使用細(xì)菌細(xì)胞色素p450從奧美拉唑制備代謝物的新方法和用于其的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用細(xì)菌細(xì)胞色素P450從奧美拉唑制備代謝物的新方法和用于該新方法的組合物，更具體而言，涉及用于從奧美拉唑制備5'-羥基產(chǎn)物的組合物和試劑盒及其制備方法，所述組合物和試劑盒含有細(xì)菌細(xì)胞色素P450BM3(CYP102A1)或其突變形式。所述組合物、試劑盒和方法能夠從奧美拉唑經(jīng)濟高效地大規(guī)模制備5'-羥基產(chǎn)物，因此會對使用奧美拉唑的代謝物的新型藥物的開發(fā)作出顯著貢獻。
【專利說明】使用細(xì)菌細(xì)胞色素 P450從奧美拉唑制備代謝物的新方法 和用于其的組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用細(xì)菌細(xì)胞色素 P450從奧美拉唑制備代謝物的新方法和用于 該新方法的組合物，更具體而言，涉及用于從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的組合物和試劑 盒及其制備方法，所述組合物和試劑盒含有細(xì)菌細(xì)胞色素 P450BM3 (CYP102A1)或其突變形 式。

【背景技術(shù)】
[0002] 奧美拉唑是質(zhì)子泵抑制劑，已知其是消化不良、胃潰瘍、胃食管反流病和咽喉反流 病的治療劑。奧美拉唑是外消旋體，含有比例為50:50的S和R對映異構(gòu)體。在以上酸性 條件下，這兩種對映異構(gòu)體都轉(zhuǎn)化成非手性化合物，并且與H+/K+ATP酶的半胱氨酸基團反 應(yīng)，從而抑制胃壁細(xì)胞中的胃酸產(chǎn)生。奧美拉唑和對映異構(gòu)體被存在于人肝臟中的細(xì)胞色 素 P450CYP2C19和CYP3A4代謝，其主要代謝物包括5' -0-脫甲基奧美拉唑、5' -和3' -羥 基奧美拉唑以及奧美拉唑諷（參見Renberg等，Drug Metab Dispos 17:69-76,1989; Andersson 等,Clin Pharmacokinet 40:411-426,2001 ;Li 等,J Pharmacol Exp Ther 315:777-787, 2005)。據(jù)報道，R對映異構(gòu)體通常被CYP2C19代謝為5' -0-脫甲基奧美拉唑、 5' -羥基奧美拉唑，S對映異構(gòu)體通常被CYP3A4代謝為奧美拉唑砜、3' -羥基奧美拉唑。
[0003] 細(xì)胞色素 P450(P450或CYP)酶是個大家族，該家族由多種酶組成，這些酶充當(dāng)從 古細(xì)菌至細(xì)菌、真菌、植物、動物和人的整個自然界中的多種多樣的氧化反應(yīng)的催化劑。由 于催化功能的多樣性以及其底物范圍廣，P450可大規(guī)模地用作制備精細(xì)化工品（包括藥 物供應(yīng)等）時的生物催化劑（參見 Guengerich，Nat Rev Drug Discovl:359_366,2〇〇2; Urlacher 等，Trends Biotechnol24:324-330, 2006 ;Yun CH 等，Trends Biotechnol 25:289-298, 2007 ;Lamb 等，Curr Opin Biotechnol 18:504-512, 2007)。但是，雖然哺乳動 物的細(xì)胞色素 P450酶在各種上述生物【技術(shù)領(lǐng)域】中具有潛在的可用性，但是P450的穩(wěn)定性、 催化活性和可獲得性較低，因此不適合作為生物催化劑。
[0004] 當(dāng)在開發(fā)藥物期間人利用P450將前藥轉(zhuǎn)化為生物"活性代謝物"時（參見Johnson 等，Breast Cancer Res. Treat85:151-159, 2004)，需要大量的純代謝物來研究該藥物的功 效、毒性和藥代動力學(xué)等。此外，當(dāng)代謝物自身具有生物活性時，體內(nèi)直接施用所述代謝物 具有巨大裨益，因此大規(guī)模生產(chǎn)所述代謝物是重要的。
[0005] 當(dāng)將奧美拉唑施用至人體中時，由于奧美拉唑被CYP2C19和CYP3A4代謝，代謝物 產(chǎn)生的速率會根據(jù)酶的表達程度而有所不同。另外，會出現(xiàn)藥物與被所述酶代謝的其他藥 物相互作用的問題。因此，當(dāng)將奧美拉唑代謝物直接用作藥物時，可以避免藥物相互作用問 題。
[0006] 但是，由于在化學(xué)合成純代謝物時存在各種問題，為了以替代代謝物化學(xué)合成的 方式產(chǎn)生藥物代謝物或藥物候選物，使用了 P450。已經(jīng)報道了使用表達自大腸桿菌（參 見 Yun 等，Curr Drug Metab7:411_429, 2〇〇6)或昆蟲細(xì)胞（參見 Rushmore 等，Metab Eng2:115-125, 2000 ;Vail 等，J Ind Microbiol Biotechnol32:67-74, 2005)的人 P450 來 生產(chǎn)所述代謝物。但是，由于穩(wěn)定性有限和反應(yīng)速率低等原因，這些體系具有諸如成本昂貴 和產(chǎn)生率低等問題（參見 Guengerich 等，Crit Rev Toxicol26:551_583，1996)。因此，已 經(jīng)提出了使用具有所需催化活性的工程化細(xì)菌P450酶作為用于產(chǎn)生人體中的代謝物的替 代途徑的方法（參見 Yun CH 等，Trends Biotechnol25:289-298, 2007)。
