胰島素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供胰島素的制備方法。本發(fā)明涉及一種將胰島素前體轉化為活性胰島素化合物、優(yōu)選長效胰島素的改進的方法。具體地講，本發(fā)明提供一種方法，其中可逆地封閉Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，從而使胰蛋白酶能夠準確切割經可逆封閉的Lys-Arg前體胰島素。
【專利說明】胰島素的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及將胰島素前體轉化為長效活性胰島素化合物的改進的方法。
【背景技術】
[0002]胰島素是參與血糖濃度調節(jié)的一種胰腺激素。例如，將人、豬和牛的胰島素、胰島素類似物和混合胰島素給予胰島素依賴型糖尿病患者，以調節(jié)他們的血糖濃度。
[0003]成熟胰島素是一種兩條鏈的肽激素，含有51個氨基酸。其A-鏈由21個氨基酸組成，B-鏈由30個氨基酸組成。該分子含有2個鏈間二硫鍵和I個A-鏈內二硫鍵。在體內，該激素首先被合成為一條長的前體分子，即前胰島素原(preproinsulin),隨后被加工為胰島素原(proinsulin)和胰島素。最初的加工步驟是在初生鏈穿過內質網膜轉移期間經蛋白水解而除去前肽。然后，胰島素原折疊并伴隨二硫鍵氧化并轉運至高爾基體，在此包裝成為分泌液泡。在此經特異性蛋白酶進一步加工形成成熟胰島素。通過這樣的蛋白水解切害I]，將胰島素原中連接B鏈和A鏈的C-鏈(C肽)切去。C肽長度為35個氨基酸并在其氨基端和羧基端分別包含2對堿性氨基酸，即ArgArg和LysArg (Steiner, 1984)。一般認為，將兩條胰島素鏈連接在一起的C肽有助于合適的折疊和二硫鍵的形成。事實上，其缺失或被僅有一個到數個氨基酸長的較短的合成肽橋取代，仍然允許自胰島素-樣前體產生合適的胰島素。
[0004]直到20世紀80年代，胰島素仍是從牛和豬的胰腺制品中分離。早期研究已經證明，可通過將呈S-磺酸形式的A鏈和B鏈結合或通過還原型胰島素原的自發(fā)再氧化而在體外生產胰島素。然后再 經胰蛋白酶和羧肽酶B處理而回收胰島素。然而，這些方法對于大規(guī)模生產來說并不實用。以后，通過轉肽作用(例如美國專利號4，343，898)，使用胰蛋白酶和蘇氨酸，替代豬胰島素中的B30丙氨酸(豬胰島素和人胰島素之間的唯一差異)，可自豬胰島素產生半合成人胰島素。
[0005]例如EP87，238提供了在溶劑系統中進行的轉肽反應，所述溶劑系統包含介于大約75%至97%(v/v)之間的至少一種非水反應易混溶劑，其包含至少大約50%(vol/vol)丁 -1，4- 二醇。通過使用L-絲氨酸特異性羧肽酶而進行的轉肽方法公開于美國專利號4，579，820。

【發(fā)明內容】

[0006]在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟:(a)可逆地封閉Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的PH6-11的溶液；和(b)切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應，從而制備胰島素。
[0007]在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟:將Lys-Arg前體胰島素暴露在11.0-11.5的pH值下；(b)可逆地封閉所述Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的PH6-11的溶液；和(c)切割所述Lys-Arg前體胰島素,包括使步驟(b)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應，從而制備胰島素。
[0008]在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟:(a)可逆地封閉Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的PH9的溶液；(b)切割所述Lys-Arg前體胰島素，包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應；和(c)將步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至pH6-10(步驟(c))，從而制備胰島素。
[0009]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括胰島素純化操作，例如:微濾、離子交換色譜法、反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)或其任意組合。
[0010]在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括胰島素結晶，包括在檸檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰島素接觸Zn++。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是描述自Lys-Arg胰島素前體制備本發(fā)明胰島素的方法流程。
[0012]圖2是膜島素-LysArg生廣流程。
[0013]圖3是純化的胰島素-LysArg的RP-HPLC分析圖及與市售來得時(Lantus)的比較。來得時之前的峰是防腐劑間甲酚。
[0014]圖4是本發(fā)明的 重組人胰島素-類似物前體表達盒的核苷酸序列和相應氨基酸序列。B鏈氨基酸在方框內。A鏈氨基酸在方框內。在胰島素-類似物序列之前的最初64個氨基酸(編碼Cu/Zn-超氧化物歧化酶的部分序列)和Lys Arg橋用粗體表示。RBS-核糖體結合位點。
[0015]圖5是顯示在接受STZ的糖尿病誘導并隨后經每天注射(見箭頭)指定試驗材料治療的Sprague-Dawley雄性大鼠中的組平均土SD血糖值的圖。上圖是對媒介物對照血糖水平歸一化后的表達。
[0016]圖6是通過本文所述方法產生的胰島素的氨基酸序列(6A和6B)。
[0017]圖7顯示在隨機交叉研究中，在給予速效胰島素(優(yōu)泌林R)、長效胰島素(來得時)和長效胰島素即胰島素-LysArg (胰島素KR)之后,在患糖尿病的比格犬(beagle dog)中的血糖水平(mM)隨時間(小時)變化的圖。
【具體實施方式】
[0018]在一個實施方案中，本發(fā)明提供自胰島素前體制備胰島素的改進的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的改進的方法。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的改進的方法中，將Lys-Arg胰島素前體在堿性pH中直接溶解并折疊，然后進行胰蛋白酶處理，從而以簡單的改進方式產生胰島素。在另一個實施方案中，依照本發(fā)明的方法利用Lys-Arg胰島素前體,產生真實的人胰島素或其長效B3 ILys_B32Arg變體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的改進的方法包括:用檸康酸酐可逆地封閉Lys-Arg胰島素前體中的Lys殘基并用胰蛋白酶處理經可逆封閉的Lys-Arg胰島素前體，從而切除前導肽和“C-鏈”連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明的改進的方法包括:用檸康酸酐可逆地封閉LyS-Arg胰島素前體中的Lys殘基并用胰蛋白酶處理經可逆封閉的Lys-Arg胰島素前體,從而切除前導肽和“c-鏈”連接，尤其是在Arg殘基位置(參見圖1)。
