在存在甲酸的情況下產(chǎn)生含卟啉多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的組合物和方法涉及在深層培養(yǎng)物中產(chǎn)生多肽，具體地講在存在甲酸的情況下通過微生物發(fā)酵大規(guī)模產(chǎn)生含卟啉多肽，如過氧化氫酶。
【專利說明】在存在甲酸的情況下產(chǎn)生含卟啉多肽
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002] 本專利申請要求2011年11月28日提交的美國臨時專利申請N0.61/564，232的優(yōu)先權(quán)，該專利申請全文據(jù)此以引用的方式并入。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的組合物和方法涉及在深層培養(yǎng)液中產(chǎn)生多肽，具體地講涉及通過微生物發(fā)酵大規(guī)模產(chǎn)生含B卜啉多肽。
【背景技術(shù)】
[0004]微生物表達的多肽用于多種工業(yè)和家庭應(yīng)用，包括紡織物處理、織物護理、乙醇制備、釀造和烘焙等等。多肽通常以穩(wěn)定的干燥或液體制劑提供給最終用戶，以保持其活性。
[0005]一些微生物表達的多肽包含卟啉，即由與金屬原子例如鐵、鎂、銅、鎳、鈷、鑰和釩配位的四個互相連接修飾的吡咯亞基構(gòu)成的雜環(huán)大環(huán)。含卟啉多肽可用甲酸穩(wěn)定，甲酸通常作為制劑成分加入到多肽中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的組合物和方法涉及在存在甲酸的情況下從深層培養(yǎng)液中培養(yǎng)的真菌細胞中產(chǎn)生含卟啉多肽。
[0007]在一個方面，提供了用于在宿主細胞中產(chǎn)生含卟啉多肽的方法，該方法包括:使產(chǎn)生含卟啉多肽的宿主細胞在合適的培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生發(fā)酵液；向發(fā)酵液加入有效量的甲酸；以及回收所產(chǎn)生的含卟啉多肽；其中與在不存在甲酸的情況下使相同宿主細胞在等同培養(yǎng)基中生長相比，發(fā)酵液中存在甲酸增加了含卟啉多肽的活性、穩(wěn)定性或表達水平。
[0008]在一些實施例中，在加入甲酸之前，使宿主細胞生長到補料分批階段。在一些實施例中，在加入甲酸之前，宿主細胞的生長基本上完成。在一些實施例中，在加入甲酸之前，使宿主細胞生長到準備誘導(dǎo)產(chǎn)生含卟啉多肽的階段。在一些實施例中，培養(yǎng)基包含葡萄糖，并且在加入甲酸之前，葡萄糖基本上已被宿主細胞耗盡。
[0009]在一些實施例中，發(fā)酵液中甲酸的濃度小于或等于約2.0克甲酸/千克發(fā)酵液。在一些實施例中，發(fā)酵期間加入的甲酸的累積量為約0.007至約1.35摩爾甲酸/千克(kg)發(fā)酵液。在一些實施例中，所加入的甲酸的量為約0.03至約7.1毫摩爾甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克發(fā)酵液。在一些實施例中，所加入的甲酸的量為約40至約4400毫摩爾甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克底物干燥固體。在一些實施例中，所加入的甲酸的量為約50至約7500摩爾甲酸/摩爾活性含卟啉多肽。
[0010]在一些實施例中，甲酸是甲酸的形式。在一些實施例中，甲酸是甲酸鹽的形式。在一些實施例中，甲酸是甲酸鈉的形式。
[0011]在一些實施例中，宿主細胞是真菌細胞。在一些實施例中，宿主細胞是絲狀真菌細胞。在一些實施例中，宿主細胞是木霉屬(Trichoderma)細胞。[0012]在一些實施例中，含卟啉多肽是含血紅素多肽。在一些實施例中，含卟啉多肽是過
氧化氫酶。
[0013]在另一個方面，提供了通過任何所述方法產(chǎn)生的含卟啉多肽。在一些實施例中，含卟啉多肽是過氧化氫酶。
[0014]通過本發(fā)明的描述和附圖，所述組合物和方法的這些方面和其他方面以及實施例將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是曲線圖，示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中細胞發(fā)酵液中存在的過氧化氫酶活性的量隨時間而變化。
[0016]圖2是曲線圖，示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中細胞發(fā)酵液中產(chǎn)生的總蛋白量隨時間而變化。
