本發(fā)明涉及生物樣本檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種維生素b12檢測試劑盒和方法及其樣本前處理方法。
背景技術(shù)：
：維生素b12又叫鈷胺素，是唯一含金屬元素的維生素。其主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血；防止大腦神經(jīng)受到破壞。維生素b12是b族維生素中迄今為止發(fā)現(xiàn)最晚的一種。維生素b12的結(jié)構(gòu)如下所示：其特點為：1.分子中心為一個三價鈷離子；2.具有咕啉環(huán)(一個類似為卟啉環(huán)的結(jié)構(gòu))，該咕啉環(huán)的4個n原子與三價鈷離子形成4個配位鍵；3.二甲基吲唑結(jié)構(gòu)的一個n原子與三價鈷離子形成一個配位鍵；4.吲唑與咕啉環(huán)之間由異丙烷、磷酸、5'-脫氧腺苷連接；5.r基團(tuán)可以是oh-、cl-、cn-等帶負(fù)電荷的離子，其與三價鈷離子形成一個配位鍵。維生素b12在體內(nèi)是與蛋白相結(jié)合而存在的，所以在檢測血漿等生物樣本時，需要對樣本進(jìn)行前處理，使其將維生素b12由結(jié)合蛋白上釋放出，再進(jìn)行檢測。目前，臨床上對生物樣本中的微量維生素b12的檢測方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析等。但是，由于從結(jié)合蛋白釋放的維生素b12具有多種形式，r基團(tuán)的不同會導(dǎo)致其有不同的穩(wěn)定性，在采用上述分析方法進(jìn)行檢測時，可能由于維生素b12不同的穩(wěn)定性導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要針對上述問題，提供一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，采用該方法，能夠?qū)⒋郎y樣本中的維生素b12轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定態(tài)進(jìn)行檢測，提高了檢測穩(wěn)定性，并且所用處理劑均為安全性高的試劑，具有可操作性強(qiáng)的優(yōu)點。一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，包括以下步驟：取待測樣本溶液，加入蛋白釋放劑和絡(luò)合劑，所述蛋白釋放劑使待測樣本中的維生素b12由結(jié)合蛋白上釋放出；所述絡(luò)合劑為具有氰根離子的絡(luò)合物，所述絡(luò)合物在水溶液中氰根離子的總穩(wěn)定常數(shù)β為1010～1045，該絡(luò)合物在溶液中解離出氰根離子，與上述釋放出的維生素b12結(jié)合，形成穩(wěn)定的氰鈷胺素，供測定。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在維生素b12的多種形態(tài)中，以cn-絡(luò)和的結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此，常規(guī)技術(shù)中，普遍使用的是以氰化鈉或者氰化鉀作為樣本前處理液，利用其中的氰根離子與維生素b12結(jié)合形成穩(wěn)定的氰鈷胺素，再通過免疫方法，檢測出其具體含量，如圖1所示。但是，氰化鈉和氰化鉀在水溶液中完全電離得到劇毒的氰根離子，氰根離子具有很強(qiáng)的絡(luò)和性，可與血紅蛋白上的鐵離子絡(luò)和，形成非常穩(wěn)定的絡(luò)和物，使血紅蛋白失去活性，不能正常攜帶氧氣，導(dǎo)致窒息中毒。因此，這兩種物質(zhì)是國家嚴(yán)格管制的劇毒品，健康成年人的致死劑量為0.1g。對于氰化鈉和氰化鉀的使用，必須考慮周邊環(huán)境影響，風(fēng)險評估，危廢處理，以及申請建立劇毒品倉庫，對人員進(jìn)行培訓(xùn)，申請購買資質(zhì)。另外，如在試劑配方中引入這樣劇 毒的物質(zhì)，也會對人心理引起恐慌，其本身也具有較大的污染和中毒風(fēng)險。因此，以氰化鈉和氰化鉀作為前處理液大量使用，其操作性和可控性很差。為了尋找能夠在維生素b12前處理過程中替代氰化物的替代品，本發(fā)明人經(jīng)過了大量的實驗摸索和嘗試后發(fā)現(xiàn)，按照常規(guī)思路，如果要提供足夠多的氰根離子與待測樣本中的維生素b12完全反應(yīng)，需保證溶液中的氰根離子達(dá)到一定的濃度，如選擇氰根離子解離程度較小的物質(zhì)作為供體，則需要大量的供體化合物，以維持溶液中氰根離子的高濃度，提供足夠多的氰根離子與維生素b12反應(yīng)，但這樣的方式一方面提高了使用毒性，另一方面由于高濃度前處理劑的存在，有可能對樣品產(chǎn)生一些不良影響，因此，在實際應(yīng)用中是難以實現(xiàn)的。