專利名稱：一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
以往植物轉(zhuǎn)基因多是利用單個目的基因改良植物的個別性狀，而單個目的基因的轉(zhuǎn)化不能滿足植物改良的需要，尤其是對一些代謝途徑或數(shù)量性狀的遺傳修飾。隨著植物基因工程和分子生物學研究的深入，多基因轉(zhuǎn)化研究應(yīng)運而生，并迅速發(fā)展。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化多基因共表達系統(tǒng)通常包括多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和單個載體表達多個基因表達盒系統(tǒng)。在多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，是將多個外源基因分別克隆至不同的抗性載體中，共轉(zhuǎn)化后同時添加多種抗生素實現(xiàn)多基因的共表達，由于受到抗性標記種類及組合方式的限制，這種系統(tǒng)僅能實現(xiàn)少數(shù)幾個基因的共表達，此外共表達時，還需要考慮兩個或多個表達質(zhì)粒的相容性，操作起來也比較麻煩，且轉(zhuǎn)化效率不是很高。Johnston等在構(gòu)建pRSET/pRMl相容性雙質(zhì)粒共表達體系的研究中提出，2個載體都要帶有T7啟動子，并且還要帶有不同的抗性；最重要的一點，就是2個載體的復(fù)制子不能相同，這樣才能保證在傳代過程中不會發(fā)生質(zhì)粒的丟失。但是目前大部分商品化表達載體均為ColEl/pMBl復(fù)制子，所以不同復(fù)制子的2種載體不容易得到，這會給研究工作帶來一些麻煩。在單個載體表達多個基因表達盒系統(tǒng)中，是將多個目的基因克隆于同一表達載體，外源基因含有各自的啟動子、翻譯起始和終止信號，各基因能獨立表達各自的產(chǎn)物。但是，該系統(tǒng)存在翻譯極性效應(yīng)，各基因的表達并不趨于平衡，當串聯(lián)基因較多時，這種現(xiàn)象尤為明顯，最終嚴重影響整個代謝通路的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有載體構(gòu)建技術(shù)中所存在的問題，研制出植物雙基因共表達載體及其構(gòu)建方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:1.設(shè)計引物I)根據(jù)待擴增的間隔序列，設(shè)計引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分別引入Ncol和EcoR I內(nèi)切酶酶切位點；2)根據(jù)pXCS-HAStr印載體多克隆位點結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計接頭SP-A1和SP-A2。2.載體構(gòu)建I)以載體 pGWB 605 (GenBank 登記號 AB543114)為模板，SP-F/SP-R 為引物，通過PCR擴增獲取間隔序列，產(chǎn)物大小為341bp ；2)將擴增產(chǎn)物與PMD-19T載體在16°C連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含抗生素Carb的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12h，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒進行測序；
3)用內(nèi)切酶Hind III和EcoR I酶解質(zhì)粒pXCS_HAStr印，回收大片段并與接頭SP-A1/SP-A2 連接；4)對步驟2)中測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒PMD-19T，用Ncol和EcoR I酶解質(zhì)粒pMD-19T，回收間隔序列，并與步驟3)中的連接產(chǎn)物進行連接；5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒即為植物雙基因共表達載體PXCS-Dgene-HAStr印(圖1 )，該載體能在一套真核表達系統(tǒng)中，獨立表達兩個基因。本發(fā)明所用的引物和接頭序列如下:SP-F CATGCCATGGTCTAGAGGATCCGGCTTASP-R GGAATTCGAACTTCACCAGCCCCTGTTCSP-Al AGCTTTGGTACSP-A2 CATGGTACCAA本發(fā)明一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法，該載體的成功構(gòu)建和表達，可以克服多基因共表達的不均衡性，使各基因的表達趨于平衡；也能避免多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中由于受到多種抗生素的選擇而帶來的困擾。本發(fā)明的優(yōu)點在于①通過一個質(zhì)粒同時對兩個基因進行植物轉(zhuǎn)化；②兩 個基因可以在一個真核表達盒內(nèi)獨立表達；③克服了多基因共表達的不均衡性，對8株HbWRKYll和HbWRKY7的擬南芥共表達轉(zhuǎn)基因植株進行基因表達分析，結(jié)果表明，HbWRKYll和HbWRKY7在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)表達差異不顯著(Ρ,>0.05)，在植株間存在明顯差異(圖2，圖3);④利用bar基因做篩選標記基因，簡化了轉(zhuǎn)化植株的篩選程序；⑤本發(fā)明的質(zhì)粒自身僅有5682Kb，可容納較大的基因而不影響轉(zhuǎn)化效率；⑥本發(fā)明的質(zhì)?？蓱?yīng)用于農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化中。


:圖1:雙基因共表達載體pXCS-Dgene-HAStrep的結(jié)構(gòu)示意圖。圖 2: HbWRKY 11 和 HbWRKY7 基因在共表達載體 pXCS-HbWRKYll-HbWRKY7_HAStr 印轉(zhuǎn)化的擬南芥中的半定量PCR擴增圖。圖中:A為HbWRKYll的半定量PCR擴增圖譜；B為HbWRKY7的半定量PCR擴增圖譜；M為DNA marker ；+為陽性對照質(zhì)粒pXCS_HbWRKYll-HbffRKY7-HAStrep,泳道I為陰性對照野生型擬南芥；泳道2為空白對照；泳道S1-S8為擬南芥轉(zhuǎn)基因植株株系S1-S8。圖 3: HbWRKY 11 和 HbWRKY7 基因在共表達載體 pXCS-HbWRKYll-HbWRKY7_HAStr 印轉(zhuǎn)化的擬南芥中的熒光定量分析圖。圖中:縱軸為HbWRKYlI和HbWRKY7在擬南芥轉(zhuǎn)化苗中的相對表達量，橫軸為擬南
