一株水貂肺炎克雷伯氏菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株水貂肺炎克雷伯氏菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapeneumoniae)屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬，革蘭氏 染色為陰性（G)。兼性厭氧，無鞭毛和芽抱，有明顯的芙膜，多數(shù)菌株有菌毛。肺炎克雷伯氏 菌有K(芙膜）抗原與0 (菌體）抗原，前者為脂多糖類，后者為多糖類。K抗原可用于菌型的 鑒定。根據(jù)芙膜多糖化抗原）分型，可將肺炎克雷伯氏菌分為82個K血清型，其中K1，K2 和K5血清型是與人和動物體的嚴(yán)重感染性疾病密切相關(guān)的。該菌于1883年化iediander 從患大葉性肺炎病人的肺組織中首次分離得到，該菌是醫(yī)院獲得性肺炎（HAP)的常見致病 菌，近年來在人類感染中該菌是除大腸桿菌外的醫(yī)源性感染最重要條件致病菌，該菌可引 起全身多個部位發(fā)生感染，但在尿路和呼吸道的發(fā)病率最高，當(dāng)機體的免疫力降低或者由 于長期大量的使用抗生素而導(dǎo)致機體菌群失調(diào)時而引起感染，可導(dǎo)致肺炎、腦膜炎、肝脈 月中、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎、傷口感染和全身敗血癥等，給臨床治療帶來了很大困難，發(fā)病率 和死亡率極高。在動物感染中各種家畜、家禽、野生動物及水生動物都可感染，家禽中肉雞 和蛋雞都易感染，家畜中豬、牛、羊和懶兔均可感染該病，此外野生及水生動物中的大熊貓、 金絲猴、中華藝等也可感染，其中W小白鼠和15日齡W內(nèi)小雞對本菌最易感。近幾年來動 物感染克雷伯氏菌病的報道不斷增多，該菌可W導(dǎo)致維雞肝臟壞死，家兔的肺炎、腸炎，大 熊貓的腹瀉、肝炎，豬的腹瀉W及牛、羊死亡等，并可引起毛皮動物水貂、廳鼠、竹鼠等大量 死亡。由于抗生素類藥物的濫用，導(dǎo)致該菌的耐藥性不斷增強，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨 床治療帶來極大困難。
[0003] 肺炎克雷伯氏菌不僅對畜禽的危害越來越嚴(yán)重，而且引起毛皮動物（狐貍、駱子、 水貂）的發(fā)病率也呈上升趨勢，導(dǎo)致毛皮動物的肺炎、子宮炎、乳腺炎及其它化脈性炎癥。 在國外，1947年Morris在美國首次報道了貂克雷伯氏菌病，W脈腫蜂窩織炎后軀麻搏和 脈毒敗血癥為特征，在國內(nèi)，趙純德等在1987年首次報道了舟山市兩個貂場發(fā)生肺炎克 雷伯氏菌，W頸部急性脈腫為主要特征，病死率較高。此后國內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)肺炎克雷伯氏 菌引起毛皮動物發(fā)病的報道。國內(nèi)目前已有學(xué)者報道過肺炎克雷伯氏菌在小鼠上的半數(shù) 致死量，馬磊等從竹鼠中分離的克雷伯氏菌對小白鼠的半數(shù)致死量為4. 5XlO^CFU/只；張 詩渝等測定了分離株KPm0912與標(biāo)準(zhǔn)株KP1300的半數(shù)致死量，分別為1. 1Xl〇5CFU/mL和 1. 3Xl〇6CFU/mL;鐘世勵等從毛皮動物分離的肺炎克雷伯氏菌K1對小鼠的半數(shù)致死量為 1. 53X108CFU/mL;王劍等從水貂中分離的兩株克雷伯氏菌KP-ZC1和KP-ZC2半數(shù)致死量分 別為4. 9Xl〇6CFU/mL、3. 1Xl〇6CFU/mL;李富祥等分離的KP14013株對小白鼠半數(shù)致死量 為 3Xl〇i'Sc即。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明從水貂克雷伯氏菌病病料中分離克雷伯氏菌，經(jīng)劃線分離、純化培養(yǎng)得到 一株毒性優(yōu)異的克雷伯氏菌；經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)、透射電鏡及核酸序列分析等方法 鑒定、證實分離株為肺炎克雷伯氏菌；為下一步深入開展肺炎克雷伯氏菌的相關(guān)研究及控 制提供了一定的基礎(chǔ)。
[000引技術(shù)方案 一株水貂肺炎克雷伯氏菌，命名為WM0K株，保藏號：CGMCCNO. 11222。
[0006] 本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株為K2型，革蘭氏染色為陰性（G-)，兼性厭 氧，無鞭毛和芽抱，有明顯的芙膜，多數(shù)菌株有菌毛，呈兩端純圓的桿狀。
[0007] 本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株，其耐藥性情況為： 耐藥：氨節(jié)西林、氨節(jié)青霉素、頭抱挫林、頭抱他晚、頭抱曲松、頭抱化朽、安曲南、慶大 霉素、復(fù)方新諾明； 中敏：妥布霉素、環(huán)丙沙星； 敏感：贓拉西林、頭抱替坦、厄他培南、亞胺培南、阿米卡星、左氧氣沙星、巧喃妥英。
[0008] 本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏菌的獲取方法： 將病死水貂(死亡前主要表現(xiàn)為精神不振、消瘦呼吸困難等）肝臟內(nèi)部組織在尿路菌群 顯色培養(yǎng)基上于37°C恒溫培養(yǎng)12小時；挑取單個藍(lán)灰色菌落(肺炎克雷伯氏菌在尿路菌群 顯色培養(yǎng)基上生長為藍(lán)灰色菌落）將其在膜蛋白腺大豆瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離，進(jìn)行菌落 的純化。
[0009] 對純化好菌落進(jìn)行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序后的結(jié) 果進(jìn)行Blast,與GenBank中的已發(fā)表的水貂肺炎克雷伯氏菌的基因序列相對比，同源性 達(dá)到 99%-100〇/〇。
[0010] 本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株，對KM小鼠的LDs。為2. 1X10°'5CRJ。毒力 明顯強于目前已報道的其它克雷伯氏菌菌株。
[0011] 本發(fā)明首次測定了肺炎克雷伯氏菌在水貂上的LDw，本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏 菌WM0K株，對水貂的LDs。為 3. 8X10 °'7CRJ。
[0012] 有益效果 本發(fā)明的水貂肺炎克雷伯氏菌WM0K株毒性很強，可作為后續(xù)產(chǎn)品研發(fā)時的攻毒用菌 株。
[0013] 保藏信息 保藏時間：2015年8月11日 保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 保藏編號：CGMCCNO. 11222 保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所 分類命名：肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapeneumoniae)。
【附圖說明】
[0014] 圖1，肺炎克雷伯氏菌PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖：M水貂肺炎克雷伯氏菌DNA標(biāo)準(zhǔn) DL2 000:1-6.命名為肺炎克雷伯氏菌WM0K株菌落的PCR產(chǎn)物；7陽性對照購買于美國 標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中屯、的肺炎克雷伯氏菌ATCC700603作為對照）;8.陰性對照購買于美 國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中屯、的大腸桿菌ATCC25922作為陰性對照）； 圖2,電鏡下觀察到的本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌WMOK株的照片。
【具體實施方式】
[0015]下述實施例中，病料來自山東某規(guī)?；躔B(yǎng)殖場，病貂死亡前主要表現(xiàn)為精神 不振、消瘦呼吸困難等。SPF級昆明小鼠購自山東省實驗動物中屯、。膜蛋白腺大豆瓊脂培