但在實驗中，本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，在實際應(yīng)用中，如選用具有氰根離子的絡(luò)合物作為氰根離子的供體，即使以少量的絡(luò)合物作為供體，即便溶液中氰根離子的濃度并不非常高，也能具有較好的結(jié)合效果，能夠與樣本中的維生素b12完全結(jié)合，形成穩(wěn)定的氰鈷胺素供測定，從而確保檢測結(jié)果的可靠性。而該類具有氰根離子的絡(luò)合物，雖然含有氰根離子，但其很難解離，因此，該類絡(luò)合物毒性很低，不屬于國家管制類物質(zhì)。購買，運輸，儲存和使用都較為方便安全。并且，本發(fā)明人在實驗中還發(fā)現(xiàn)，限定所用絡(luò)合物在水溶液中氰根離子的總穩(wěn)定常數(shù)β為1010～1045，其解離出的氰根離子既能滿足樣本處理要求，達(dá)到充分處理樣本的目的，又不至于產(chǎn)生較大毒性，具有較好的實際應(yīng)用前景。在其中一個實施例中，所述絡(luò)合物的加入量為每毫升待測樣本溶液加入0.5mg～5mg的絡(luò)合物。優(yōu)選加入1.5mg-5mg的絡(luò)合物。以上述使用量加入絡(luò)合物結(jié)合維生素b12，具有較好的前處理效果。在其中一個實施例中，所述絡(luò)合物包括：六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽，氰合汞鹽，氰合鉛酸鹽，或氰合錳酸鹽。上述六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽、氰合鉛酸鹽及氰合錳酸鹽中的金屬離子 包括各種可能的化合價的形態(tài)。例如六氰合鈷酸鹽是包括二價鈷的六氰合鈷ii酸鹽和三價鈷的六氰合鈷iii酸鹽。上述絡(luò)合物均可解離出微量氰根離子，從而使微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結(jié)合，并且又非劇毒物質(zhì)，具有較好的應(yīng)用前景。所述絡(luò)合物優(yōu)選六氰合鈷酸鹽或六氰合鐵酸鹽，具有更佳的應(yīng)用前景。特別是當(dāng)所述絡(luò)合物為六氰合鈷酸鹽時，具有最佳的前處理效果。該六氰合鈷酸鹽包括六氰合鈷酸鉀，六氰合鈷酸鈉等。例如，在k3co(cn)6中具有三價鈷離子，同維生素b12中氰根離子的絡(luò)和系數(shù)一致，由k3co(cn)6可解離出微量氰根離子，微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結(jié)合，并且，該六氰合鈷酸鹽所具有的三價鉻與維生素b12中的三價鈷具有較好的一致性。由于金屬離子容易與蛋白結(jié)合，從而改變其活性，因此，如絡(luò)合物中引入了新的金屬離子，可能導(dǎo)致檢測誤差。而使用六氰合鈷酸鹽，未引入其它更多的金屬離子，規(guī)避了其它金屬離子干擾，使檢測結(jié)果更加趨于真實。在其中一個實施例中，所述待測樣本為待測血清樣本。血清樣本的維生素b12的濃度為pg/ml級別，能夠被絡(luò)合物解離出的微量氰根離子結(jié)合，具有較好的前處理效果。在其中一個實施例中，所述蛋白釋放劑包括強(qiáng)堿，或強(qiáng)堿和二硫蘇糖醇(dtt)。其中：dtt能夠還原結(jié)合蛋白的二硫鍵，破壞其二級結(jié)構(gòu)。以便強(qiáng)堿更容易和充分水解結(jié)合蛋白，使維生素b12從結(jié)合蛋白上被充分釋放出來?？梢岳斫獾?，所述強(qiáng)堿包括：氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀中的至少一種，僅需能夠水解結(jié)合蛋白即可?？梢岳斫獾模鲜鰪?qiáng)堿破壞結(jié)合蛋白從而釋放出維生素b12的方法可采用常規(guī)處理手段，但是采用上述條件具有較好的釋放效果。在其中一個實施例中，所述蛋白釋放劑和絡(luò)合劑與待測樣本反應(yīng)的條件為：在20℃～50℃下時間8分鐘～30分鐘，優(yōu)選在37℃下反應(yīng)10min-15min?？梢岳斫獾模部刹捎闷渌磻?yīng)條件，但是采用上述條件，能夠快速得到穩(wěn)定的氰鈷胺素，又不影響維生素b12的穩(wěn)定性。本發(fā)明還公開了一種維生素b12檢測方法，采用上述的樣本前處理方法。