專利名稱：通過補加低聚木糖調整發(fā)酵纖維素復合酶配比的方法
通過補加低聚木糖調整發(fā)酵纖維素復合酶配比的方法技術領域
本發(fā)明屬于生物酶領域，具體地說，涉及一種通過補加低聚木糖來調整發(fā)酵纖維素復合酶中β葡萄糖苷酶配比的方法。技術背景
纖維素是由葡萄糖通過β -1, 4-糖苷鍵連接而成的高聚多糖分子。纖維素酶具備水解木質纖維素成糖的能力，這使得其具有廣泛的應用前景。纖維素酶為復合酶，由三類酶組成內切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)和β葡萄糖苷酶(BG)。EG作用于不溶性纖維素的表面，破壞其晶體結構，將內部的纖維素鏈暴露出來使其易于水解；CBH將暴露出來的纖維素鏈水解為2 4個單位的寡糖；BG最終將其降解為葡萄糖單糖。纖維素酶水解纖維素能力是通過多種酶的協(xié)同作用發(fā)揮的，因此纖維素酶整體酶的效果不僅取決于各個酶的自身酶活，同時取決于協(xié)同作用中酶的種類及酶之間的比例。纖維素乙醇生產(chǎn)過程是通過纖維素酶的作用把纖維素原料水解為葡萄糖后再通過微生物進行乙醇發(fā)酵生產(chǎn)。其中， 把纖維素原料水解為葡萄糖過程在一般生產(chǎn)廠家稱做糖化過程，此過程為整個乙醇生產(chǎn)過程中的關鍵步驟。在高效纖維素酶中，β葡萄糖苷酶在整個復合酶中的比例關系著纖維素原料糖化效率的高低。目前市面上的各種纖維素酶中β葡萄糖苷酶的比例并不是很理想， 有些纖維素酶整體酶活(FPA)很高，但是β葡萄糖苷酶比例太低；有些纖維素復合酶的β 葡萄糖苷酶酶活較高，但是FPA卻很低。又因為纖維素酶是復合酶，如果用純的β葡萄糖苷酶來調節(jié)其比例的話，成本太高不適宜于纖維素乙醇的生產(chǎn)。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種通過補加低聚木糖調整發(fā)酵纖維素復合酶配比的方法，該方法直接在纖維素酶發(fā)酵過程里改善纖維素復合酶中β葡萄糖苷酶比例，方法簡單，成本低廉，在保持纖維素酶整體酶活的高水平下同時提高纖維素復合酶中β葡萄糖苷酶的比例。
本發(fā)明的技術解決方案是利用低聚木糖抑制纖維素復合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纖維素酶發(fā)酵中其刺激生物菌體分泌更多的內切酶和β葡萄糖苷酶，導致最終生成的纖維素酶整體酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纖維素復合酶中的比例得到較多提升；包括以下具體步驟(O 培養(yǎng)基配制微晶纖維素 30g/L，蛋白胨 10g/L, (NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 2 g/L， MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝液量為發(fā)酵罐裝液容量的60°/Γ80% ；(2)菌種培養(yǎng)里氏木霉孢子液ClO7CFU)按玉米漿培養(yǎng)基質量的5%的接種量接至 5g/L玉米漿培養(yǎng)基中，30度搖床培養(yǎng)；(3)接種與產(chǎn)酶發(fā)酵以培養(yǎng)基體積的1°/Γ10%(ν/ν)的接種量接種培養(yǎng)24小時的里氏木霉種子液于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程參數(shù)控制為溫度30°C，溶解氧不低于20%，通氣量 O.1 O. 3vvm ；(4)過程補料在發(fā)酵培養(yǎng)48 96小時補加f10g/L低聚木糖；(5)收集結束發(fā)酵，收集發(fā)酵液用來制備纖維素酶。
本發(fā)明的特征效果是利用低聚木糖抑制纖維素復合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纖維素酶發(fā)酵中其刺激生物菌體分泌更多的內切酶和β葡萄糖苷酶，導致最終生成的纖維素酶整體酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纖維素復合酶中的比例得到較多提升，在發(fā)酵纖維素酶的過程中補加少量的低聚木糖，在保持纖維素酶整體酶活 (FPA)的情況下，顯著提高了 β葡萄糖苷酶的產(chǎn)酶效果，比例改善的纖維素復合酶在糖化過程中效率得到明顯提升，減少了纖維素乙醇生產(chǎn)等需要利用纖維素酶來進行糖化水解相關的生產(chǎn)過程的成本。


圖1為里氏木霉Rut-30傳統(tǒng)發(fā)酵生長與產(chǎn)酶曲線圖。
圖2為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵48小時補加低聚木糖的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶曲線圖。
圖3為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵72小時補加低聚木糖的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶曲線圖。
圖4為里氏木霉Rut-30在發(fā)酵96小時補加低聚木糖的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶曲線圖。
圖5為里氏木霉Rut-30不同接種量在發(fā)酵72小時補加低聚木糖的發(fā)酵生長與產(chǎn)酶曲線圖。
具體實施方式
下面結合具體的實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。本領域技術人員應當理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下為纖維素酶整體酶活FPA的定義在50°C、pH 4. 8、每分鐘水解濾紙產(chǎn)生I Mmol葡萄糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U);使用菌種為里氏木霉Rut-30。
實施例1 :取如下組分配制培養(yǎng)基微晶纖維素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培養(yǎng)基于50L的發(fā)酵罐121°C滅菌20min,降溫至30。。，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2L，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結束；測定FPA酶活為 2. lu/ml, β葡萄糖苷酶酶活為O. 6u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖1所示。