[0019]在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法通過提供前體胰島素內的一個特異性胰蛋白酶切割位點而克服了現有技術水平的缺陷。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法是基于可逆地封閉前體胰島素內的不想要的胰蛋白酶切割位點。在另一個實施方案中，可逆地封閉前體胰島素內的不想要的胰蛋白酶切割位點，克服了現有技術水平的缺陷。
[0020]在另一個實施方案中，通過在pH9(通過自動滴定而保持該pH值)與過量朽1康酸酐反應，所述前體蛋白中的所有賴氨酸殘基都被可逆地封閉。在另一個實施方案中，剩余試劑被水解為檸康酸。在另一個實施方案中，剩余試劑通過加入5mM乙醇胺而猝滅。在另一個實施方案中，所述胰島素前體的?；苌铽@得-8的額外負電荷，這可在尿素-PAGE上容易地分析出。
[0021]在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素(本文所述方法的產物)是Pl值大約6.9的胰島素-LysArg。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素-LysArg具有長的體內活性特征。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素-LysArg具有非常長的體內活性特征。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素-LysArg具有儲庫-樣(depot-like)特征，因為它在皮下注射之后沉淀。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素-LysArg緩慢溶解到循環(huán)中。
[0022]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的改進的方法，所述方法包括以 下步驟:(a)可逆地封閉所述Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的溶液；和(b)切割所述Lys-Arg前體胰島素,包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應。
[0023]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括用羧肽酶B處理來自步驟(b)的所述胰島素的步驟，所述酶切除堿性氨基酸，從而使來自步驟(b)的所述胰島素轉化為成熟人胰島素。
[0024]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括在步驟(a)之前將Lys-Arg前體胰島素暴露在11.0-11.5的pH值下。在另一個實施方案中，在步驟(a)之前將Lys-Arg前體胰島素暴露在11.0-11.5的pH值下，導致最佳折疊。在另一個實施方案中，在折疊步驟結束之時，用HCl將pH降低至9。
[0025]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括使來自步驟(b)的所述胰島素單獨接觸鋅鹽或接觸鋅鹽與魚精蛋白的組合的步驟。在另一個實施方案中，使來自步驟(b)的所述胰島素單獨接觸鋅鹽或接觸鋅鹽與魚精蛋白的組合，導致本發(fā)明的胰島素沉淀。在另一個實施方案中，以其晶體和/或非晶體(來自沉淀)形式配制本發(fā)明的遲效胰島素。
[0026]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括步驟(c)，其中步驟(c)包括將得自步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至pH8-9。在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括步驟(C)，其中步驟(c)包括將得自步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至pH8.2-8.8。在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括步驟(c)，其中步驟(c)包括將得自步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至pH8.4-8.6。在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括步驟(c)，其中步驟(C)包括將得自步驟(b)的所述胰島素的PH調節(jié)至pH8.5。在另一個實施方案中，步驟(c)還包括從步驟(b)的所述胰島素的B-鏈的C-端除去Arg殘基和Lys殘基，包括使步驟(b)的所述胰島素與羧肽酶B (CPB)反應。
[0027]在另一個實施方案中，將至少50%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中，將至少60%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中，將至少70%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中,將至少80%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中，將至少85%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中，將至少90%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。在另一個實施方案中，將至少95%的Lys-Arg前體胰島素轉化為胰島素。
[0028]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括步驟(d)。在另一個實施方案中，步驟(d)在步驟(b)之后。在另一個實施方案中，步驟(d)在步驟(C)之后。在另一個實施方案中，步驟(d)包括純化所述胰島素。在另一個實施方案中，通過微濾進行純化。在另一個實施方案中，通過離子交換色譜法進行純化。在另一個實施方案中，通過反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進行純化。
[0029]在另一個實施方案中，自Lys-Arg胰島素前體制備胰島素的所述改進的方法還包括使所述胰島素結晶的步驟(e)。在另一個實施方案中，步驟(e)在步驟(d)之后。在另一個實施方案中，步驟(e)在步驟(C)之后。在另一個實施方案中，步驟(e)在步驟(b)之后。在另一個實施方案中，使胰島素結晶是使所述胰島素接觸Zn++。在另一個實施方案中，使胰島素結晶是在檸檬酸-乙醇中使所述胰島素接觸Zn++。在另一個實施方案中，使胰島素結晶是在檸檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰島素接觸Zn++。
[0030]在另一個實施方案中，本發(fā)明的前體胰島素分離自經破碎細菌的包涵體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的前體胰島素在堿性PH時容易溶解和折疊。在另一個實施方案中，通過特異性胰蛋白酶切割連接的Arg殘基，同時用檸康酸酐可逆地封閉所有Lys殘基，而產生胰島素。在另一個實施方案中，該試劑在大約pH9時易于與氨基反應,但所述?；苌镌谒嵝訮H時被完全水解。在另一個實施方案中，在離子交換色譜法之后，純化的胰島素-LysArg變體通過RP-HPLC而進一步純化并配制為長效胰島素，或用羧肽酶B(CPB)處理，隨后從B-鏈的C-端除去Arg殘基和Lys殘基，從而得到真實的人胰島素。在另一個實施方案中，最終純化步驟通過制備型反相(RP)HPLC除去胰島素-樣分子和其它次要污染物。在另一個實施方案中，通過在檸檬酸-乙醇(pH6.4)中用Zn++結晶而回收胰島素，并真空干燥。
[0031]Lys-ArR胰島素前體