上述維生素b12檢測方法，由于采用了上述樣本前處理方法，將待測樣本中不同形式的維生素b12均轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氰鈷胺素，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)點，并且無需使用劇毒的氰化物，具有非常好的應(yīng)用前景。在其中一個實施例中，采用上述的樣本前處理方法后，以化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。本發(fā)明還公開了一種具有氰根離子的絡(luò)合物在作為維生素b12檢測前處理劑中的應(yīng)用，所述絡(luò)合物在水溶液中氰根離子的總穩(wěn)定常數(shù)β為1010～1045。以上述具有氰根離子的絡(luò)合物提供微量氰根離子，作為結(jié)合維生素b12的前處理劑，既能夠滿足樣本處理要求，達(dá)到充分處理樣本的目的，又非劇毒物質(zhì)，具有安全性好，操作性強(qiáng)的優(yōu)點。在其中一個實施例中，所述絡(luò)合物為六氰合鈷酸鹽，六氰合鐵酸鹽，六氰合鉻酸鹽，四氰合鎳酸鹽，四氰合銅酸鹽，氰合金酸鹽，氰合鋅酸鹽，氰合汞鹽，氰合鉛酸鹽，或氰合錳酸鹽。所述絡(luò)合物優(yōu)選六氰合鈷酸鹽或六氰合鐵酸鹽，具有更佳的應(yīng)用前景。特別是當(dāng)所述絡(luò)合物為六氰合鈷酸鹽時，具有最佳的前處理效果。該六氰合鈷酸鹽包括六氰合鈷酸鉀，六氰合鈷酸鈉等。例如，在k3co(cn)6中具有三價鈷離子，與氰根離子的絡(luò)和系數(shù)一致，由k3co(cn)6可解離出微量氰根離子,微量的氰根離子與維生素b12的三價鈷離子結(jié)合，并且，該六氰合鈷酸鹽所具有的三價鉻與維生素b12中的三價鈷具有較好的一致性，不引入其它金屬離子，提高了檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明還公開了一種維生素b12檢測試劑盒，包括以下組分：前處理劑：包括蛋白釋放劑和絡(luò)合劑，所述絡(luò)合劑為具有氰根離子的絡(luò)合物，所述絡(luò)合物在水溶液中氰根離子的總穩(wěn)定常數(shù)β為1010～1045；磁性微粒體系：結(jié)合了內(nèi)因子特異性結(jié)合物或者內(nèi)因子的磁性微粒；標(biāo)記物體系：標(biāo)記了內(nèi)因子特異性結(jié)合物或者內(nèi)因子的示蹤標(biāo)記物；其中，內(nèi)因子特異性結(jié)合物或者內(nèi)因子中的一種標(biāo)記示蹤物，則另一種包被磁性微粒，優(yōu)選的，內(nèi)因子特異性結(jié)合物為維生素b12。。上述維生素b12檢測試劑盒，采用了蛋白釋放劑與具有氰根離子的絡(luò)合物相配合的方式，在前處理中，無需使用劇毒品或大量氰根離子供體，就能夠較好的將維生素b12完全結(jié)合，形成穩(wěn)定的氰鈷胺素供測定，具有安全性高的優(yōu)點。隨后，采用常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，即可完成維生素b12的檢測?？梢岳斫獾?，上述前處理劑中，蛋白釋放劑為能夠使待測樣本中的維生素b12由結(jié)合蛋白上釋放出的物質(zhì)，如強(qiáng)堿，或強(qiáng)堿和二硫蘇糖醇等。上述蛋白釋放劑和絡(luò)合劑可以根據(jù)其具體性質(zhì)和存放要求，對各試劑單獨包裝或合并包裝。上述磁性微粒體系中，結(jié)合了維生素b12的磁性微粒既可以是將維生素b12直接包被于磁性微粒上，也可以是通過間接方式連接，比如生物素和抗生物素抗體或者親和素等能夠相互結(jié)合的搭橋物以間接結(jié)合的方式結(jié)合。如該磁性微粒體系可以包括包被了抗生物素抗體及結(jié)合了生物素化維生素b12的磁性微粒等。同樣，上述標(biāo)記物體系既可以是將內(nèi)因子直接結(jié)合標(biāo)記物，如豬內(nèi)因子結(jié)合堿性磷酸酶標(biāo)記物的復(fù)合物，也可以通過生物素和抗生物素抗體、親和素等能夠相互結(jié)合的搭橋物以間接結(jié)合的方式結(jié)合。上述標(biāo)記物指的是化學(xué)發(fā)光免疫分析中使用的能夠直接發(fā)光的標(biāo)記物，如魯米諾及其衍生物、異魯米諾或其衍生物、吖啶酯等；或者在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析中使用的配合相應(yīng)底物可以發(fā)光的標(biāo)記物，如堿性磷酸酶或過氧化物酶等。如前所述，本申請中用具有氰根離子的絡(luò)合物替代現(xiàn)有維生素b12試劑盒中氰化鈉進(jìn)行樣本的預(yù)處理，因此，本試劑盒中的前處理劑也可以與其他維生素b12檢測試劑盒中的磁微粒體系和酶標(biāo)記體液組合，得到本申請的維生素b12檢測試劑盒。