[0007] 同時，源自巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)的 P450BM3 (CYP102A1) 的血紅素結(jié)構(gòu)域具有單加氧酶活性，其與CYP4A(脂肪酸羥化酶）家族的哺乳動物 成員極其相似。天然地，其由單個的多肽構(gòu)成，其中，具有哺乳動物樣二黃素還原酶 功能的CYP102A1還原酶結(jié)構(gòu)域融合至P450血紅素結(jié)構(gòu)域的C末端。兩種酶活性 的融合使得融合性CYP102A1成為期望的哺乳動物模型，特別是人P450酶的期望模 型。據(jù)報道，通過邏輯性設(shè)計或定向進化而遺傳改造得到的突變CYP102A1可氧化 人P450的若干種底物，從而產(chǎn)生具有更高活性的代謝物（參見Kim等，Drug Metab Dispos36:2166-2170, 2008 ;Kim 等，Drug Metab Dispos37:932-936, 2009 ;Kim 等，J Mol Catal B:Enzym63:179-187, 2010 ;0tey 等，Biotechnol Bioeng93:494_499, 2006 ;Yun CH 等，Trends Biotechnol25: 289-298, 2007)。
[0008] 基于上述描述，已提出可以開發(fā)突變的CYP102A1作為用于藥物的檢測和合成的 生物催化劑。最近已報道，數(shù)種選出的突變形式可以允許CYP102A1酶產(chǎn)生人體中的代謝 物作為藥物（參見 Kim 等，Drug Metab Dispos36:2166_2170, 2008 ;Kim 等，Drug Metab Dispos37:932-936, 2009)，但是，尚未報道過以生物學(xué)手段從奧美拉唑產(chǎn)生人體中的代謝 物的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種在通過氧化奧美拉唑而產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物的選擇性 轉(zhuǎn)化反應(yīng)中能夠更穩(wěn)定更有效地發(fā)揮催化功能的酶。
[0010] 另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于從奧美拉唑制備5'-羥基產(chǎn)物的組合 物，所述組合物含有所述酶。
[0011] 此外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種從奧美拉唑制備5'-羥基產(chǎn)物的方法，所 述方法包括使所述酶與奧美拉唑反應(yīng)。
[0012] 另外，本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于從奧美拉唑制備5'-羥基產(chǎn)物的試劑 盒，所述試劑盒含有所述酶和產(chǎn)生NADPH的體系。
[0013] [技術(shù)方案]
[0014] 在一個總體方面，本發(fā)明提供選自由野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的 組的至少一種酶。
[0015] 所述酶可以在通過氧化奧美拉唑而產(chǎn)生5'-羥基產(chǎn)物的選擇性轉(zhuǎn)化反應(yīng)中更穩(wěn) 定更有效地發(fā)揮催化功能。
[0016] 在另一總體方面，本發(fā)明提供一種使用野生型CYP102A1和突變的CYP102A1從奧 美拉唑選擇性地大規(guī)模制備人體中的代謝物、特別是5'-羥基產(chǎn)物的方法，以及用于該方 法的組合物和試劑盒，其中，CYP102A1是細(xì)菌P450酶。
[0017] 本發(fā)明的野生型CYP102A1和突變的CYP102A1可以用作以奧美拉唑作為底物的氧 化反應(yīng)中的催化劑，已知奧美拉唑是人P450的底物；特別而言，使用人CYP2C19作為催化劑 時產(chǎn)生的奧美拉唑代謝物包括兩種代謝物；而使用本發(fā)明的細(xì)菌CYP102A1或其突變形式 作為催化劑時，可以選擇性地產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物。
[0018] 在本發(fā)明的優(yōu)選示例性實施方式中，本發(fā)明人確認(rèn)了當(dāng)細(xì)菌野生型CYP102A1和 其定點突變形式在大腸桿菌中大規(guī)模表達（參見表1和2)且使奧美拉唑與產(chǎn)生NADPH的 體系反應(yīng)時，通過HPLC(參見圖3、4和5)和LC-MS譜（參見圖6)確認(rèn)奧美拉唑轉(zhuǎn)化成了 人體中的代謝物。經(jīng)確認(rèn)，在使用人CYP2C19時，奧美拉唑被氧化產(chǎn)生兩種主要代謝物，即 3' -羥基奧美拉唑和5' -羥基奧美拉唑；但在使用細(xì)菌野生型CYP102A1及其突變形式時， 選擇性地產(chǎn)生了一種主要產(chǎn)物，即5' -羥基奧美拉唑。
[0019] 在產(chǎn)物的產(chǎn)生方面，野生型CYP102A1、17種突變形式和6種突變嵌合形式具有范 圍很寬的分子催化活性（轉(zhuǎn)換數(shù)）（參見圖5)。經(jīng)確認(rèn)，對于在總分子催化活性方面顯示出 高活性的突變#10,在以ImM濃度（A)的奧美拉唑反應(yīng)2?4小時（B)的反應(yīng)中顯示出了最 高活性；同時，對于野生型CYP102A1酶，幾乎不顯示對于奧美拉唑的活性（參見圖7)。
[0020] 基于上述檢驗結(jié)果，在另一總體方面，本發(fā)明提供一種用于從奧美拉唑制備 5' -羥基產(chǎn)物的組合物，所述組合物含有選自由野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的 組的至少一種酶，