[0032]在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體是包含Cu/ZnSOD部分的雜合蛋白。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體的N-端序列通過Arg殘基與胰島素原樣部分融合，其中LysArg將胰島素的B鏈和A鏈連接在一起。
[0033]在另一個實 施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含以下氨基酸序列:RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKRGIVEQCCTSICSLYQL ENYCG (SEQ ID NO:1)。在另一個實施方案中，Lys-Arg 胰島素前體包含以下氨基酸序列:RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKRGIVEQCCTSICSLYQL ENYCN(SEQ ID NO:2) ?在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是5-150個氨基酸的任何長度。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是10-120個氨基酸的任何長度。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是20-100個氨基酸的任何長度。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是10-100個氨基酸的任何長度。在另一個實施方案中，所述前導序列不限于任何特定序列。
[0034]在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少5個氨基酸。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少10個氨基酸。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少20個氨基酸。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少30個氨基酸。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少50個氨基酸。在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，在所述氨基酸序列之前(在氨基端)是至少80個氨基酸。
[0035]在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體包含以下氨基酸序列:
[0036]MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVffGSIKGLTEGLHG FHVHEFGDNTAGSTSAGTRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK TKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG(SEQ ID NO:3)。
[0037]在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體由編碼本發(fā)明的Lys-Arg胰島素前體氨基酸序列的任何DNA 分子來編碼。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO: K SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的氨基酸序列。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外5個氨基酸。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外10個氨基酸。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外20個氨基酸。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO:1或SEQID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外30個氨基酸。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外50個氨基酸。在另一個實施方案中，編碼Lys-Arg胰島素前體的DNA分子編碼SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列和在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列之前的至少額外80個氨基酸。
[0038]在另一個實施方案中，Lys-Arg胰島素前體由包含以下核酸序列的DNA分子來編碼:GAAAATTATTGCGGCTAAGGCATTATTAATTTTGAACAGAAAGAAAG CAATGGTCCGGTTAAAGTTTGGGGTAGCATTAAAGGTCTGACCGAAG GTCTGCATGGTTTTCATGTTCATGAATTTGGCGATAATACCGCAGGTA GCACCAGCGCAGGCACCCGTTTTGTTAATCAGCATCTGTGTGGTAGC CATCTGGTTGAAGCACTGTATCTGGTTTGTGGTGAACGCGGTTTTTTT TATACCCCGAAAACCAAACGCGGTATTGTTGAACAGTGTTGTACCAG CATTTGTAGCCTGTATCAGCTGATGGCAACCAAAGCAGTTAGCGTTC TGAAAGGTGATGGTCCGGTTCAG(SEQ ID NO:4)。
[0039]在另一個實施方案中，經本發(fā)明的方法或方法產生的胰島素包含兩條鏈:(I)包含以下氨基酸序列的鏈A:GIVEQCCTSICSLYQLENYCG (SEQ ID NO:5)或GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:6);和(2)包含以下氨基酸序列的鏈 B:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKR (SEQ ID NO:7)或 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ IDNO:8)(另見圖6)。
[0040]在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素是經本文所述的方法產生的胰島素。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素是人胰島素。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素是哺乳動物胰島素。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素是農場動物胰島素。在另一個實施方案中，本發(fā)明的胰島素是胰島素類似物或胰島素衍生物。
[0041]在另一個實施方案中，胰島素類似物是天然發(fā)生的胰島素的類似物，其差異在于在相應的或相同的天然發(fā)生的胰島素上至少一個天然發(fā)生的氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代和/或添加/缺失至少一個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，添加的和/或取代的氨基酸殘基也可以是非天然發(fā)生的那些。在另一個實施方案中，胰島素類似物描述于EP0214826、EP0375437和EP0678522，其通過引用全部結合到本文中。