實施例2 :取如下組分配制培養(yǎng)基微晶纖維素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培養(yǎng)基于50L的發(fā)酵罐121°C滅菌20min,降溫至30。。，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2L，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結束；在發(fā)酵48小時時補加lg/L的低聚木糖；測定FPA酶活為2. 2u/ml, β葡萄糖苷酶酶活為1. 9u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖2所示。
實施例3 :取如下組分配制培養(yǎng)基微晶纖維素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培養(yǎng)基于50L的發(fā)酵罐121°C滅菌20min,降溫至30。。，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2L，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結束；在發(fā)酵72小時時補加5g/L的低聚木糖；測定FPA酶活為2. 4u/ml, β葡萄糖苷酶酶活為2. 5u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖3所示。
實施例4 :取如下組分配制培養(yǎng)基微晶纖維素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培養(yǎng)基于50L的發(fā)酵罐121°C滅菌20min,降溫至30。。，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2L，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結束；在發(fā)酵96小時時補加10g/L的低聚木糖；測定FPA酶活為2. 3u/ml, β葡萄糖苷酶酶活為2. Ou/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖4所示。
實施例5 :取如下組分配制培養(yǎng)基微晶纖維素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 ·7Η201. 6mg/L ;培養(yǎng)基于50L的發(fā)酵罐121°C滅菌20min,降溫至30°C，分別以1%、5% 和10%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液400mL、2L和4L，30°C發(fā)酵培養(yǎng)7天產(chǎn)酶發(fā)酵結束；在發(fā)酵72小時時補加5g/L的低聚木糖；測定FPA酶活分別為2. 1,2. 4u和2. 2/ ml, β葡萄糖苷酶酶活分別為2. Ou/ml、2. 5u/ml和2. 2u/ml，生長與產(chǎn)酶曲線如圖5所示。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而 易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.通過補加低聚木糖調整發(fā)酵纖維素復合酶配比的方法，其特征是利用低聚木糖抑制纖維素復合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纖維素酶發(fā)酵中其刺激生物菌體分泌更多的內切酶和β葡萄糖苷酶，導致最終生成的纖維素酶整體酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纖維素復合酶中的比例得到較多提升；包括以下具體步驟(1)培養(yǎng)基配制微晶纖維素30g/L，蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L， MgSO4 · 7H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中的裝液量為發(fā)酵罐裝液容量的60°/Γ80% ；(2)菌種培養(yǎng)里氏木霉孢子液ClO7CFU)按玉米漿培養(yǎng)基質量的5%的接種量接至5g/ L玉米漿培養(yǎng)基中，30度搖床培養(yǎng)；(3)接種與產(chǎn)酶發(fā)酵以培養(yǎng)基體積的1°/Γ5%(ν/ν)的接種量接種培養(yǎng)24小時的里氏木霉種子液于發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵過程參數(shù)控制為溫度30°C，溶解氧不低于20%，通氣量O.1^0. 3vvm ；(4)過程補料在發(fā)酵培養(yǎng)48 96小時補加f10g/L低聚木糖；(5)收集結束發(fā)酵，收集發(fā)酵液用來制備纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過補加低聚木糖調整發(fā)酵纖維素復合酶配比的方法，利用低聚木糖抑制纖維素復合酶中外切葡聚糖酶活性的原理，促使在纖維素酶發(fā)酵中其刺激生物菌體分泌更多的內切酶和β葡萄糖苷酶，導致最終生成的纖維素酶整體酶活依然保持很高的水平下，β葡萄糖苷酶在纖維素復合酶中的比例得到較多提升；采用此方法發(fā)酵生產(chǎn)纖維素復合酶具有高比例的β葡萄糖苷酶，由傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)的β/FPA=0.3提高到1，比添加純β葡萄糖苷酶調節(jié)比例的生產(chǎn)成本降低了30%以上，此方法操作簡單，無需增加特別設備。
文檔編號C12N9/42GK103045568SQ20131001406
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權日2013年1月15日
發(fā)明者熊鵬, 宇文偉剛, 賀建龍, 徐繼明 申請人:熊鵬