例如，roche的維生素b12檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)提供的磁微粒體系和標(biāo)記物體系，或者beckmancoulter的維生素b12檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)，提供的磁微粒體系和標(biāo)記物體系，都適用于本申請。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，以含有氰根離子，但又較難解離的絡(luò)合物作為氰根離子的供體，利用解離出的微量氰根離子與待測樣本中的維生素b12反應(yīng)，生成穩(wěn)定的氰鈷胺素，供后續(xù)測定。并通過選用具有 特定氰根離子解離常數(shù)的絡(luò)合物，以達(dá)到既能滿足樣本處理要求，充分處理樣本，又不至于產(chǎn)生較大毒性的目的。并且，本發(fā)明還對多種具有氰根離子的絡(luò)合物進(jìn)行了考察、篩選，發(fā)現(xiàn)以六氰合鈷酸鹽作為氰根離子的供體，對待測樣本進(jìn)行前處理，避免引入新的金屬離子，規(guī)避了其它金屬離子干擾，使檢測結(jié)果更加趨于真實。本發(fā)明的一種維生素b12檢測方法，由于采用了上述樣本前處理方法，將待測樣本中不同形式的維生素b12均轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氰鈷胺素，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)點，并且無需使用劇毒的氰化物，具有非常好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種維生素b12檢測試劑盒，采用了蛋白釋放劑與具有氰根離子的絡(luò)合物相配合作為前處理劑，在前處理中，無需使用劇毒品或大量氰根離子供體，就能夠較好的將維生素b12完全結(jié)合，形成穩(wěn)定的氰鈷胺素供測定，具有安全性高的優(yōu)點。隨后，采用常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，即可完成維生素b12的檢測。具有安全性高，操作方便的優(yōu)點。附圖說明圖1為常規(guī)技術(shù)中以氰化鈉或者氰化鉀中氰根離子與維生素b12結(jié)合形成穩(wěn)定的氰鈷胺素示意圖；圖2為實施例1中k3co(cn)6解離出氰根離子與維生素b12結(jié)合形成穩(wěn)定的氰鈷胺素示意圖；圖3為實施例1中kcn和k3co(cn)6對比測試結(jié)果；圖4為實施例1檢測方法與roche方法對比測試結(jié)果；圖5為實施例1檢測方法線性回收測試結(jié)果；圖6為實施例2中k3co(cn)6和k3fe(cn)6對比測試結(jié)果；圖7為實施例2中k3co(cn)6和k4fe(cn)6對比測試結(jié)果；圖8為實施例2中k3fe(cn)6與k3co(cn)6對比測試結(jié)果；圖9為實施例2中k4fe(cn)6與k3co(cn)6對比測試結(jié)果。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。實施例1一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，包括以下步驟：取待測血清樣本50μl，加入維生素b12前處理劑50μl，該前處理劑為氫氧化鈉濃度為0.5mol/l和k3co(cn)6濃度為1.5g/l的水溶液(即每毫升待測樣本溶液加入1.5mg的絡(luò)合物)，以及dtt濃度為1.028g/l的檸檬酸鈉緩沖液，在37℃下反應(yīng)12.5min，使其中的維生素b12由結(jié)合蛋白上釋放出，并與k3co(cn)6在溶液中解離出的微量氰根離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的氰鈷胺素，供測定，如圖2所示；k3co(cn)6在水溶液中氰根離子的總穩(wěn)定常數(shù)β為1042。一種維生素b12檢測方法，采用本實施例的前處理方法對待測血清樣本進(jìn)行處理后，以常規(guī)化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量，在本實施例中，采用以下試劑盒進(jìn)行檢測。一種維生素b12檢測試劑盒，包括以下組分：前處理劑：包括蛋白釋放劑和絡(luò)合劑，包括含有500mmol/lnaoh和1.5g/lk3co(cn)6水溶液的預(yù)處理液1和含有1.028g/ldtt檸檬酸鈉緩沖液的預(yù)處理液2。