[0042]在另一個實施方案中，胰島素衍生物是天然發(fā)生的胰島素的衍生物或得自經化學修飾的胰島素類似物。在另一個實施方案中，所述化學修飾包括在一個或多個氨基酸上添加一個或多個特定化學基團。
[0043]在另一個實 施方案中，本發(fā)明的胰島素是選自以下的胰島素類似物:LysB28ProB29人胰島素，B28Asp人胰島素,位置B28的脯氨酸被Leu、Asp、Ala、Val或Lys取代并且位置B29的Lys被或未被Pro取代的人胰島素；AlaB26人胰島素；des (B28-B30)人胰島素；des(B27)人胰島素和des (B30)人胰島素。在另一個實施方案中，胰島素類似物是谷賴胰島素。在另一個實施方案中，胰島素類似物是甘精胰島素。
[0044]在另一個實施方案中，胰島素衍生物選自B29-N-肉豆蘧?；?des (B30)人膜島素、B29-N-掠桐酸基-des (B30)人膜島素、B29-N-肉?蓮酸基人膜島素、Β29-Ν-棕櫚酰基人胰島素、Β28-Ν-肉豆蘧?；鵏ysB28proB29人胰島素、B28-N-棕櫚?；?LysB28proB29人胰島素、B30-N-肉豆蘧?；鵢ThrB29LysB30人胰島素、B30-N-棕櫚?；?ThrB29LysB30人胰島素、B29-N—(N-棕櫚酰基-Y-谷氨?；?-des (B30)人胰島素、B29-N— (N-lithocholyl-Υ-谷氨?；?-des (B30)人胰島素、B29-N- (omega-羧基十七燒酰基)-des(B30)人胰島素和B29-N-(omega-羧基十七燒?；?人胰島素。
[0045]在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在pH7_lI。在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在pH8_10。在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸朽1康酸酐是在pH8.5-9.5。在另一個實施方案中,使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在PH9。在另一個實施方案中，接觸是指接觸至少2分鐘(min)。在另一個實施方案中，接觸是指接觸至少5分鐘(min)。在另一個實施方案中，接觸是指接觸至少10分鐘(min)。在另一個實施方案中,接觸是指接觸至少15分鐘(min)。在另一個實施方案中，接觸是指接觸至少20分鐘(min)。在另一個實施方案中，接觸是指接觸至少25分鐘(min)。在另一個實施方案中,接觸是指接觸至少30分鐘(min)。
[0046]在另一個實施方案中，檸康酸化(citraconylation)是在缺乏游離氨基的緩沖液(a buffer devoid of free amino group)中進行。在另一個實施方案中，朽1康酸化是在碳酸鹽緩沖液、磷酸緩沖液或硼酸緩沖液中進行。在另一個實施方案中，反應的pH維持在6-10。在另一個實施方案中，反應的pH維持在7-9.5。在另一個實施方案中，根據280nm處的吸光度，使用溶液中估計胰島素量的3倍過量的檸康酸酐。在另一個實施方案中，反應時間為在室溫下小于I小時。在另一個實施方案中，反應時間為在室溫下30-60分鐘。
[0047]在另一個實施方案中,胰蛋白酶是豬胰蛋白酶。在另一個實施方案中,胰蛋白酶是經TPCK處理。在另一個實施方案中，根據280nm處的吸光度，使用的胰蛋白酶與溶液中估計胰島素量的比例為1:6000-10000。在另一個實施方案中，根據280nm處的吸光度，使用的胰蛋白酶與溶液中估計胰島素量的比例為1:6000-9000。在另一個實施方案中，根據280nm處的吸光度，使用的胰蛋白酶與溶液中估計胰島素量的比例為1:7500。在另一個實施方案中，反應在室溫下進行12-20小時。在另一個實施方案中，反應在室溫(22±3° C)下進行14-18小時。在另一個實施方案中，反應在室溫下進行16小時。在另一個實施方案中，反應時間取決于酶濃度、溫度和pH。
[0048]在另一個實施方案中，折疊發(fā)生在pH9_13的范圍內。在另一個實施方案中，折疊發(fā)生在ρΗ10-12的范圍內。在另一個實施方案中，折疊發(fā)生在pHll-11.5的范圍內。
[0049]在另一個實施方案中，可用HCl或NaOH進行pH調節(jié)。在另一個實施方案中，在經羧妝酶B (CPB)去除B-鏈C-端的Lys-Arg殘基之后，獲得真實的人膜島素。
[0050]在另一個實施方案中，胰島素的結晶是在pH4_8的檸檬酸-乙醇中、在Zn++存在下進行。在另一個實施方案中，胰島素的結晶是在PH6-7的檸檬酸-乙醇中、在Zn++存在下進行。在另一個實施方案中，胰島素的結晶是在PH6.2-6.6的檸檬酸-乙醇中、在Zn++存在下進行。在另一個實施方案中，胰島素的結晶是在PH6.4的檸檬酸-乙醇中、在Zn++存在下進行。
[0051]在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在16-40° C下進行。在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在20-35° C下進行。在另一個實施方案中，使Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在19-25° C下進行。
[0052]在另一個實施方案中，使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在大約pH8時進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在大約PH6-10時進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在大約PH7.5-8.5時進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在大約pH9時進行。
[0053]在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在16-40° C下進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在20-35° C下進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在25-35° C下進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在30-40° C下進行。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在37° C下進行。
[0054]在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少30min。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少I小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少2小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少3小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少4小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少5小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少6小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少7小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少8小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少9小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少10小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少12小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少14小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少16小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少18小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少20小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少22小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應至少23小時。