[0017]圖3是曲線圖，示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中細胞發(fā)酵液中存在的針對總蛋白生成量歸一化的過氧化氫酶活性的量隨時間而變化。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明的組合物和方法涉及在存在甲酸或甲酸鹽(本文統(tǒng)稱為“甲酸”)的情況下在深層培養(yǎng)液中生長的真菌細胞中產(chǎn)生含卟啉多肽。甲酸是含卟啉多肽的已知穩(wěn)定劑，其通常加入到從細胞與碎 片分離后回收的多肽中。雖然一些細菌可在存在甲酸的情況下生長，但甲酸是熟知的殺真菌劑，通常不加入到真菌細胞的深層培養(yǎng)物中。
[0019]已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在真菌發(fā)酵的補料分批階段，大多數(shù)或所有細胞生長發(fā)生之后，可將甲酸加入到發(fā)酵液(即含細胞的培養(yǎng)基)中。發(fā)酵的補料分批階段是指細胞已基本上消耗初始培養(yǎng)基中的一些營養(yǎng)物質(zhì)(如，葡萄糖)，并且必須提供額外的營養(yǎng)物質(zhì)以維持其代謝的時間。此時，通常誘導(dǎo)細胞生成所關(guān)注的蛋白質(zhì)，例如通過補加誘導(dǎo)劑[如，2-0- β -吡喃葡萄糖基-D-葡萄糖(槐糖)、異丙基-β -D-硫代-半乳糖苷(IPTG)等等]來誘導(dǎo)，具體取決于特定生物體和基因構(gòu)造。此發(fā)酵階段存在甲酸似乎不影響細胞活力，如蛋白質(zhì)生成速率所證實的那樣。然而，發(fā)酵期間存在甲酸確實增加了活性含卟啉多肽的產(chǎn)率，可能是在多肽生成時即將其穩(wěn)定。這樣，含卟啉多肽可在低成本和高滴定度下生成。
[0020]設(shè)想了將本發(fā)明的組合物和方法與多種不同的含卟啉多肽一起使用。示例性多肽是所關(guān)注的內(nèi)源性或外源性蛋白，特別是酶或結(jié)合蛋白質(zhì)。示例性含卟啉多肽包括但不限于:血紅蛋白、肌紅蛋白、氧化酶、過氧化物酶、加氧酶、血藍蛋白、葉綠素、細胞色素、鈷胺素、有機磷水解酶和過氧化氫酶。此類酶通常包含卟啉-金屬絡(luò)合物，最常見基于鐵、鎂和銅，但也可與鎳、鋅、鈷、鑰和釩配位。一些多肽包含與特定配位金屬締合的基于卟啉的輔基，例如:血紅素(鐵)、葉綠素(鎂)、血藍蛋白(銅)和鈷胺素(鈷)。用于示出本發(fā)明的組合物和方法的特定含卟啉多肽是來源于黑曲霉(Aspergillis niger)的過氧化氫酶。過氧化氫酶是具有配位鐵的含血紅素多肽。
[0021]還設(shè)想了將組合物和方法與多種不同的宿主細胞和發(fā)酵培養(yǎng)基一起使用。在一些實施例中，宿主細胞是真菌細胞，包括酵母和絲狀真菌細胞。酵母的例子包括但不限于:釀酒酵母菌種(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母菌種(Schizosaccharomyces spp.)、兩型子囊酵母菌種(Arxula spp.)、假絲酵母菌種(Candida spp.)、漢遜酵母菌種(Hansenulaspp.)、克魯維酵母菌種(Kluyveromyces spp.)、畢赤酵母菌種(Pichia spp.)或耶氏酵母菌種(Yarrowia spp.)。絲狀真菌的例子包括但不限于:木霉菌菌種(Trichodermaspp.)、曲霉菌菌種(Aspergillus spp.)、鐮刀菌菌種(Fusarium spp.)、賽多孢菌菌種(Scedosporium spp.)、青霉菌菌種(Penicillium spp.)、金抱子菌菌種(Chrysosporiumspp.)、頭孢霉菌菌種(Cephalosporium spp.)、籃狀菌菌種(Talaromyces spp.)、白喬史密斯霉菌菌種(Geosmithia spp.)、毀絲霉菌菌種(Myceliophthora spp.)和脈抱菌菌種(Neurospora spp.)。