[0021] 其中，所述突變的CYP102A1具有由氨基酸序列SEQ ID N0:16表示的野生型 CYP102A1被修飾后的序列，所述修飾為選自由以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基 酸精氨酸（R)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸組成的組的氨基酸替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替換；第65位氨基酸谷氨酸 (E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的 氨基酸替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨 酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替換；第87 位氨基酸亮氨酸（L)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸組成的組的氨基酸替換；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替換；第144位氨基酸谷氨酸 (E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的 氨基酸替換；第189位氨基酸亮氨酸（L)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨 酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被選自由丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸 替換。
[0022] 所述奧美拉唑可以是含有作為對映異構(gòu)體的S-或R-奧美拉唑的外消旋體，或是 比例為50:50的S-和R-奧美拉唑的對映異構(gòu)體，但是本發(fā)明不限于此。
[0023] 在另一總體方面，本發(fā)明提供一種從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的方法，所述方 法包括使奧美拉唑與選自由野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的組的至少一種酶反 應(yīng)。
[0024] 在所述制備5'-羥基產(chǎn)物的方法中，所述突變的CYP102A1可以優(yōu)選具有由氨基酸 序列SEQ ID NO: 16表示的野生型CYP102A1被修飾后的序列，所述修飾選自由以下替換組 成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被 選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸 替換；第65位氨基酸谷氨酸（E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被選自由甘氨酸、絲氨 酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；第82位氨基 酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組 成的組的氨基酸替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替換；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被 選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的氨基酸替 換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；第189位氨基酸亮氨酸（L)被選自由甘氨酸、絲氨 酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的氨基酸替換；和第268位氨 基酸谷氨酸（E)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸組成的組的氨基酸替換。
[0025] 在本發(fā)明中，突變的CYP102A1可以通過本領(lǐng)域已知的任何已知突變方法來制造， 例如缺失突變法（參見Kowalski D.等，J. Biochem.，15, 4457)、PCT法、Kunkel法、定點突 變法、DNA改組、交錯延伸法（StEP)和易錯PCR等。
[0026] 在本發(fā)明的突變的CYP102A1中，由SEQIDN0:16表示的野生型CYP102A1蛋白的 氨基酸序列通過天然或人工的替換、缺失、添加和/或插入而被修飾。優(yōu)選的是，按照以下 分類，所換上的氨基酸可以具有與待替換的氨基酸相似的性質(zhì)。例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸都被分類成非極性氨基酸，并且彼此具 有相似的性質(zhì)。不帶電氨基酸的實例可以包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、 天冬酰胺和谷氨酰胺等，酸性氨基酸的實例可以包括天冬氨酸和谷氨酸，堿性氨基酸的實 例可以包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。
[0027] 本發(fā)明的突變的CYP102A1包括含有與由SEQ ID勵:16表示的0￥?102八1蛋白序 列具有至少50%同一'丨生、優(yōu)選至少75%同一'丨生、更優(yōu)選至少90%同一'丨生的氨基酸序列的多 肽。