[0055]在另一個實施方案中， 使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應1-40小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應5-30小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應10-30小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應15-25小時。在另一個實施方案中，使步驟(a)的Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應23小時。在另一個實施方案中，反應持續(xù)時間容易由本領域技術人員確定并且取決于溫度、PH和胰蛋白酶濃度等。在另一個實施方案中，反應持續(xù)時間、溫度和胰蛋白酶反應混合物的pH由本領域技術人員根據所用的具體胰蛋白酶(具體的動力學和規(guī)格型號)來確定。
[0056]在某些實施方案中，本文所用的“Lys-Arg前體胰島素”或“胰島素”包括天然蛋白(降解產物、合成蛋白或重組蛋白)和肽模擬物(通常是合成蛋白)、以及作為蛋白類似物的類肽(peptoid)和半類肽(semipeptoid),在某些實施方案中，修飾使所述蛋白在體內更穩(wěn)定或更能滲入細胞內。
[0057]在某些實施方案中，本發(fā)明的進一步修飾包括但不限于N-末端修飾、C-末端修飾、肽鍵修飾(包括但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2_S=0、O=C-NH, CH2-0、CH2-CH2、S=C-NH,CH=CH或CF=CH)、主鏈修飾和殘基修飾。制備肽模擬化合物的方法是本領域眾所周知的并描述于例如 Quantitative Drug Design, C.A.Ramsden Gd.,第 17.2 章，F.ChoplinPergamon Press (1992),其通過引用全部結合到本文中。這方面的更多細節(jié)在下文提供。
[0058]在某些實施方案中，所述肽內的肽鍵(-C0-NH-)被取代。在某些實施方案中，肽鍵被N-甲基化鍵(-N(CH3)-C0_)取代。在某些實施方案中，肽鍵被酯鍵(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被α-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基、carba鍵(-CH2-NH-)。在某些實施方案中，肽鍵被羥基乙叉鍵(_CH (OH)-CH2-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被硫代酰胺鍵(-CS-NH-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被烯屬雙鍵(-CH=CH-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被反向酰胺鍵(retro amide bond) (-NH-C0-)取代。在某些實施方案中，肽鍵被肽衍生物(_N(R)-CH2-C0-)取代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”側鏈。在某些實施方案中，這些修飾在肽鏈的任何鍵上發(fā)生并且甚至同時在幾個(2-3個)鍵上發(fā)生。
[0059]在某些實施方案中，肽的天然芳族氨基酸(例如Trp、Tyr和Phe)被取代為合成的非天然酸，例如例如苯基甘氨酸、TIC、naphthylelanine (Nol)、Phe的環(huán)-甲基化衍生物、Phe的鹵代衍生物或ο-甲基-Tyr。在某些實施方案中，本發(fā)明的肽包含一個或多個經修飾的氨基酸或一個或多個非氨基酸單體(例如脂肪酸、復雜碳水化合物等)。
[0060]在一個實施方案中，“氨基酸”是指包括20種天然發(fā)生的氨基酸；這些氨基酸通常在體內在翻譯后被修飾，包括例如，羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；和其它不常見氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素(isodesmosine)、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。在一個實施方案中，“氨基酸”同時包括D-氨基酸和L-氨基酸。
[0061 ] 在某些實施方案中，重組蛋白技術用于產生本發(fā)明的“Lys-Arg前體胰島素”。在某些實施方案中，重組蛋白技術用于產生相當長的肽(例如長度超過18-25個氨基酸)。在某些實施方案中，重組蛋白技術用于產生大量的本發(fā)明的“Lys-Arg前體胰島素”。在某些實施方案中，重組技術描述于 Bitter 等，(1987)Methods in Enzymol.153:516-544，Studier 等(1990)Methods in Enzymol.185:60-89，Brisson等(1984) Nature310:511-514，Takamatsu等(1987)EMBO J.6:307-311，Coruzzi 等(1984)EMBO J.3:1671-1680 和 Brogli 等(1984)Science224:838-843, Gurley 等(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565 和 Weissbach&Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY,第 VIII 部分，第421-463 頁。
[0062]在另一個實施方案中，用編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸合成本發(fā)明的“Lys-Arg前體胰島素”。在某些實施方案中，將編碼本發(fā)明的Lys-Arg前體胰島素的多核苷酸連接到表達載體上，所述載體包含順式調節(jié)序列(例如啟動子序列)的轉錄控制。在某些實施方案中，所述順式-調節(jié)序列適合于指導本發(fā)明Lys-Arg前體胰島素的組成型表達。在某些實施方案中，所述順式-調節(jié)序列適合于指導本發(fā)明Lys-Arg前體胰島素的特定表達。在某些實施方案中，所述順式調節(jié)序列適合于指導本發(fā)明Lys-Arg前體胰島素的誘導型表達。
[0063]在一個實施方案中，術語“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈的核酸序列，其可被分離出并以RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復合多核苷酸序列(composite polynucleotide sequence)(例如上述的組合)形式提供。
