專(zhuān)利名稱(chēng)：一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法。
背景技術(shù)：
生香酵母又稱(chēng)為產(chǎn)酯酵母，能夠以乙醇為碳源，既具備酒精發(fā)酵能力又具備醋酸發(fā)酵能力，能夠產(chǎn)生以酯香為主的多種香味物質(zhì)。其可以以糖、醛、有機(jī)酸、鹽類(lèi)為養(yǎng)料，在酯酶作用下合成酯類(lèi)。芝蘭香型白酒兼具醬香味和糊味，因而選育出生香功能強(qiáng)大的生香酵母，將有利于芝蘭香型白酒產(chǎn)酯增香、除雜味、使酒體協(xié)調(diào)，改善芝蘭香型白酒質(zhì)量。芝蘭香型白酒生產(chǎn)采用高溫堆積，中溫和低溫酵母菌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制；且隨著發(fā)酵進(jìn)行乙醇逐漸積累，當(dāng)其濃度達(dá)到一定值時(shí)便會(huì)抑制酵母菌的細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。因此選育優(yōu)良的耐高溫、耐乙醇生香酵母菌株，既能提高芝蘭香型白酒生產(chǎn)產(chǎn)率，又能改善芝蘭香白酒質(zhì)量。CN101831386A的發(fā)明公開(kāi)了一種耐鹽生香酵母篩選方法及其工藝，其方法是:采用15W的紫外燈30cm處照射菌懸液而誘變菌種，用透明圈法，初篩到比出發(fā)菌種優(yōu)良的菌種，再通過(guò)放在生產(chǎn)曲房與生產(chǎn)成曲同步培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩，最后將酵母菌經(jīng)多次馴化培養(yǎng)，平板分離，使篩選菌種純化，得到優(yōu)質(zhì)耐鹽生香酵母。但是該酵母并不能耐高溫、耐乙醇，不適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 目的在于提供一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，該方法操作簡(jiǎn)單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，所述的馴化方法步驟如下:
(1)、以總酯含量和聞香為指標(biāo)，同時(shí)兼顧酒精度，從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株；
(2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，獲得對(duì)數(shù)期生香酵母菌液，將對(duì)數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫?zé)o菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時(shí)得固定化凝膠顆粒，用無(wú)菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母；
(3)、對(duì)固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，具體設(shè)置參數(shù)為:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%-5%，最高濃度為10%-15% ;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-32 °C，最高溫度為40-45 V ;每個(gè)梯度采用乙醇體積百分比濃度的梯度增幅1%_3%及采用溫度梯度增幅
0.5°C -3 V ;循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。馴化是一種定向選育微生物的方法，其中的微生物由于逐步適應(yīng)某種特定條件，最后獲得較高耐受力和代謝活性。本發(fā)明以市售的生香酵母為對(duì)象，通過(guò)開(kāi)發(fā)合適的馴化方法，以獲得適用于芝蘭香型白酒生產(chǎn)的耐高溫耐乙醇的生香酵母。作為優(yōu)選，步驟(I)具體為:將市售的生香酵母純化培養(yǎng)后在30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國(guó)標(biāo)GB/T 10345-2007為標(biāo)準(zhǔn)，聞香并測(cè)定發(fā)酵液酒精度、總酯，達(dá)標(biāo)的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株。作為優(yōu)選，步驟(2)中凝膠球顆粒的具體制備方法為:采用1.0-3.0 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取3-5 mL對(duì)數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過(guò)注射器注入1-3%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒。作為優(yōu)選，所述凝膠球顆粒的直徑為2-3mm。作為優(yōu)選，步驟(3)中循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%_3%，最高濃度為10%-12%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-30 0C，最高溫度為 40-42 °C。作為優(yōu)選，循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度梯度具體為:2%、4%、6%、8%、10%、12%，循環(huán)梯度馴化的溫度梯度具體為:30°C、32°C、34°C、36 °C、38°C、4(TC、42。。。作為優(yōu)選，步驟(3)中循環(huán)馴化次數(shù)為2-5次。作為優(yōu)選，步驟(3)中每個(gè)梯度的馴化時(shí)間為24-72小時(shí)。作為優(yōu)選，每個(gè)梯度的馴化時(shí)間為40-48小時(shí)。作為優(yōu)選，乙醇馴 化培養(yǎng)基由乙醇與YH)液體培養(yǎng)基混合組成。本發(fā)明的有益效果是:
1、選用循環(huán)梯度馴化法，操作簡(jiǎn)單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，解決了芝蘭香型白酒生產(chǎn)中生香酵母的耐高溫、耐乙醇性能差的缺陷，提高了發(fā)酵能力，同時(shí)也為其它香型白酒相關(guān)研究提供借鑒意義。2、本發(fā)明選用固定化酵母菌形式進(jìn)行馴化，使得其可以在極端條件下進(jìn)行反復(fù)使用，具有操作快速、簡(jiǎn)單。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的循環(huán)梯度馴化流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。
本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。麥芽汁培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基及YPD液體培養(yǎng)基均為現(xiàn)有常規(guī)培養(yǎng)基。實(shí)施例1