具體的絲狀真菌細胞包括但不限于:里氏木霉(Trichodermareesei)(之前歸類為長梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)和紅褐肉座菌(Hypocreajecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、分解烏頭酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育賽多抱(Scedosporium prolificans)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)、繩狀青霉(Penicillium funiculosum)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、埃默森籃狀菌(白喬史密斯霉)(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、產(chǎn)毒德刀菌(Fusarium venenatum)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)和勒克瑙金抱子菌(Chrysosporium Iucknowense)。[0022]在其他實施例中，宿主細胞是細菌細胞，之前尚不知其可在存在甲酸的情況下生長。合適的細菌細胞的例子包括但不限于:革蘭氏陽性細菌例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱脂肪土芽抱桿菌(GeobacillusstearothermophiIus)、嗜減芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)或變鉛青鏈霉菌(StreptomycesIividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(E.coli)。在又一個實施例中，宿主細胞是植物細胞例如藻類，或動物細胞例如昆蟲或哺乳動物細胞。
[0023]優(yōu)選地，使宿主細胞在容器或生物反應(yīng)器中的深層液體培養(yǎng)物中生長(即，“發(fā)酵”)。培養(yǎng)可以是分批或連續(xù)種類，并且可以是有氧的或厭氧的。含卟啉多肽可作為細胞內(nèi)多肽或作為分泌多肽(即，使用合適的信號序列)表達，以簡化回收。示例性異源信號序列來自地衣芽孢桿菌淀粉酶(LAT)、來自枯草芽孢桿菌(AmyE或AprE)以及來自鏈霉菌(Streptomyces)CelA0
[0024]具體的細胞培養(yǎng)基取決于所選擇的宿主細胞。用于真菌生長的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是熟知的。培養(yǎng)基的PH可能必須在甲酸加入到細胞發(fā)酵液之后調(diào)整。引入甲酸的時間優(yōu)選地在真菌細胞生長完成、或基本上完成(即，基于細胞質(zhì)量計至少80%、至少85%、至少90%或甚至至少95%完成)時，并且細胞已準備好誘導(dǎo)，以生成所需的含卟啉多肽。在一些情況下，在培養(yǎng)基中存在的葡萄糖的初始量基本上耗盡(即，至少80%、至少85%、至少90%或甚至至少95%耗盡)時引入甲酸?？蓪⒓姿徇B續(xù)或不連續(xù)補加至發(fā)酵液中，以維持預(yù)選擇的目標甲酸水平。然而，維持精確的預(yù)選擇甲酸水平據(jù)信是不必要的。
[0025]選擇發(fā)酵期間加入到細胞發(fā)酵液中的甲酸的量(即，“有效量”)，以使活性含卟啉多肽的產(chǎn)率最大化，同時避免大幅降低細胞活力的甲酸水平，所述細胞活力可根據(jù)蛋白質(zhì)表達、氧氣或營養(yǎng)物質(zhì)消耗、PH等等測量。不受理論的限制，據(jù)信甲酸結(jié)合含卟啉多肽的氧化形式，并且將它們還原為穩(wěn)定形式。然而，甲酸也會被細胞降解和代謝，因此發(fā)酵液中甲酸的水平將變化。在一些情況下，細胞發(fā)酵液中甲酸的量可能幾乎檢測不到。
[0026]一般來講，發(fā)酵期間維持的甲酸的量最多至(即，小于或等于)約2.0克(g)甲酸/千克(kg)發(fā)酵液，優(yōu)選地最多至約0.5g甲酸/kg發(fā)酵液。示例性量是不可檢測的，
0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 和
2.0g甲酸/kg發(fā)酵液。
[0027]發(fā)酵期間加入的甲酸的累積量可表示為約0.007至約1.35摩爾甲酸/千克(kg)發(fā)酵液，優(yōu)選地約0.033至約0.41摩爾甲酸/kg發(fā)酵液。示例性量為約0.01、0.03、0.05、
0.07,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1、1.2 和 1.3 摩爾甲酸 /kg 發(fā)酵液。
[0028]所用的甲酸的量也可表示為毫摩爾(mmol)甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克發(fā)酵液(mmol甲酸/hr/kg),通常為約0.03至約7.1mmol甲酸/hr/kg,優(yōu)選地約0.20至約