[0064]在一個實施方案中，“基因組多核苷酸序列”是指源自(分離自)染色體并因此代表染色體的毗鄰部分的序列。
[0065]在一個實施方案中，“復合多核苷酸序列”是指至少部分互補和至少部分是基因組的序列。在一個實施方案中，復合序列可包括編碼本發(fā)明的Lys-Arg前體胰島素所需的一些外顯子序列，以及分布在其間的一些內含子序列。在一個實施方案中，所述內含子序列可來自任何來源，包括來自其它基因，并且通常會包括保守剪接信號序列。在一個實施方案中，內含子序列包括順式作用表達調節(jié)元件。
[0066]在某些實施方案中，用PCR技術、或本領域技術人員已知的任何其它方法或程序來制備本發(fā)明的多核苷酸。在某些實施方案中，所述程序包括連接兩個不同DNA序列(參見例如，“Current Protocols in Molecular Biology”，Ausubel 等編著，Johnffiley&Sons, 1992)。
[0067]在一個實施方案中，將本發(fā)明的多核苷酸插入表達載體(即核酸構建體)，使重組蛋白能夠表達。在一個實施方案中，本發(fā)明的表達載體包括使該載體適合在原核生物中復制和整合的額外序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的表達載體包括使該載體適合在真核生物中復制和整合的額外序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的表達載體包括使該載體同樣適合在原核生物和真核生物中復制和整合的穿梭載體。在某些實施方案中，克隆載體包括轉錄和翻譯的起始序列(例如啟動子、增強子)以及轉錄和翻譯的終止序列。
[0068]在一個實施方案中，各種各樣的原核細胞或真核細胞可用作宿主表達系統，以表達本發(fā)明的Lys-Arg前體胰島素。在某些實施方案中，這些包括但不限于微生物和植物，例如已轉化含有Lys-Arg前體胰島素編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA的表達載體的細菌；已轉化含有Lys-Arg前體胰島素編碼序列的重組酵母表達載體的酵母菌；已感染含有Lys-Arg前體胰島素編碼序列的重組病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV)或已轉化含有Lys-Arg前體胰島素編碼序列的重組質粒表達載體(例如Ti質粒)的植物細胞系統。
[0069]在某些實施方案中，使用非細菌表達系統(例如哺乳動物表達系統，例如CHO細胞)，以表達本發(fā)明的Lys-Arg前體胰島素。在一個實施方案中，用于在哺乳動物細胞中表達本發(fā)明多核苷酸的表達載體是包含CMV啟動子和新霉素抗性基因的pC1-DHFR載體。
[0070]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供使用豬胰島素作為原料的半合成方法，并提供經遺傳修飾的微生物用于表達重組胰島素(或本發(fā)明的前體胰島素)的用途。 [0071]在某些實施方案中，使用細菌系統，例如大腸桿菌BL-21(EsCheriChia coliBL-21)。在一個實施方案中，希望是大量的蛋白。在一個實施方案中，希望指導高水平蛋白產物表達的載體，可與疏水性信號序列融合，所述信號序列指導所表達產物進入周質、或進入細菌包涵體或容易純化該蛋白產物的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，某種融合蛋白經工程改造而具有特異性切割位點，有助于該蛋白的回收。在一個實施方案中，適于這樣操作的載體包括但不限于大腸桿菌表達載體的pET系列[Studier等，Methods inEnzymol.185:60-89(1990)]。
[0072]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供重組DNA方法的用途，所述用途允許在微生物中制備胰島素前體或胰島素類似物、尤其是氨基酸序列和/或氨基酸鏈長不同于人胰島素的人胰島素原或胰島素原。在另一個實施方案中，自經遺傳修飾的大腸桿菌細胞制備而來的胰島素原(與本發(fā)明的前體胰島素是同義詞)沒有任何正確連接的胱氨酸橋。在另一個實施方案中，用大腸桿菌獲取胰島素的方法描述于EP0055945，其通過引用全部結合到本文中。
[0073]在一個實施方案中，使用酵母表達系統。在一個實施方案中，含有組成型啟動子或誘導型啟動子的多種載體可用于酵母菌，正如U.S.5，932，447所公開的那樣。在另一個實施方案中，使用能促進外源DNA序列整合到酵母染色體的載體。
[0074]在一個實施方案中，可使用多種方法將本發(fā)明的表達載體引入細胞內。這類方法一般性地描述于 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSprings Harbor Laboratory, New York (1989，1992)，in Ausubel 等,CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley 和 Sons, Baltimore, Md.(1989), Chang等,Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich.(1995), Vega 等,GeneTargeting, CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995), Vectors: A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和 Gilboa等[Biotechniques4 (6): 504-512，1986]并且包括例如穩(wěn)定或瞬時轉染、脂質轉染(Iipofection)、電穿孔和用重組病毒載體感染。另外，有關正_負選擇方法可參見美國專利號 5，464，764 和 5，487，992。
[0075]在某些實施方案中,在允許Lys-Arg前體胰島素大量表達的有效條件下培養(yǎng)經轉化的細胞培養(yǎng)。在某些實施方案中，有效培養(yǎng)條件包括但不限于允許蛋白產生的有效培養(yǎng)基、生物反應器、溫度、pH和氧條件。在一個實施方案中，有效培養(yǎng)基是指細胞經培養(yǎng)能產生本發(fā)明的Lys-Arg前體胰島素的任何培養(yǎng)基。在某些實施方案中，培養(yǎng)基通常包括具有可同化的碳源、氮源和磷源、以及合適的鹽類、礦物質、金屬和其它營養(yǎng)物例如維生素的水溶液。在某些實施方案中，可在常規(guī)發(fā)酵生物反應器、搖瓶、試管、微量滴定板和培養(yǎng)皿上培養(yǎng)本發(fā)明的細胞。在某些實施方案中，培養(yǎng)是在合適于重組細胞/細菌的溫度、PH和氧含量下進行。在某些實施方案中，培養(yǎng)條件是在本領域普通技術人員的專業(yè)范圍之內。
[0076]在一個實施方案中,在預定培養(yǎng)時間之后,進行Lys-Arg前體胰島素的回收。
[0077]在一個實施方案中，本文所用的術語“回收Lys-Arg前體胰島素”是指收集含有Lys-Arg前體胰島素的全部發(fā)酵培養(yǎng)基，而不一定是指額外的分離或純化步驟。
[0078]在一個實施方案中，純化方法用于純化Lys-Arg前體胰島素或本發(fā)明的胰島素。純化方法包括各種各樣的標準蛋白純化技術，例如但不限于親和色譜法、離子交換色譜法、過濾、電泳、疏水性相互作用色譜法、凝膠過濾色譜法、反相色譜法、伴刀豆球蛋白A色譜法、色譜聚焦和分級溶解。
[0079]在一個實施方案中，Lys-Arg前體胰島素或本發(fā)明的胰島素以“基本純化的”形式回收。
[0080]在一個實施方案中，術語“基本純化的”是指允許所述蛋白有效用于本文所述的應用例如治療糖尿病中的純度。
[0081]在某些實施方案中，合成并純化Lys-Arg前體胰島素；可在體內或體外測定其治療性功效。