(I)、生香酵母曲購(gòu)自山東梁山良友生物工程有限公司，取2 g干曲置于裝有100 mL無(wú)菌水并帶玻璃珠的三角瓶中，200 r/min振蕩30 min后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0_5、10_6、10_7稀釋度的樣品200 μ L均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)樣品平行涂布4塊。待長(zhǎng)出菌落后，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分離2 3次，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉(zhuǎn)入YPD固體培養(yǎng)基斜面，低溫保存，備用。取保存的純種酵母菌株，30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國(guó)標(biāo)GB/T10345-2007為標(biāo)準(zhǔn)，聞香并測(cè)定發(fā)酵液的酒精度、總酯,達(dá)標(biāo)的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株(若有5株以上的酵母菌株達(dá)標(biāo)，則選取總酯含量最高的三株作為生香優(yōu)良的酵母菌株)。(2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，獲得對(duì)數(shù)期生香酵母菌液，將對(duì)數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫?zé)o菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時(shí)得固定化凝膠顆粒，用無(wú)菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母；
采用1.5 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取4mL對(duì)數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過(guò)注射器注入2%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒然后放入4°C冰箱中固化4 h，用無(wú)菌水將固定化凝膠顆粒洗三次得固定化生香酵母。(3)、對(duì)固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基(乙醇馴化培養(yǎng)基由乙醇與YPD液體培養(yǎng)基混合組成，以下乙醇的百分比均為體積百分比)中進(jìn)行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化(如圖1所示)，具體步驟如下:
預(yù)培養(yǎng):將固定化生香酵母置于YPD液體培養(yǎng)基中(即0%乙醇)，30 °C培養(yǎng)48小時(shí)，然后按以下步驟進(jìn)行:
1、在無(wú)菌狀態(tài)下，將預(yù)培養(yǎng)后固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到2%乙醇馴化培養(yǎng)基(即乙醇含量2%)中，30°C培養(yǎng)48小時(shí): 2、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到2%乙醇馴化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)48小時(shí)；
3、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到4%乙醇馴化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)48小時(shí)；
4、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到4%乙醇馴化培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)48小時(shí)；
5、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，34°C培養(yǎng)48小時(shí)；
6、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)48小時(shí)；
7、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到8%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)48小時(shí)；
8、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到8%乙醇馴化培養(yǎng)基中，38°C培養(yǎng)48小時(shí)；
9、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到10%乙醇馴化培養(yǎng)基中，38°C培養(yǎng)48小時(shí)；
10、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到10%乙醇馴化培養(yǎng)基中，40°C培養(yǎng)48小時(shí)；
11、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，40°C培養(yǎng)48小時(shí)；
12、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)48小時(shí)；
循環(huán)回到步驟1，依次反復(fù)培養(yǎng)3個(gè)循環(huán)，最后獲得耐高溫耐乙醇的生香酵母。通過(guò)本發(fā)明的方法得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C -40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結(jié)果與馴化之前保持穩(wěn)定。實(shí)施例2
生香酵母曲購(gòu)自山東梁山徐家制曲廠，本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于對(duì)固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化參數(shù):
預(yù)培養(yǎng):將固定化生香酵母置于YPD液體培養(yǎng)基中(即0%乙醇)，30 °C培養(yǎng)42小時(shí)，然后按以下步驟進(jìn)行:
1、在無(wú)菌狀態(tài)下，將預(yù)培養(yǎng)后固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到3%乙醇馴化培養(yǎng)基(即乙醇含量2%)中，30°C培養(yǎng)42小時(shí):
2、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到3%乙醇馴化培養(yǎng)基中，33°C培養(yǎng)42小時(shí)；
3、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，33°C培養(yǎng)42小時(shí)；
4、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到6%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)42小時(shí)；