[0028] 野生型CYP102A1的期望突變形式可以包括對SEQ ID N0:16所表示的野生型 CYP102A1進行的選自由以下替換組成的組的至少一種替換：第48位氨基酸精氨酸（R)被 亮氨酸（L)替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替換；第65位氨基酸谷氨酸 (E)被甘氨酸（G)替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替換；第82位氨基酸苯丙 氨酸（F)被異亮氨酸（I)替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被異亮氨酸（I)替換；第88位氨 基酸苯丙氨酸（F)被纈氨酸（V)替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替換；第 189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被纈氨酸（V) 替換。
[0029] 在最優(yōu)選的突變CYP102A1中，由SEQ ID勵：16表示的野生型0￥?102八1氨基酸中 的替換位置和替換氨基酸可以選自由以下組成的組：F88A、R48L/Y52F、A75G/F88V/L189Q、 R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/L189Q/E268V、 R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/E144G/L189Q/ E268V、 R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/E144G/L189Q/ E268V。
[0030] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生，例如使用基因工程技術(shù)的肽合 成法（Merrifield，J. Am. Chem. Soc.，85:2149-2154, 1963 文獻）、固相技術(shù)或利用合適的肽 酶切割本發(fā)明的蛋白的方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以作為天然蛋白產(chǎn)生，或者可以通過培養(yǎng) 經(jīng)轉(zhuǎn)化而具有編碼CYP102A1或其突變形式的DNA的細(xì)胞、并回收所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的重組方法 產(chǎn)生。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過下述過程產(chǎn)生：將編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸分子插入合 適的表達載體中，培養(yǎng)通過將該載體遞送至合適的細(xì)胞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體，并對轉(zhuǎn)化體所表 達的蛋白質(zhì)進行純化。
[0031] 載體可以具有例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w形式?？寺』虮磉_載體中的 DNA的宿主細(xì)胞的實例可以包括原核細(xì)胞、酵母和高級真核細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對 諸如培養(yǎng)基、溫度和pH等培養(yǎng)條件進行合適地選擇而無需過多的實驗。通常，可以參考 Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach, M. Butler編·（IRL Press, 1991) 而利用使細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)率最大化的技術(shù)。
[0032] 表達和克隆載體通?？梢院信c編碼CYP102A1或其突變形式的核酸序列可操作 地連接的誘導(dǎo)mRNA合成的啟動子。被宿主細(xì)胞識別的各種啟動子是已知的。適用于原核細(xì) 胞宿主的啟動子的實例包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸啟動子 系統(tǒng)和雜合啟動子，例如tac啟動子。此外，用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動子可以含有與編碼SISP-1 的DNA可操作地連接的Shine-Dalgarno(S. D.)序列。適用于酵母宿主的啟動子序列的實 例可以包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖解酶。
[0033] 從奧美拉唑產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物的方法可以進一步包括：添加產(chǎn)生NADPH的體系。
[0034] 在另一總體方面，本發(fā)明提供一種用于從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的試劑盒， 所述試劑盒包含：產(chǎn)生NADPH的體系，和選自由野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的 組的至少一種酶。
[0035] 在突變的CYP102A1中，由SEQ ID N0:16表示的野生型CYP102A1氨基酸中的替 換位置和替換氨基酸可以優(yōu)選是選自由以下組成的組的至少一種：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V，但是本發(fā)明不限于此。此外，所述試劑盒還可以含有進行所述反應(yīng)所 需的試劑。
[0036] 產(chǎn)生NADPH的體系可以含有6-磷酸葡萄糖、NADP+和酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶， 但是本發(fā)明不限于此。
