專利名稱：一種檢測含有kpc-15基因肺炎克雷伯菌的pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及肺炎克雷伯臨床耐藥菌株，具體涉及一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌株攜帶有新耐藥的基因KPC-15。本發(fā)明還涉及檢測攜帶有KPC-15基因的PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的常見病原菌，其耐藥的主要機制是細菌產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)。碳青酶烯類抗菌藥物是目前臨床使用的抗菌譜廣、抗菌活性強的一類抗菌藥物，尤其對產(chǎn)ESBLs和AmpC酶腸桿菌科細菌感染的治療有較好的療效；但隨著碳青酶烯類抗菌藥物在臨床上使用增加，碳青霉烯類抗生素的耐藥性也不斷增加且多重耐藥性菌株的不斷增加常導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延。近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌呈世界性流行。腸桿菌科細菌對碳青霉稀類抗生素耐藥的機制主要為AmpC酶過度表達合并外膜孔蛋白丟失，青霉素結(jié)合蛋白對碳青霉烯類抗生素親和力的下降，碳青霉烯類抗生素水解β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生I。其中，耐藥的主要機制就是細菌產(chǎn)生碳青霉烯酶。KPC(Klebsiellapneumoniae carbapenemase,KPC)型碳青霉烯酶屬于功能分類法的2f組，分子分類法的A類，是一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸β -內(nèi)酰胺酶，以絲氨酸作為活性位點，是目前引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類 耐藥的主要原因。自2001年首次報道第一株產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌后，迅速在世界各地出現(xiàn)傳播[5]。由于KPC酶對抗生素廣泛的水解活性和編碼基因的可移動性，它的出現(xiàn)和流行給臨床治療帶來嚴(yán)重威脅，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，也是各國醫(yī)務(wù)人員關(guān)注的焦點。2007年，浙江省報道了全國第一例產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌16，隨后產(chǎn)KPC酶細菌在浙江省及華東地區(qū)等省市快速蔓延，可能與東部地區(qū)經(jīng)濟發(fā)達、醫(yī)療水平較高及抗生素的使用有關(guān)，給碳青霉烯酶類抗生素的使用及腸桿菌科細菌感染治療造成嚴(yán)重威脅。近來，產(chǎn)KPC酶菌株在全國也有逐漸增多的趨勢并在多個地方造成流行。KPC型碳青霉烯酶是一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，這一基因定位在質(zhì)粒上的特性可能是其易于傳播和播散的原因?，F(xiàn)在世界范圍有KPC-2至KPC-15(登入號KC433553) 14種KPC基因變異亞種，KPC-1因為發(fā)現(xiàn)檢測有誤，實際上與KPC-2是同一亞型，已取消命名。本研究者從臺州市立醫(yī)院心胸外科病人的血液培養(yǎng)標(biāo)本中分離得到一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌，編號為KP1241該菌株表現(xiàn)出對亞胺培南、厄他培南的耐藥，經(jīng)法國生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定為肺炎克雷伯細菌。通過對該菌株所攜帶質(zhì)粒的分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的KPC基因亞種(KPC-15),進一步的通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)е录毦鷮Χ喾N藥物耐藥。新耐藥基因的發(fā)現(xiàn)，對于合理使用抗生素、減少嚴(yán)重感染時產(chǎn)生碳青霉烯類耐藥細菌，以及研發(fā)新藥物抑制細菌耐藥性意義重大。基于上述目的，研制快速檢測樣品中KPC-15基因的PCR檢測試劑盒以實現(xiàn)對含KPC-15基因致病菌的快速、準(zhǔn)確地檢測，有利于進一步監(jiān)測耐藥菌株、指導(dǎo)臨床合理用藥、減少耐藥菌產(chǎn)生和傳播，同時研究抗生素的耐藥機制及基因環(huán)境開辟了新的道路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種KPC-15基因的PCR檢測試劑盒，用于含有KPC-15的肺炎克雷伯臨床多重耐藥菌的檢測。本發(fā)明從臺州市立醫(yī)院心胸外科病人的血液培養(yǎng)標(biāo)本中分離得到一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌，編號為KP1241該菌株表現(xiàn)出對亞胺培南、厄他培南的耐藥，經(jīng)法國生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定為肺炎克雷伯細菌。