2.1mmol 甲酸 /hr/kg。示例性量為約 0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90,1.0、
1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 和 2.1mmol 甲酸/hr/kg。
[0029]所用的甲酸的量也可表示為毫摩爾甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克加入發(fā)酵罐的底物(如，葡萄糖、甘油等)干燥固體(mmol甲酸/hr/kg補加的干燥固體)，通常為約40至約4400mmol甲酸/hr/kg補加的干燥固體,優(yōu)選地約172至約1320mmol甲酸/hr/kg補加的干燥固體。示例性量為約 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 和 1200mmoI甲酸/hr/kg補加的干燥固體。
[0030]所用的甲酸的量也可表示為摩爾甲酸/摩爾活性含卟啉多肽(摩爾甲酸/摩爾多肽)，通常為約50至約7500摩爾甲酸/摩爾多肽，優(yōu)選地約250至約2260摩爾甲酸/摩爾多肽。示例性量為約 300、500、700、900、1100、1300、1500、1700、1900 和 2100 摩爾甲酸 / 摩
爾多肽。
[0031]甲酸可以甲酸或甲酸鹽例如鈉鹽或鉀鹽的形式提供。在一些實施例中，在含卟啉多肽從發(fā)酵液回收之后，無需加入額外的甲酸來穩(wěn)定含卟啉多肽。在其他實施例中，可加入額外的甲酸或其他穩(wěn)定制劑成分。
[0032]本發(fā)明的組合物和方法的特性是，與在不存在甲酸的情況下使相同宿主細胞在等同培養(yǎng)基中生長相比，發(fā)酵液中存在甲酸增加了含卟啉多肽的活性、穩(wěn)定性或表達水平?？梢岳缤ㄟ^測量細胞發(fā)酵液中含卟啉多肽的量或活性來確定此類增加值，其測量值可任選地針對總蛋白進行歸一化。在一些實施例中，增加值為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%或甚至至少30%。
[0033]本發(fā)明的組合物和方法還通過如下實例示出，這些實例在任何情況下都不旨在限制本發(fā)明。
[0034]SM
[0035] 實例1:在存在或不存在甲酸的情況下產(chǎn)生過氧化氫酶
[0036]使用在存在或不存在甲酸的情況下生長的產(chǎn)生過氧化氫酶的宿主細胞，來進行中試規(guī)模發(fā)酵。宿主細胞是工程化為表達黑曲霉過氧化氫酶的里氏木霉細胞，如W02009/114380 (US2009223508)中所描述，該專利據(jù)此以引用方式并入。培養(yǎng)基條件基本上如所描述，初始PH為約3.5，當初始量的葡萄糖耗盡并且在補料分批階段開始補料時，該pH升至約4.25。每批重量為約IOkg (大約10升(L))。
[0037]在生長培養(yǎng)物中的葡萄糖耗盡時，不給細胞補加甲酸(作為對照)、補加0.62mmol甲酸/小時/kg發(fā)酵液、0.88mmol甲酸/小時/kg發(fā)酵液、0.68mmol甲酸鈉/小時/kg發(fā)酵液或0.71mmol甲酸鈉/小時/kg發(fā)酵液。以定期而非連續(xù)的方式將甲酸補加到培養(yǎng)基中，只因為泵的最小加料速率不允許連續(xù)加料。發(fā)酵液中甲酸的實際水平由HPLC來測量，并且在不可檢測和0.8g/kg之間變化。
[0038]圖1示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中發(fā)酵液中存在的過氧化氫酶活性(即，“發(fā)酵液活性”)的量隨時間而變化。過氧化氫酶活性是使用Amplex Red/HRP測定法(美國加利福尼亞州卡爾斯巴德生命技術(shù)公司(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA))來測量的，并且報告為歸一化的單位過氧化氫酶活性，所述歸一化是由針對對照I (無甲酸)的最終過氧化氫酶活性值進行的。也可使用Baker過氧化氫酶測定法(如W02009/114380(US2009223508)中所描述)或通過其他方法來測量過氧化氫酶活性。在存在甲酸或甲酸鈉的情況下，發(fā)酵液活性始終更大。
[0039]圖2示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中細胞發(fā)酵液上清液中產(chǎn)生的總蛋白量隨時間而變化?？偟鞍资怯呻p縮脲測定法來測量的，并且所示值由對照1(無甲酸)的最終總蛋白值進行了歸一化?？偟鞍自诖嬖诩姿岬那闆r下稍微增加，并在存在甲酸鈉的情況下稍微減少。