[0082]在某些實施方案中，本發(fā)明的胰島素可配制在經口或口服組合物中，并且在某些實施方案中，包括液體溶液劑、乳劑、混懸劑等。在某些實施方案中，適用于配制所述組合物的藥學上可接受的載體是本領域眾所周知的。在某些實施方案中，液體口服組合物包含大約0.001%至大約0.9%胰島素，或在另一個實施方案中，大約0.01%至大約10%。 [0083]在某些實施方案中，用于本發(fā)明方法的組合物包括溶液劑或乳劑，在某些實施方案中，所述溶液劑或乳劑是水性溶液劑或乳劑，其包含安全而有效量的胰島素和任選的其它化合物，供鼻內局部給藥用。
[0084]在一個實施方案中,將本發(fā)明的注射劑配制在水性溶液劑中。在一個實施方案中，將本發(fā)明的注射劑配制在生理相容的緩沖液例如漢克斯溶液(Hank’s solution)、林格液(Ringer’s solution)或生理鹽水緩沖液中。在某些實施方案中，對于經黏膜給藥而言,適于穿過屏障的滲透劑用于配制。這類滲透劑是本領域公知的。
[0085]在一個實施方案中，配制本文所述的制劑,供胃腸外給藥用,例如通過推注(bolusinjection)或連續(xù)輸注。在某些實施方案中，注射用制劑呈單位劑型的形式，例如在安瓿或多劑量容器中，并任選添加防腐劑。在某些實施方案中，組合物是在油性或水性媒介物中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并含有配制用試劑(formulatory agent),例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
[0086]在某些實施方案中，所述組合物也包含:防腐劑，例如苯酚、間甲酚、間拉唑(metaprazol)、苯扎氯銨和硫柳萊等；螯合劑，例如乙二胺四乙酸鈉等；緩沖劑，例如磷酸(鹽)、檸檬酸(鹽)和乙酸(鹽);張度劑(tonicity agent),例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇等；抗氧化劑，例如抗壞血酸、乙酰胱氨酸、偏亞硫酸氫鈉(sodium metabisulfote)等；芳香劑；粘度調節(jié)劑，例如聚合物，包括纖維素及其衍生物；和聚乙烯醇以及調節(jié)這些水性組合物的PH的酸和堿(如果需要的話)。在某些實施方案中，所述組合物也包含局部麻醉劑或其它活性劑。所述組合物可以噴劑、霧化劑、滴劑等形式使用。
[0087]在查看以下實施例之后，本發(fā)明的額外目的、優(yōu)勢和新特征將是本領域普通技術人員顯而易見的，所述實施例并非限制性的。另外，以上所述的和權利要求書部分要求保護的本發(fā)明的不同實施方案和方面各自可在以下實施例中找到實驗支持。
[0088]實施例
[0089]通常，本文所用的命名法和本發(fā)明所用的實驗室操作包括分子技術、生化技術、微生物技術和重組DNA技術。這些技術在文獻中有充分的解釋。參見例如，〃MolecularCloning:A laborator y Manual〃Sambrook等，(1989) ；^Current Protocols in MolecularBiology"第 1-1II 卷，Ausubel, R.M.編著(1994) ;Ausubel 等，"Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland(1989) ;Perbal,〃APractical Guide to Molecular Cloning", John ffiley&Sons, New York(1988) ；ffatson等，"Recombinant DNA^,Scientific American Books, New York ；Birren 等(編著)"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series",第 1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press, New York (1998);美國專利號 4，666，828 ；4, 683，202 ；4, 801，531 ；5, 192, 659 和 5, 272, 057 中給出的方法;"Cell Biology:A Laboratory Handbook",第1-1II 卷，Cellis, J.E.編著(1994) ;"Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique^by Freshney, ffiley-Liss, N.Y (1994),第 3 版；〃Current Protocols inImmunology"第 1-1II 卷，Coligan J.E.,編著(1994) ；Stites 等(編著)，"Basicand Clinical Immunology"(第 8 版),Appleton&Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell和 Shiigi (編著)，"Selected Methods in Cellular Immunology^, ff.H.Freeman andC0., New York(1980);可用的免疫測定深入描述于以下專利和科技文獻:參見例如，美國專利號 3，791，932 ;3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ;3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ;4，098，876 ；4，879，219 ;5，011，771 和 5，281，521 !"Oligonucleotide Synthesis^Gait, M.J.編著(1984) ;“Nucleic Acid Hybridization"Hames, B.D.，和 Higgins S.J.編著(1985)；"Transcription and Tran si at ion ^Hames, B.D.,和 Higgins S.J.,編著.(1984) ;〃AnimalCell Culture〃Freshney, R.1.編著(1986) ,Immobilized Cells and Enzymes^IRLPress, (1986) ;"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.， (1984)和"Methods in Enzymology^ 第 1-317 卷,Academic Press ;〃PCR Protocols:A GuideTo Methods And Applications^, Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak等,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual〃CSHL Press (1996);所有這些都通過引用結合到本文中。其它通用性文獻在本文的全文中提供。
[0090]實施例1
[0091 ] 有效產生胰島素的方法
[0092]表達克隆
[0093]通過GeneOptimizer?軟件，優(yōu)化編碼胰島素前體蛋白的核苷酸序列，以改善在
大腸桿菌中的表達。再從合成的寡核苷酸中裝配合成基因并克隆到pET24a(Novagen),使用NdeI和BlpI限制酶位點。用上述克隆轉染大腸桿菌BL21菌株(DE3)細胞。所述基因在T7啟動子和Iac操縱子的控制之下轉錄。轉錄終止是由T7終止子控制，翻譯起始是由PET24核糖體結合位點起始。由IPTG誘導用作胰島素前體的12.7kD融合蛋白的表達，導致產生非常高水平的胰島素前體。該前體含有Cu/Zn SOD部分作為氨基端部分并通過Arg殘基與胰島素原樣部分 融合，其中Lys-Arg連接胰島素的B鏈和A鏈。所述胰島素前體的表達盒-核苷酸序列和相應氨基酸序列-見圖4。
[0094]生長條件和胰島素前體的積累
