施例成功構(gòu)建了含鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)的嵌合抗體基因，在293Ε細胞中進行瞬時表達后，RT-PCR顯示抗體基因在細胞中進行了成功的轉(zhuǎn)錄，表明CD20嵌合抗體具有細胞結(jié)合活性，治療蕁麻疹安全有效，ELISA測定抗體表達量在15-24 ng/ml之間，流式檢測結(jié)果證實細胞上清分泌的抗⑶20嵌合抗體可與NS-1細胞株結(jié)合,并通過protein A柱親和層析獲取高純度的抗CD20嵌合抗體，可用于進一步研究抗CD20單克隆抗體治療慢性蕁麻疹的作用機制。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 從雜交瘤細胞中擴增抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因； 從293E細胞中擴增人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因和重鏈恒定區(qū)基因； 將經(jīng)步聚A擴增后的抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因、重鏈可變區(qū)基因分別與經(jīng)步聚B擴增后的人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因、重鏈恒定區(qū)基因連接，得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈⑶20嵌合抗體基因； 將步聚C中得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因分別克隆到PTY5真核表達載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述步聚A的具體方法是:以雜交瘤細胞的cDNA為模板，用引物\-F和'-R擴增輕鏈可變區(qū)基因，用引物Vh-F和Vh-R擴增重鏈可變區(qū)基因，其中 Vl-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatggattttcaggtgcagattatc-3’，為 FcoRI 酶切位點， Vl-R 的基因序列:5’ -CCTCCGAAtttgatttccagcttggtcccc-3’ ,為重疊片段, Vh-F 的基因序列:5’ -CGGAATTCatgggttggagcctcatcttgc-3’，為 AcoRI 酶切位點， Vh-R的基因序列:5’ -(XTTGGtXa職職cggt職ccgtcccttr-3’ ,為重疊片段； 所述步聚B的具體方法是:以293E細胞的cDNA為模板，用引物CfF和CfR擴增輕鏈恒定區(qū)基因，用引物Ch-F和Ch-R擴增重鏈恒定區(qū)基因，其中 Cl-F 的基因序列:5’ -AAATCAAAttcRRaRRRRRRaccaaRRtR-S'，為重疊片段, Cl-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcaacactctcccctgttgaag-3’，為 BamWl 酶切位點， Ch-F 的基因序列:5，_CCGTCTGTRRCC￡l￡lRRR￡lCC￡lCRRtC￡lC—,為重疊片段， Ch-R 的基因序列:5’ -CGGGATCCtcatttacccggagacagggag-3'，為 BamWl 酶切位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述步聚C中通過重疊延伸PCR技術(shù)實現(xiàn)擴增后的輕鏈可變區(qū)基因和擴增后的輕鏈恒定區(qū)基因的連接，以及實現(xiàn)擴增后的重鏈可變區(qū)基因和擴增后的重鏈恒定區(qū)基因的連接，得到⑶20嵌合抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述步聚D的具體方法為:將輕鏈基因、重鏈基因分別用內(nèi)切酶EcoR1、內(nèi)切酶BamHI進行雙酶切，分別克隆到用同樣酶進行雙酶切的載體pTY5中，構(gòu)建成重組表達載體，輕鏈基因、重鏈基因構(gòu)建成的重組表達載體分別為ρΤΥ5-⑶20Η和ρΤΥ5-⑶20L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述雜交瘤細胞的cDNA和所述293Ε細胞的cDNA通過下述方法得到:分別提取雜交瘤細胞和293E細胞的細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，_20°C保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述⑶20嵌合抗體通過protein A柱親和層析,得到高純度的抗⑶20嵌合抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于:所述雜交瘤細胞培養(yǎng)于改良型快速雜交瘤細胞培養(yǎng)基中；所述293E細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清和雙抗；雜交瘤細胞和293E細胞均培養(yǎng)于37°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中CO2的體積濃度為5%。
【文檔編號】C07K16/46GK103525823SQ201310477885
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】朱慧蘭, 李潤祥, 梁碧華, 李振潔, 龔業(yè)青, 馬少吟, 高愛莉 申請人:朱慧蘭