[0040]圖3示出在存在或不存在甲酸或甲酸鈉的情況下生長的細胞培養(yǎng)物中細胞發(fā)酵液中存在的針對總蛋白 生成量歸一化的過氧化氫酶活性的量隨時間而變化。過氧化氫酶活性是使用Amplex Red/HRP測定法來測量的。歸一化的發(fā)酵液活性在存在甲酸或甲酸鈉的情況下，特別是在存在甲酸鈉的情況下有增加。
[0041]出于所有目的，本文引用的所有參考文獻全文據(jù)此以引用方式并入。
【權(quán)利要求】
1.一種用于在宿主細胞中產(chǎn)生含B卜啉多肽的方法，所述方法包括: 使產(chǎn)生含卟啉多肽的宿主細胞在合適的培養(yǎng)基中生長，以產(chǎn)生發(fā)酵液； 向所述發(fā)酵液加入有效量的甲酸；以及 回收所產(chǎn)生的所述含卟啉多肽； 其中與在不存在甲酸的情況下使所述相同宿主細胞在所述等同培養(yǎng)基中生長相比，所述發(fā)酵液中存在甲酸增加了所述含卟啉多肽的活性、穩(wěn)定性或表達水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在加入所述甲酸之前使所述宿主細胞生長到補料分批階段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在加入所述甲酸之前所述宿主細胞的生長基本上完成。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在加入所述甲酸之前使所述宿主細胞生長到準備誘導(dǎo)產(chǎn)生所述含卟啉多肽的階段。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含葡萄糖，并且在加入所述甲酸之前所述葡萄糖基本上被所述宿主細胞耗盡。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵液中所述甲酸的濃度小于或等于約2.0克甲酸/千克發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中發(fā)酵期間加入的所述甲酸的累積量為約0.007至約1.35摩爾甲酸/千克(kg)發(fā)酵液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所加入的所述甲酸的量為約0.03至約7.1毫摩爾甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克發(fā)酵液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所加入的所述甲酸的量為約40至約4400毫摩爾甲酸/小時經(jīng)歷的發(fā)酵時間/千克底物干燥固體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所加入的所述甲酸的量為約50至約7500摩爾甲酸/摩爾活性含卟啉多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求ι-?ο中任一項所述的方法，其中所述甲酸為甲酸的形式。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述甲酸為甲酸鹽的形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述甲酸為甲酸鈉的形式。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述宿主細胞是絲狀真菌細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法,其中所述宿主細胞是木霉屬(Trichoderma)細胞。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述含卟啉多肽是含血紅素多肽。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述含卟啉多肽是過氧化氫酶。
19.一種根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法產(chǎn)生的含卟啉多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的含卟啉多肽，其中所述多肽是過氧化氫酶。
【文檔編號】C12N9/00GK103946387SQ201280057336
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月28日
【發(fā)明者】E·西姆斯 申請人:丹尼斯科美國公司