5、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到9%乙醇馴化培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)42小時(shí)；
6、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到9%乙醇馴化培養(yǎng)基中，39°C培養(yǎng)42小時(shí)；
7、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，39°C培養(yǎng)42小時(shí)；
8、將固定化生香酵母轉(zhuǎn)移到12%乙醇馴化培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)42小時(shí)；
循環(huán)回到步驟1，依次 反復(fù)培養(yǎng)5個(gè)循環(huán)，最后獲得耐高溫耐乙醇的生香酵母。通過(guò)本發(fā)明的方法得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C -40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結(jié)果與馴化之前保持穩(wěn)定。實(shí)施例3
生香酵母曲購(gòu)自濟(jì)南久益生物工程有限公司，方法與實(shí)施例1相同。最終得到耐高溫耐乙醇的生香酵母:耐溫度范圍為36°C _40°C，耐乙醇濃度范圍為5%-9% ;且總酯含量和聞香結(jié)果與馴化之前保持穩(wěn)定。本發(fā)明權(quán)利要求所給出的范圍均是可以實(shí)施的，其結(jié)果與實(shí)施例1-3類(lèi)似，在此不作贅述。以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
權(quán)利要求
1.一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法，其特征在于:所述的馴化方法步驟如下: (1)、以總酯含量和聞香為指標(biāo)，同時(shí)兼顧酒精度，從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株； (2)、將步驟(I)篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株接入麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，獲得對(duì)數(shù)期生香酵母菌液，將對(duì)數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫?zé)o菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4°C下固化4-5小時(shí)得固定化凝膠顆粒，用無(wú)菌水將固定化凝膠顆粒水洗后獲得固定化生香酵母； (3)、對(duì)固定化生香 酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，具體設(shè)置參數(shù)為:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%-5%，最高濃度為10%-15%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-32 °C，最高溫度為40-45 V ;每個(gè)梯度采用乙醇體積百分比濃度的梯度增幅1%_3%及采用溫度梯度增幅0.5°C -30C ;循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于:步驟(I)具體為:將市售的生香酵母純化培養(yǎng)后在30°C下用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)7天得發(fā)酵液，以國(guó)標(biāo)GB/T 10345-2007為標(biāo)準(zhǔn)，聞香并測(cè)定發(fā)酵液酒精度、總酯，達(dá)標(biāo)的酵母菌株即為生香優(yōu)良的酵母菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馴化方法，其特征在于:步驟(2)中凝膠球顆粒的具體制備方法為:采用1.0-3.0 g海藻酸鈉加入有50 mL蒸餾水的250 mL三角瓶中，加熱溶解后冷卻，取3-5 mL對(duì)數(shù)期生香酵母菌液加入三角瓶中混合均勻，混合液通過(guò)注射器注入1-3%重量百分比濃度的氯化鈣水溶液中，制備成凝膠球顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的馴化方法，其特征在于:所述凝膠球顆粒的直徑為2-3mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度范圍為:最低濃度為1%_3%，最高濃度為10%-12%;循環(huán)梯度馴化的溫度范圍為:最低溫度為28-30°C，最高溫度為40-42°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的馴化方法，其特征在于:循環(huán)梯度馴化的乙醇馴化培養(yǎng)基中乙醇體積百分比濃度梯度具體為:2%、4%、6%、8%、10%、12%，循環(huán)梯度馴化的溫度梯度具體為:30。。、32。。、34。。、36。。、38。。、40。。、42。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中循環(huán)馴化次數(shù)為2-5 次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的馴化方法，其特征在于:步驟(3)中每個(gè)梯度的馴化時(shí)間為24-72小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的馴化方法，其特征在于:每個(gè)梯度的馴化時(shí)間為40-48小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或5或6所述的馴化方法，其特征在于:乙醇馴化培養(yǎng)基由乙醇與YPD液體培養(yǎng)基混合組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種耐高溫耐乙醇生香酵母的馴化方法。本發(fā)明步驟為(1)從市售的生香酵母中篩選得到生香優(yōu)良的酵母菌株；(2)將對(duì)數(shù)期生香酵母菌液與海藻酸鈉水溶液在室溫?zé)o菌狀態(tài)下混合均勻，再將混合液加入到氯化鈣水溶液中制備成凝膠球顆粒，然后在2-4℃下固化4-5小時(shí)得固定化凝膠顆粒；(3)對(duì)固定化生香酵母在乙醇馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行耐高溫耐乙醇的循環(huán)梯度馴化，循環(huán)馴化多次，最后得到耐高溫耐乙醇的生香酵母。本發(fā)明選用循環(huán)梯度馴化法，操作簡(jiǎn)單、方便，可以篩選出耐高溫耐乙醇的酵母菌株，解決了芝蘭香型白酒生產(chǎn)中生香酵母的耐高溫、耐乙醇性能差的缺陷，提高了發(fā)酵能力。
文檔編號(hào)C12R1/865GK103205368SQ20131000485
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者俞建午, 李小兵, 朱增亮, 錢(qián)淑芳 申請(qǐng)人:浙江省致中和生物健康食品研究院