[0037] CYP102A1及其突變形式是在通過氧化奧美拉唑而產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物的選擇性轉(zhuǎn) 化反應(yīng)中能夠穩(wěn)定有效地發(fā)揮催化功能的細(xì)菌酶（奧美拉唑已知是人P450的底物），因此 可有效地用于以生物學(xué)手段從奧美拉唑產(chǎn)生人體中的代謝物。
[0038] [有益效果]
[0039] 本發(fā)明的細(xì)菌野生型CYP102A1及其突變形式可以在將奧美拉唑轉(zhuǎn)化成5' -羥基 產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中更穩(wěn)定更有效地發(fā)揮催化功能，從而能夠環(huán)保地、選擇性地大規(guī)模制備 5' -羥基產(chǎn)物。本發(fā)明的產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物的組合物、試劑盒和方法可以包括所述細(xì)菌野生 型CYP102A1及其突變形式，從而能夠經(jīng)濟高效地從奧美拉唑大規(guī)模制備5' -羥基產(chǎn)物，因 此顯著地有助于開發(fā)使用奧美拉唑代謝物的新型藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 以下將結(jié)合附圖對優(yōu)選實施方式進行描述，由此會使本發(fā)明的上述和其他目的、 特征和優(yōu)點變得顯而易見，附圖中：
[0041] 圖1顯示本發(fā)明的野生型CYP102A1(SEQ ID N0:16)的氨基酸序列。
[0042] 圖2顯示本發(fā)明的野生型CYP102A1 (SEQ ID N0:17)的堿基序列。
[0043] 圖3顯示由本發(fā)明的野生型CYP102A1及其突變形式產(chǎn)生的奧美拉唑代謝物的 HPLC色譜（在302nm測得的UV吸光度）（峰：通過由人CYP2C19產(chǎn)生的代謝物的峰的保留 時間來確認(rèn)；箭頭：指示底物和作為主要產(chǎn)物的5' -羥基產(chǎn)物）。
[0044] 圖4顯示由本發(fā)明的野生型CYP102A1的突變形式（#10)產(chǎn)生的奧美拉唑代謝物 衍生物的HPLC色譜（A :外消旋體；B :R對映異構(gòu)體；C :S對映異構(gòu)體）。
[0045] 圖5顯示了本發(fā)明的野生型CYP102A1及其突變形式產(chǎn)生奧美拉唑氧化物的產(chǎn)生 速率。
[0046] 圖6顯示由人CYP2C19和本發(fā)明的突變CYP102A1(#10)產(chǎn)生的奧美拉唑和其代謝 物的 LC-MS 洗脫圖（A :突變 CYP102A1#10 ;B :人 CYP2C19)。
[0047] 圖7顯示了本發(fā)明的突變CYP102A1 (#10)產(chǎn)生5' -羥基產(chǎn)物的總分子催化活性隨 奧美拉唑的濃度（A)和處理時間（B)的變化。
[0048] 圖8顯示通過核磁共振（NMR)圖譜觀察到的由本發(fā)明的突變CYP102A1 (#10)產(chǎn)生 的奧美拉唑代謝物的結(jié)構(gòu)。

【具體實施方式】
[0049] 以下將參照附圖來詳細(xì)描述本發(fā)明的實施方式。
[0050] 但是，該詳細(xì)描述是為了幫助具體理解本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍不限于以下實 施例。
[0051] 〈實施例1>通過定點誘變來構(gòu)建突變的P450BM3
[0052] 按照 Kim 等（參見 Drug Metab Dispos 第 35 卷，第 2166-2170 頁，2008)所述 的方法產(chǎn)生CYP102A1的17種定點突變形式。用于引入BamHI/SacI的識別位點的引物 和用于進行誘變的PCR引物示于以下表1中。對應(yīng)于氨基酸替換的密碼子以斜體加下劃 線表示。PCR引物購自Genotech Company(Daejeon，Korea)。使用設(shè)計用來促進表達載 體 pCWori (獲自 Dr. F. W. Dahlquist, University of California, Santa Barbara, CA)或 pSE420(Invitrogen)克隆的引物，通過PCR法從pCWBM3擴增編碼突變的CYP102A1的基因。
[0053] 使用下表1所示的14種設(shè)計的引物組來實施寡核苷酸組裝。將擴增的基 因克隆至PCWBM3BamHI/SacI載體的BamHI/SacI識別位點。使用經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸 桿菌DH5 a F' -IQ(Invitrogen)來表達CYP102A1突變蛋白。誘變后，通過Genotech Company (Daejeon)的DNA測序來確認(rèn)是否出現(xiàn)了所需的突變。
[0054] [表 1]
[0055] 用于突變的引物
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 選自由氨基酸序列SEQ ID勵：16所表示的野生型0￥?10241和突變的0￥?102八1組 成的組的至少一種酶， 其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修飾后的序列，所述修飾為選自由 以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸組成的組的一種氨基酸替換；第65位氨基酸谷氨酸（E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的 組的一種氨基酸替換；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨 基酸替換；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被選自由 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替 換；第189位氨基酸亮氨酸（L)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被選自由丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替 換。
