專利名稱：添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及在真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的過程中添加高聚木糖來提高纖維素酶酶活生產(chǎn)效率的方法。技術(shù)背景
纖維素是由葡萄糖通過β-l，4-糖苷鍵連接而成的高聚多糖分子。纖維素酶具備水解木質(zhì)纖維素成糖的能力，這使得其具有廣泛的應(yīng)用前景，廣泛地應(yīng)用于造紙、食品、 紡織、飼料、生物能源等領(lǐng)域。纖維素酶為復(fù)合酶，由三類酶組成內(nèi)切葡聚糖酶(EG，內(nèi)切酶)、外切葡聚糖酶(CBH，外切酶)和β葡萄糖苷酶(BG，β酶)。EG作用于不溶性纖維素的表面，破壞其晶體結(jié)構(gòu)，將內(nèi)部的纖維素鏈暴露出來使其易于水解；CBH將暴露出來的纖維素鏈水解為2 4個單位的寡糖；BG最終將其降解為葡萄糖單糖。纖維素酶水解纖維素能力是通過多種酶的協(xié)同作用發(fā)揮的，因此纖維素酶整體酶的效果不僅取決于各個酶的自身酶活，同時取決于協(xié)同作用中酶的種類及酶之間的比例。在造紙行業(yè)，使用纖維素內(nèi)切酶對漿料進(jìn)行處理后制成的紙張的耐破指數(shù)、撕裂指數(shù)和抗張強(qiáng)度基本保持不變的情況下， 濾水性能得到大幅度改善，有利于造紙成型部的脫水，提高了車速，同時處理后漿料的結(jié)晶度得到提高。在纖維素酶的生產(chǎn)中，目前主要局限于利用傳統(tǒng)的方法來提高纖維素酶酶活， 包括利用基因改造和誘變手段得到高產(chǎn)菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方等方法，在提高產(chǎn)率方面得到了一定的成果。但是還是有必要開發(fā)出新的方法來進(jìn)一步提高纖維素酶的活力。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法，方法簡單，操作容易，提高纖維素酶整體酶活，縮短纖維素內(nèi)切酶生產(chǎn)時間。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該提高纖維素生產(chǎn)效率的方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)基纖維素物質(zhì)為碳源，包括稻草秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿；纖維素物質(zhì) 3(T60g/L，微晶纖維素T8g/L，其余營養(yǎng)物質(zhì)蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 5 g/L,KH2PO4 2 g/ L, MgSO4 · 7H20 O. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，冷卻待接種；(2)種子液按培養(yǎng)基質(zhì)量的5 10%接種，30°C搖床培養(yǎng)1-3天，轉(zhuǎn)速160rpm，得種子液；(3)發(fā)酵按培養(yǎng)基質(zhì)量的5 10%接種種子液，發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度30°C，溶氧量不低于20%，通氣量O. Γ0. 3vvm,發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為250rpm，中期為350rpm，后期為200rpm ;發(fā)酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量為2 10g/L。
其中，產(chǎn)纖維素酶真菌包括里氏木霉、斜臥青霉、黑曲霉。
其中，添加高聚木糖不僅是指高聚木糖純物質(zhì)，還包括含有高聚木糖成分的物質(zhì)。
本發(fā)明的特征效果是利用高聚木糖會抑制纖維素酶酶制劑的活力現(xiàn)象，在纖維素酶發(fā)酵中添加高聚木糖來刺激生物菌體更快更多的分泌纖維素內(nèi)`切酶和纖維素酶，導(dǎo)致更高的纖維素酶酶活和更快的纖維素內(nèi)切酶，高聚木糖的添加量少，纖維素酶整體酶活顯著提高，大幅縮短了纖維素內(nèi)切酶的生產(chǎn)時間，實際操作簡便可行，經(jīng)濟(jì)效益顯著；通過添加高聚木糖可以使里氏木霉產(chǎn)纖維素內(nèi)切酶的時間縮短至傳統(tǒng)方法的發(fā)酵時間的15%左右，在保持傳統(tǒng)發(fā)酵時間的情況下纖維素酶整體酶活提高了約20%。


圖1為里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)酶曲線圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下為纖維素酶整體酶活FPA的定義在50°C、pH 4. 8、每分鐘水解濾紙產(chǎn)生I Mmol葡萄糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U);纖維素內(nèi)切酶CMCA的定義在50°C、pH 4. 8、每分鐘水解羧甲基纖維素鈉(CMCNa)產(chǎn)生I Mmol葡萄糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U)。
實施例1 :選用斜臥青霉為生產(chǎn)菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素3g/L，玉米秸桿 60g/L，蛋白胨 10g/L，(MM)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 5mg/ L, ZnSO4 · 7Η201. 4mg/L, MnSO4 · 7Η201. 6mg/L,培養(yǎng)基于 50L 發(fā)酵罐裝液 30L, 121°C滅菌 20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)速160rpm,得種子液；以5%的接種量接種培養(yǎng)好的斜臥青霉的種子液3L,通氣量O.1vvm, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)第3天時加入終濃度為10g/L的高聚木糖，發(fā)酵7天產(chǎn)酶結(jié)束； 測定FPA酶活為4. 2u/ml，其活力與傳統(tǒng)方法斜臥青霉產(chǎn)纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約 20%。