通過對該菌株所攜帶質(zhì)粒的分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的KPC基因亞種，命名為KPC-15。利用設(shè)計的擴增引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4擴增KPC-15基因，并用設(shè)計的測序引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6對PCR產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果在NCBI上進行BLSAT比對，發(fā)現(xiàn)KP1241所攜帶的KPC基因為新的KPC變異基因，對蛋白序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該變異主要變異在第119突變成L，第146為突變成K。KPC-15基因ORF和氨基酸序列分別見序列:SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)正是由于這一新的基因?qū)е铝嗽摲窝卓死撞哪退幪匦缘母淖儭檫M一步證實該受體菌獲得的抗性來源于KPC-15基因，本發(fā)明將該基因克隆入pET32a載體中，并將其轉(zhuǎn)化入野生型E.coli JM109中，通過含有Amp的平板選陽性克隆(含有pET32a-KPC-15質(zhì)粒的細菌)。將陽性克隆做藥敏試驗，結(jié)果顯示KPC-15基因可以使細菌具有對以下藥物耐藥:氨曲南、環(huán)丙沙星、頭孢替坦、妥布霉素、丁胺卡拉、頭孢唑林、頭孢吡廂、頭孢他啶、頭孢曲松、慶 大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、復(fù)方新諾明、頭孢哌酮/舒巴坦(舒普深)、米諾霉素。本發(fā)明公開了一種KPC-15的PCR檢測試劑盒，包括:(I)DNA裂解液:100mM 的 NacCl，pH8.0 的 IOmM 的 Tris_HCl，pH8.0 的 25mmol/L 的EDTA，按重量體積比含量為I %的SDS和4 μ g/ μ L的蛋白酶K的混合溶液。(2) PCR 反應(yīng)液:終濃度各 50-400 μ mol/L 的 4 種 dNTPs，終濃度為 0.1-0.5 μ mol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，其核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示；1.5-5.0 μ mol/L 的 Mg2+。(3)陽性對照樣品:含KPC-15基因的陽性質(zhì)粒。(4)高保真PCR酶按每個PCR反應(yīng)含1.0U加入，反應(yīng)液中不含PCR擴增的酶；本發(fā)明所述的PCR試劑盒檢測KPC-15基因的方法，步驟如下:1、樣品的預(yù)處理:取檢測的樣品，加入600 μ L滅菌的生理鹽水充分洗滌樣品得到含目標(biāo)菌的懸液2、PCR 擴增(I)按照擴增數(shù)η(η =樣品數(shù)+2)取PCR反應(yīng)液，高保真PCR酶混勻于一離心管
中，按每管分裝，蓋上管蓋備用。(2)先將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA加入對應(yīng)的反應(yīng)管中，最后取出陽性對照加入另一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置PCR儀上。
(3) PCR 擴增程序:95°C 預(yù)變性 5min 后，95°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C 延伸lmin，如此進行30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，同時應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照；3、PCR擴增產(chǎn)物分析取5-10 μ L擴增后的樣品，采用1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因。片段大小為284bp。根據(jù)KPC-15基因序列，設(shè)計特異性引物，研制了 PCR檢測試劑盒以及提供一種使用該試劑盒快速檢測樣品中KPC-15基因的方法，以實現(xiàn)對含KPC-15基因致病菌的快速、準(zhǔn)確地檢測。


圖1KPC-15基因的系統(tǒng)進化樹。
具體實施例方式通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實施例只是為進一步說明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例一肺炎克雷伯臨床耐藥菌KP1241的藥敏檢測肺炎克雷伯臨床耐藥菌KP1241是本人從臺州市立醫(yī)院心胸外科病人的血液培養(yǎng)標(biāo)本中分離得到。該菌株表現(xiàn)出對亞胺培南、厄他培南的耐藥，經(jīng)法國生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定為肺炎克雷伯細菌，將其編號KP1241。1、材料與方法法國生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀；細菌鑒定卡:VITEK2GN Test kit ；細菌藥敏卡:法國bio Merieux的AST-GN13。