2. 如權(quán)利要求1所述的酶，其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修飾后 的序列，所述修飾為選自由以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R)被亮 氨酸（L)替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替換；第65位氨基酸谷氨酸（E) 被甘氨酸（G)替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替換；第82位氨基酸苯丙氨酸 (F)被異亮氨酸（I)替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被異亮氨酸（I)替換；第88位氨基酸 苯丙氨酸（F)被纈氨酸（V)替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替換；第189位 氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被纈氨酸（V)替換。
3. 如權(quán)利要求2所述的酶，其中，在所述突變的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基酸 中的替換位置和替換氨基酸是選自由以下組成的組的至少一種：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V。
4. 一種用于從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的組合物，所述組合物含有選自由氨基酸序 列SEQ ID NO: 16所表示的野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的組的至少一種酶， 其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修飾后的序列，所述修飾為選自由 以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸組成的組的一種氨基酸替換；第65位氨基酸谷氨酸（E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的 組的一種氨基酸替換；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨 基酸替換；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被選自由 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替 換；第189位氨基酸亮氨酸（L)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被選自由丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替 換。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修 飾后的序列，所述修飾為選自由以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R) 被亮氨酸（L)替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替換；第65位氨基酸谷氨 酸（E)被甘氨酸（G)替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替換；第82位氨基酸 苯丙氨酸（F)被異亮氨酸（I)替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被異亮氨酸（I)替換；第88 位氨基酸苯丙氨酸（F)被纈氨酸（V)替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替換； 第189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被纈氨酸 (V)替換。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，在所述突變的CYP102A1中，野生型CYP102A1 氨基酸中的替換位置和替換氨基酸是選自由以下組成的組的至少一種：F88A、R48L/Y52F、 A75G/F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/ L87I/L189Q/E268V、48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、48L/E65G/ F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/ F88V/E144G/L189Q/E268V。
7. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述奧美拉唑是含有作為對映異構(gòu)體的S-奧美 拉唑或R-奧美拉唑的外消旋體，或是比例為50:50的S-奧美拉唑和R-奧美拉唑的對映異 構(gòu)體。