芥轉(zhuǎn)化苗株系。圖4:共表達載體pXCS-HbWRKYll-HbWRKY7-HAStr印結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施本發(fā)明時，以構(gòu)建HbWRKYll和HbWRKY7的共表達載體為例做進一步描述，具體步驟如下:
1.設(shè)計引物I)根據(jù)待擴增的間隔序列，設(shè)計引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分別引入Ncol和EcoR I酶切位點；2)根據(jù)pXCS-HAStrep載體多克隆位點結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計接頭SP-A1和SP-A2。2.載體構(gòu)建I)以載體 pGWB605 (GenBank 登記號 AB543114)為模板，SP-F/SP-R 為引物，通過PCR擴增獲取間隔序列，產(chǎn)物大小為341bp ；2)將擴增產(chǎn)物與PMD-19T載體在16°C連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂于含抗生素Carb的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒進行測序；3)用內(nèi)切酶Hind III和EcoR I酶解質(zhì)粒pXCS_HAStr印，回收大片段并與接頭SP-A1/SP-A2 連接；4)對步驟2)中測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒PMD-19T，用Ncol和EcoR I酶解質(zhì)粒pMD-19T，回收間隔序列，并與步驟3)中的連接產(chǎn)物進行連接；5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒即為植物雙基因共表達載體pXCS-Dgene-HAStrep;6)用Cla I和Hind III內(nèi)切酶酶解質(zhì)粒pXCS-Dgene-HAStr印，回收大片段產(chǎn)物；7)用Cla I和Hind III內(nèi)切酶酶解末端帶有Cla I和Hind III酶切位點的HbffRKYll基因開放閱讀框(ORF`)序列，回收酶解產(chǎn)物后與步驟6)中的大片段產(chǎn)物進行連接；8)用EcoR I和Pst I內(nèi)切酶酶解步驟7)中的連接產(chǎn)物，回收大片段產(chǎn)物；9)用EcoR I和Pst I內(nèi)切酶酶解末端帶有EcoR I和Pst I酶切位點的HWRKY7基因開放閱讀框(ORF)序列，回收酶解產(chǎn)物后與步驟8)中的大片段產(chǎn)物進行連接；10)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含抗生素Carb的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12h，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒即為HbWRKYll和HbWRKY7的雙基因共表達載體 pXCS-HbWRKYll-HbWRKY7-HAStr印(圖 3)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于包括: 1)設(shè)計引物 a.根據(jù)待擴增的間隔序列，設(shè)計引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分別引入Ncol和EcoR I內(nèi)切酶酶切位點； b.根據(jù)pXCS-HAStr印載體多克隆位點結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計接頭SP-Al和SP-A2； 2)載體構(gòu)建 a.以載體pGWB605(GenBank登記號AB543114)為模板，SP-F/SP-R為引物，通過PCR擴增獲取間隔序列，產(chǎn)物大小為341bp ； b.將擴增產(chǎn)物與PMD-19T載 體在16°C連接過夜，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂布于含抗生素Carb的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12h，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒進行測序； c.用內(nèi)切酶HindIII和EcoR I酶解質(zhì)粒pXCS_HAStr印，回收大片段并與接頭SP-Al/SP-A2連接； d.對步驟b中測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒pMD-19T，用Ncol和EcoRI酶解質(zhì)粒PMD-19T，回收間隔序列，并與步驟c中的連接產(chǎn)物進行連接； e.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取陽性單克隆，提取質(zhì)粒，所得質(zhì)粒即為植物雙基因共表達載體 pXCS-Dgene-HAStrep。
2.按權(quán)利要求1所述的植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于:通過PCR擴增將質(zhì)粒pGWB605 (GenBank登記號AB543114)中的間隔序列兩端添加Ncol和EcoR I內(nèi)切酶酶切位點后，將間隔序列克隆入pXCS-HAStrep質(zhì)粒中，構(gòu)建了植物雙基因共表達載體pXCS-Dgene-HAStr印，該載體能在一套真核表達系統(tǒng)中，獨立表達兩個基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物雙基因共表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于通過PCR擴增將質(zhì)粒pGWB605(GenBank登記號AB543114)中的間隔序列兩端添加Ncol和EcoR I內(nèi)切酶酶切位點后，將間隔序列克隆入pXCS-HAStrep質(zhì)粒中，構(gòu)建了植物雙基因共表達載體pXCS-Dgene-HAStrep。該表達載體自身僅有5682Kb，可裝載兩個較大的外源基因，而且兩個外源基因能在一套真核表達系統(tǒng)中獨立表達。該表達載體采用bar基因做篩選標記基因，轉(zhuǎn)基因植株的篩選操作簡單，效率高。
文檔編號C12N15/82GK103088055SQ20131000488
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者安澤偉, 翟琪麟, 李雅超, 趙建文, 謝黎黎, 高新生, 李維國, 黃華孫 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所