[0095]在補充有酵母浸膏、葡萄糖、氨和氧的基本鹽培養(yǎng)基中，在37° C進行發(fā)酵，直到細胞濃度達到0D66(T50。為了誘導，添加IPTG并嚴格維持和控制低葡萄糖水平達6小時以上，直到達到培養(yǎng)物密度達到0D66(Tl20。非常高水平的胰島素前體積累為胞內包涵體(IB)。用微孔中空纖維柱，經超濾收獲細胞并用鹽水洗滌。
[0096]回收
[0097]在850巴，經高剪切混合和高壓勻漿破碎細菌細胞之后，回收IB。經連續(xù)離心收集IB并將沉淀物在碳酸鹽緩沖液中洗滌2次。
[0098]溶解和折疊
[0099]將IB懸浮于NaHCO3緩沖液中并通過短時暴露給pH12而溶解。再將所述溶液調節(jié)至pHll.2，離心澄清，然后再在23°C溫育，總共6小時，從堿處理開始計。應當指出，pH是最佳折疊的重要參數，在pH值為11.0-11.5時折疊最好。在折疊周期結束時，用HCl將pH降低至9。
[0100]經檸康酸酐修飾和胰蛋白酶切割
[0101]通過在pH9(通過自動滴定而保持該pH值)與過量朽1康酸酐反應,所述前體蛋白中的所有賴氨酸殘基都被可逆地封閉。剩余試劑被水解為檸康酸或通過加入5mM乙醇胺而猝滅。所述胰島素前體的?；苌铽@得-8的額外負電荷，這可在尿素-PAGE上容易地分析出。所述蛋白再用稀釋的胰蛋白酶在23° C處理16小時，得到檸康酸化(citraconylated)胰島素-LysArg。在反應周期結束時,將pH調節(jié)至8.5并將所述溶液進行微濾。
[0102]純化
[0103]流程包括在DEAE瓊脂糖柱上、在乙醇胺(pH8.5)中進行色譜。將在30%異丙醇中的洗脫合并液酸化至pH2.8并在23° C溫育16小時，以完全除去檸康酸殘基。所得溶液經微濾澄清并在SP瓊脂糖柱上、在檸檬酸緩沖液(pH3.0)中進行色譜。
[0104]可通過用羧肽酶B (CPB)處理，將經純化/富集的胰島素-LysArg轉化為胰島素并使胰島素結晶，再通過過濾而收集胰島素。最終，胰島素經制備型反相HPLC純化并重結晶。胰島素晶體經過濾收集，洗滌和真空干燥，并將松散材料(bulk material)凍存于-20° C。如果省略CPB處理的話，通過相同步驟獲得胰島素-LysArg。圖3顯示高度純化的胰島素-LysArg制劑的HPLC色譜圖。
[0105]實施例2
[0106]有效產生的胰島素在大鼠體內具有活性
[0107]為了評價實施例1中產生的長效胰島素類似物的潛在治療效果，在鏈脲佐菌素(STZ)-誘導的糖尿病大鼠中通過在給藥之后的不同時間點測定它們的血糖水平，測試胰島素-LysArg和來得時(Junod等，1969)。大約9周齡的年輕Sprague-Dawley雄性大鼠接受單次腹膜內注射60mg STZ/千克體重。誘導糖尿病后5天，大部分動物表現出血糖值高于300mg/dLo這些動物在連續(xù)3天經皮下注射而接受相當于6IU/kg的試驗材料。該研究由3個實驗組組成，每組6只動物，用以上指定的2種不同胰島素治療并用媒介物作為對照。在治療之前和每次給藥日之后的1、4、8和24小時測定血糖。如圖5所示，兩種試驗材料在體內都具有相當的活性特征。
[0108]實施例3
[0109]有效產生的胰島素在狗體內具有長效胰島素的活性 [0110]在四氧嘧啶-誘導的糖尿病比格犬中測試了不同胰島素制劑降低血糖水平的效果。年齡2 - 5歲、體重10-17千克的8只健康的經閹割的雌性狗，經靜脈內注射50mg/kg體重的四氧嘧啶。治療之后3天，所有狗只都出現可重復的實驗性糖尿病狀態(tài)，表現出高血糖癥和其它特征性癥狀(Watanabe等，The pathological features of alloxan diabetesin beagle dogs, J Toxicol Pathol, 2004, 17, 187-195)。
[0111]將如上所述制備的胰島素-LysArg( “胰島素KR”)與兩種市售胰島素制劑即優(yōu)泌林R(Elli Lily)和來得時(Sanof1-Aventis)進行比較。在8只糖尿病比格犬中，通過隨機交叉研究，測試這三種制劑和媒介物對照。
[0112]給予不同胰島素制劑、以及對照，每天I次，連續(xù)2天。在頸背面經皮下推注媒介物對照和0.4IU/kg體重/天的胰島素制劑。全天采集全血樣品，進行快速葡萄糖檢測(Glucotrend2, Roche)并在每次采樣之后2分鐘內進行葡萄糖測定和記錄。
[0113]結果見圖7，表明與速效可溶性胰島素(優(yōu)泌林R)不同，來得時和胰島素-LysArg在糖尿病比格犬體內都具有相似的長效活性特征。
【權利要求】
1.一種制備胰島素的方法，所述方法包括以下步驟: (a)可逆地封閉包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的Lys-Arg前體胰島素中的賴氨酸殘基，包括使所述Lys-Arg前體胰島素接觸包含緩沖液和檸康酸酐的pH6_10的溶液；和 (b)切割所述Lys-Arg前體胰島素,包括使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應， 從而制備胰島素。
2.權利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在pH9時進行。
3.權利要求1所述的方法，其中所述使所述Lys-Arg前體胰島素接觸檸康酸酐是在室溫下進行大約I小時。
4.權利要求1所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在pH值為6.0-11.5時進行。
5.權利要求1所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應是在室溫下進行。
6.權利要求5所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應進行至少5小時。
7.權利要求5所述的方法，其中所述使步驟(a)的所述Lys-Arg前體胰島素與胰蛋白酶反應進行23小時。
8.權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)之前將所述Lys-Arg前體胰島素暴露在10.0-11.5 的 pH 值下。
9.權利要求1所述的方法，所述方法還包括步驟(C)，即，將步驟(b)的所述胰島素的pH調節(jié)至ρΗ8.5。
10.權利要求1所述的方法，所述方法還包括從步驟(b)的所述胰島素的B-鏈的C-端除去Arg殘基和Lys殘基，包括使步驟(b)的所述胰島素與羧肽酶B (CPB)反應。
11.權利要求9所述的方法，所述方法還包括純化所述胰島素(步驟(d))。
12.權利要求11所述的方法，其中通過微濾進行所述純化。
13.權利要求11所述的方法，其中通過離子交換色譜法、反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)或這兩者進行所述純化。
14.權利要求11所述的方法，所述方法還包括使所述胰島素結晶，包括在檸檬酸-乙醇中使步驟(d)的所述胰島素接觸Zn++。
15.權利要求1所述的方法，其中所述胰島素是長效胰島素。
16.權利要求1所述的方法，其中將至少50%的所述Lys-Arg前體胰島素轉化為所述胰島素。
17.權利要求1所述的方法，其中所述前體胰島素得自細菌包涵體。
18.權利要求1所述的方法，其中所述溶液不含胺。
19.權利要求1所述的方法，其中所述緩沖液是碳酸鹽緩沖液。
20.權利要求1所述的方法，其中包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述Lys-Arg前體胰島素是由SEQ ID NO: 3的氨基酸序列組成的Lys-Arg前體胰島素。
【文檔編號】C12P21/06GK103981243SQ201310049462
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年2月7日 優(yōu)先權日:2013年2月7日
【發(fā)明者】雅各布·哈特曼, 江立新 申請人:華凌科技有限公司