8. -種從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的方法，所述方法包括使奧美拉唑與選自由氨基 酸序列SEQ ID NO: 16所表示的野生型CYP102A1和突變的CYP102A1組成的組的至少一種 酶反應(yīng)， 其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修飾后的序列，所述修飾為選自由 以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第52位 氨基酸酪氨酸（Y)被選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨 酸組成的組的一種氨基酸替換；第65位氨基酸谷氨酸（E)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；第75位氨基酸丙 氨酸（A)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的 組的一種氨基酸替換；第82位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被 選自由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨 基酸替換；第88位氨基酸苯丙氨酸（F)被選自由丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被選自由 甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替 換；第189位氨基酸亮氨酸（L)被選自由甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰 胺和谷氨酰胺組成的組的一種氨基酸替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被選自由丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸組成的組的一種氨基酸替 換。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述突變的CYP102A1具有野生型CYP102A1被修 飾后的序列，所述修飾為選自由以下替換組成的組的至少一種：第48位氨基酸精氨酸（R) 被亮氨酸（L)替換；第52位氨基酸酪氨酸（Y)被苯丙氨酸（F)替換；第65位氨基酸谷氨 酸（E)被甘氨酸（G)替換；第75位氨基酸丙氨酸（A)被甘氨酸（G)替換；第82位氨基酸 苯丙氨酸（F)被異亮氨酸（I)替換；第87位氨基酸亮氨酸（L)被異亮氨酸（I)替換；第88 位氨基酸苯丙氨酸（F)被纈氨酸（V)替換；第144位氨基酸谷氨酸（E)被甘氨酸（G)替換； 第189位氨基酸亮氨酸（L)被谷氨酰胺（Q)替換；和第268位氨基酸谷氨酸（E)被纈氨酸 (V)替換。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中，在所述突變的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基 酸中的替換位置和替換氨基酸是選自由以下組成的組的至少一種：F88A、R48L/Y52F、A75G/ F88V/L189Q、R48L/L87I/L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/ L189Q/E268V、R48L/L87I/F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/ E144G/L189Q/E268V、R48L/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/ E144G/L189Q/E268V。
11. 如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法還包括：添加產(chǎn)生NADPH的體系。
12. -種用于從奧美拉唑制備5' -羥基產(chǎn)物的試劑盒，所述試劑盒包含：產(chǎn)生NADPH的 體系，和選自由氨基酸序列SEQ ID勵:16所表示的野生型0￥?10241和突變的0￥?102八1組 成的組的至少一種酶， 其中，在所述突變的CYP102A1中，野生型CYP102A1氨基酸中的替換位置和替換氨基 酸是選自由以下組成的組的至少一種：F88A、R48L/Y52F、A75G/F88V/L189Q、R48L/L87I/ L189Q、R48L/F88V/L189Q、R48L/F88V/L189Q/E268V、R48L/L87I/L189Q/E268V、R48L/L87I/ F88V/L189Q、R48L/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/E65G/F88V/E144G/L189Q/E268V、R48L/ F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V 和 R48L/E65G/F82I/F88V/E144G/L189Q/E268V。
13. 如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中，所述產(chǎn)生NADPH的體系含有6-磷酸葡萄糖、 NADP+和酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶。
【文檔編號】C12N9/00GK104105794SQ201280068693
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】尹喆湖, 柳相勛, 姜馨植 申請人:尹喆湖