磁性微粒體系：懸浮于tris緩沖液中的包被著抗生物素抗體及結(jié)合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒，該包被著抗生物素抗體及結(jié)合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒的濃度為0.2g/l。標(biāo)記物體系：濃度為3mg/l的豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物的磷酸緩沖液。上述試劑盒中的磁微粒和標(biāo)記物，可以用常規(guī)的抗體包被方法和標(biāo)記技術(shù)，將抗生物素抗體包被到磁微粒，和將豬內(nèi)因子與堿性磷酸酶結(jié)合標(biāo)記。采用上述試劑盒進(jìn)行維生素b12的檢測，以三步競爭化學(xué)發(fā)光免疫分析法進(jìn)行，具體操作如下：第一步：將血清樣本與上述預(yù)處理液1和預(yù)處理液2混合，37℃孵育12.5分鐘。第二步：將豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物添加到反應(yīng)管中，中和變性處理后的樣本，同時樣本中的維生素b12與豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物的復(fù)合物結(jié)合。第三步：將包被著抗生物素抗體及結(jié)合了生物素化維生素b12的超順磁性微粒添加到反應(yīng)管中，經(jīng)過孵育，磁性微粒上的維生素b12競爭結(jié)合復(fù)合物上的維生素b12，形成維生素b12-豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物和磁性微粒-維生素b12-豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物的混合物。磁場吸附磁性微粒，洗去不含磁性微粒部分。最后加入化學(xué)發(fā)光底物(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷，amppd)，37℃孵育12分鐘，磁性微粒-維生素b12-豬內(nèi)因子-堿性磷酸酶標(biāo)記物的堿性磷酸酶，可以催化底物發(fā)光，且發(fā)光值與堿性磷酸酶含量成正比例關(guān)系。記錄發(fā)光讀數(shù)。所產(chǎn)生光子數(shù)與樣本內(nèi)維生素b12的濃度成反比。樣本內(nèi)分析物的量由校準(zhǔn)曲線來計算得到。以下對上述方法進(jìn)行方法學(xué)考察。一、以kcn和k3co(cn)6進(jìn)行對比測試。分別使用kcn和k3co(cn)6作為樣本前處理劑，進(jìn)行血清中維生素b12的對比測定實驗。其中，以k3co(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法按照本實施例上述樣本前處理方法；以kcn作為樣本前處理劑的具體方法參照上述樣本前處理方法，僅是將其中加入的k3co(cn)6替換為0.9g/l濃度的kcn50μl；并按照上述化學(xué) 發(fā)光免疫分析法分別測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。結(jié)果如圖3所示，圖中橫坐標(biāo)為樣本中維生素b12的濃度，單位為pg/ml，縱坐標(biāo)的斜率通過以下公式計算得到：其中：c0指樣本中維生素b12為零時的檢測發(fā)光值；cs指樣本中維生素b12為橫坐標(biāo)濃度時的檢測發(fā)光值；從圖中可以看出，以kcn和k3co(cn)6作為樣本前處理劑，在各個濃度梯度下，定標(biāo)斜率都很明顯，且曲線相似度較高。說明可用k3co(cn)6替代kcn使用，具有較好的前處理效果。二、本實施例的維生素b12檢測方法與roche比較。采用上述本實施例的維生素b12檢測方法對39例真實樣本進(jìn)行檢測，并同時采用roche(羅氏)的vb12檢測試劑(型號：cobas411)進(jìn)行平行檢測，roche的檢測方法為電化學(xué)發(fā)光法，進(jìn)行方法學(xué)的對比。檢測結(jié)果如圖4所示，圖中橫坐標(biāo)為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標(biāo)為roche檢測試劑得到濃度值。將二者進(jìn)行線性擬合后，其直線方程的中相關(guān)系數(shù)r的r2為0.9774，說明本實施檢測方法與roche的vb12檢測試劑相比，二者的一致性較好。三、線性回收的測定。使用含高濃度維生素b12的樣本進(jìn)行逐級稀釋，以本實施例的方法檢測其中維生素b12的含量，結(jié)果如圖5所示。