AST-GNl3藥敏種類有:阿米卡星、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他定、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、厄他培南、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、SMZ。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。補充藥敏紙片(藥敏平板瓊脂擴散實驗):紙片來源于英國Oxoid公司，有頭孢哌酮/舒巴坦(75yg/30yg)、米諾環(huán)素(30 μ g)。儀器鑒定過程:將血液培養(yǎng)陽性的菌株轉(zhuǎn)種到血平板上分離培養(yǎng)(在35°C含5%CO2孵育箱中培養(yǎng)16-18h)，然后將分離的純細菌按操作程序在VITEK2上機作細菌鑒定與藥敏試驗。補充藥敏試驗:將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木和磕ㄔ贛H平板上，按操作程序貼上頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素紙片，在35°C含5% CO2孵育箱中培養(yǎng)16-18h后，按CLSI2012標(biāo)準(zhǔn)鑒定藥敏結(jié)果。2、結(jié)果生化特性:中等大小的革蘭氏陰性桿菌，KIA產(chǎn)酸/產(chǎn)酸，葡萄糖與乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，氧化酶陰性，VP陽性，吲哚陰性，枸櫞酸鹽陽性，動力陰性，不產(chǎn)H2S,符合肺炎克雷伯菌的特性，經(jīng)VITEK2微生物分析儀鑒定為肺炎克雷伯菌，鑒定概率為99%。藥敏實驗結(jié)果如表I所示表I肺炎克雷伯臨床耐藥菌KP1241的藥敏檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種KPC-15的PCR檢測試劑盒，包括DNA裂解液、PCR反應(yīng)液、陽性對照樣品、高保真PCR酶； 其中所述的DNA裂解液包括:100mM的NacCl，pH8.0的IOmM的Tris-HCl，pH8.0的25mmol/L的EDTA，按重量體積比含量為I %的SDS和4 μ g/ μ L的蛋白酶K的混合溶液。
所述的PCR反應(yīng)液包括:終濃度各50-400 μ mo I/L的4種dNTPs，終濃度為0.1-0.5 μ mol/L的引物KPC-15TF和KPC-15TR，其核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.7和 SEQ ID N0.8 所示；1.5-5.0 μ mol/L 的 Mg2+。
所述的陽性對照樣品為KPC-15基因的陽性質(zhì)粒。
2.權(quán)利要求1所述試劑盒檢測KPC-15的方法，具體包括以下步驟: 1)樣品的預(yù)處理:取檢測的樣品，加入600μL滅菌的生理鹽水充分洗滌樣品得到含目標(biāo)菌的懸液。
2)PCR擴增:按照擴增數(shù)η(η=樣品數(shù)+2)取PCR反應(yīng)液，高保真PCR酶混勻于一離心管中，按每管分裝，蓋上管蓋備用。先將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA加入對應(yīng)的反應(yīng)管中，最 后取出陽性對照加入另一反應(yīng)管中，各反應(yīng)管標(biāo)記后離心，取出置PCR儀上。PCR擴增程序:95°C預(yù)變性5min后，95°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，如此進行30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，同時應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。
3)PCR擴增產(chǎn)物分析:取5-10μ L擴增后的樣品，采用1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，當(dāng)PCR擴增片段大小為284bp時，樣品判定為陽性，即樣品含有KPC-15基因；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物為出現(xiàn)284bp的片段時，樣品判定為陰性，即樣品不含有KPC-15基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測含有KPC-15基因肺炎克雷伯菌的PCR試劑盒，所述試劑盒含有擴增KPC-15基因的特異性引物KPC-15TF和KPC-15TR，所述引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。本發(fā)明還公開了所述的所述試劑盒的使用方法。本發(fā)明的PCR試劑盒有利于監(jiān)測耐藥菌株、指導(dǎo)臨床合理用藥、減少耐藥菌產(chǎn)生和傳播。
文檔編號C12Q1/68GK103088146SQ20131004703
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者王冬國, 楊林軍, 王海寶, 陶寶鴻, 燕東亮, 胡恩平 申請人:臺州市立醫(yī)院