實施例2 :選用黑曲霉為生產(chǎn)菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素3g/L，玉米秸桿40g/ L，蛋白胨 10g/L，(MM)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 5mg/ L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L,培養(yǎng)基于 50L 發(fā)酵罐裝液量 30L, 121°C滅菌 20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)I天，轉(zhuǎn)速160rpm,得種子液；以5%的接種量接種培養(yǎng)好的斜臥青霉的種子液3L,通氣量O. 3vvm, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)第3天時加入終濃度為5g/L的高聚木糖，發(fā)酵7天產(chǎn)酶結(jié)束；測定FPA酶活為2. 8u/ml，其活力與傳統(tǒng)方法黑曲霉產(chǎn)纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約20%。
實施例3 :選用里氏木霉為生產(chǎn)菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素8g/L，稻草秸桿 30g/L,蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 g/L,KH2PO4 2 g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 5mg/ L, ZnSO4 · 7Η201. 4mg/L, MnSO4 · 7Η201. 6mg/L，培養(yǎng)基于 250mL 的搖瓶裝液量 50mL, 121。。 滅菌20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)2 天，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2. 5mL, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；分別在第O天和第3天時加入終濃 度為2g/L的高聚木糖，發(fā)酵8天結(jié)束；發(fā)酵全程測定CMCA和FPA酶活， 最終FPA最高酶活為3. 8u/ml，與傳統(tǒng)方法里氏木霉產(chǎn)纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約20% ； CMCA在24小時就已經(jīng)達(dá)到高峰，與傳統(tǒng)方法里氏木霉產(chǎn)纖維素內(nèi)切酶相比較，發(fā)酵時間縮短至15%左右；具體產(chǎn)酶曲線如圖1所示。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯 而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法，其特征是該提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)基纖維素物質(zhì)為碳源，包括稻草秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿；纖維素物質(zhì) 3(T60g/L，微晶纖維素T8g/L，其余營養(yǎng)物質(zhì)蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 5 g/L,KH2PO4 2 g/ L, MgSO4 · 7H20 O. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，冷卻待接種；(2)種子液按培養(yǎng)基質(zhì)量的5 10%接種，30°C搖床培養(yǎng)1-3天，轉(zhuǎn)速160rpm，得種子液；(3)發(fā)酵按培養(yǎng)基質(zhì)量的5 10%接種種子液，發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度30°C，溶氧量不低于20%，通氣量O. Γ0. 3vvm,發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為250rpm，中期為350rpm，后期為200rpm ;發(fā)酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量為2 10g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法，其特征是其中，產(chǎn)纖維素酶真菌包括里氏木霉、斜臥青霉、黑曲霉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法，其特征是其中，添加聞聚木糖不僅是指聞聚木糖純物質(zhì)，還包括含有聞聚木糖成分的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了添加高聚木糖提高纖維素酶生產(chǎn)效率的方法，通過在真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)過程中添加高聚木糖的手段來快速縮短發(fā)酵纖維素內(nèi)切酶的時間，提高纖維素酶的整體酶活。本發(fā)明方法簡單易行，提高纖維素酶整體酶活效果明顯，大幅度縮短產(chǎn)纖維素內(nèi)切酶的發(fā)酵時間，適用范圍廣，可用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。
文檔編號C12R1/885GK103045569SQ201310014080
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者熊鵬, 賀建龍, 周玉珍, 徐繼明 申請人:熊鵬