圖中橫坐標(biāo)為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標(biāo)為高濃度樣本稀釋后的理論值。將二者進(jìn)行線性擬合后，其直線方程中相關(guān)系數(shù)r的r2為0.9969，說明本實施檢測方法得到的測定值與理論值幾乎無差異，二者具有較高的一致性。四、低濃度樣本測定。為了考察在低濃度樣本中檢測的準(zhǔn)確性，選取2例低濃度樣本進(jìn)行檢測， 結(jié)果如下表所示。表1.低濃度樣本檢測。樣本濃度值測定濃度測值偏差正確度低值樣本1281.72270.124.29％正確度低值樣本2622.41600.643.63％上表中濃度值是具有較高溯源等級參考血清，由邁瑞溯源測試得到。從上述結(jié)果中可以看出，本方法對不同低濃度樣本檢測的準(zhǔn)確度較好，其偏差均在5％以內(nèi)。實施例2一種維生素b12檢測的樣本前處理方法，與實施例1的方法基本相同，不同之處在于：本實施例分別采用的六氰合鐵酸鹽(六氰合鐵酸鉀)和六氰合亞鐵酸鹽(六氰合亞鐵酸鉀)為絡(luò)合物對樣本進(jìn)行前處理，其中，六氰合鐵酸鉀的加入量為5g/l的六氰合鐵酸鉀水溶液50μl(即每毫升待測樣本溶液加入5mg的絡(luò)合物)，六氰合亞鐵酸鉀的加入量為3g/l濃度的六氰合亞鐵酸鹽水溶液50μl(即每毫升待測樣本溶液加入3mg的絡(luò)合物)。六氰合鐵酸鉀在水溶液中的總穩(wěn)定常數(shù)β為1042，六氰合亞鐵酸鉀在水溶液中的總穩(wěn)定常數(shù)β為1035。一種維生素b12檢測方法，采用本實施例的前處理方法對待測血清樣本進(jìn)行處理后，以實施例1的化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。以下對上述方法進(jìn)行方法學(xué)考察。一、以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6進(jìn)行對比測試。分別使用k3co(cn)6，k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑，進(jìn)行血清中維生素b12的對比測定實驗。其中，以k3co(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法按照實施例1中樣本前處理方法；以k3fe(cn)6，和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑的具體方法參照實施 例1，僅是將實施例1中加入的k3co(cn)6分別替換為5g/l的k3fe(cn)6水溶液和3g/l濃度的k4fe(cn)6；并按照上述化學(xué)發(fā)光免疫分析法分別測定待測樣本中氰鈷胺素的含量。結(jié)果如圖6和圖7所示，圖中橫坐標(biāo)為樣本中維生素b12的濃度，單位為pg/ml，縱坐標(biāo)的斜率參照實施例1的公式計算得到：從圖中可以看出，以k3co(cn)6，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6作為樣本前處理劑，在各個濃度梯度下，定標(biāo)斜率都很明顯，且曲線趨勢相似度較高，說明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6類似，均有較好的前處理效果。但是在高濃度范圍，k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6相比，曲線吻合度稍差，說明在樣本中含有較高濃度維生素b12時，引入的fe離子對測定結(jié)果造成了少量的影響。二、本實施例與實施例1的維生素b12檢測方法比較。采用上述本實施例的維生素b12檢測方法(絡(luò)合物為k3fe(cn)6和k4fe(cn)6)分別對39例真實樣本進(jìn)行檢測，并同時采用實施例1的檢測方法進(jìn)行平行檢測，進(jìn)行方法學(xué)的對比。其中，絡(luò)合物為k3fe(cn)6的檢測結(jié)果如圖8所示，絡(luò)合物為k4fe(cn)6)的檢測結(jié)果如圖9所示，圖中橫坐標(biāo)為本實施例的維生素b12檢測方法得到濃度值，縱坐標(biāo)為實施例1檢測得到濃度值。將二者進(jìn)行線性擬合后，其直線方程的相關(guān)系數(shù)r的r2分別為0.9028和0.9197，均大于0.9，說明k3fe(cn)6和k4fe(cn)6與k3co(cn)6相比，有相似的前處理效果，可以用于維生素b12的前處理。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12