專利名稱：表征微生物中抗生素抗性的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌診斷學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種表征微生物的抗生素抗性的方法、實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒以及用于表征微生物的抗生素抗性的系統(tǒng)，其包括用于實(shí)施本發(fā)明的方法的質(zhì)譜分析裝置以及樣品制備材料。
背景技術(shù)：
抗生素抗性是微生物抵御抗生素作用的能力。這種抗性通過(guò)基因突變和微生物間的質(zhì)粒交換而發(fā)生?？股乜剐砸褜?duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生主要影響，而這種影響在未來(lái)數(shù)年只會(huì)增長(zhǎng)。因表現(xiàn)出抗生素抗性而重新獲得興趣的一組機(jī)會(huì)微生物是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。這些菌種(包括，例如，克雷伯菌(Klebsiella spp)和大腸桿菌(Escherichia coli))包括機(jī)會(huì)病原體,這些機(jī)會(huì)病原體已與尿路感染、敗血癥、呼吸道感染以及腹瀉尤其相關(guān)。早在三十年前，人們便了解這些菌種對(duì)第三代頭孢菌素(例如氧亞氨基β_內(nèi)酰胺)具有抗性，但是從那時(shí)才開(kāi)始記錄抗性的指數(shù)增長(zhǎng)。菌株通過(guò)生成分子A類β-內(nèi)酰胺酶的稱為超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBL)獲得其抗性，所述酶能夠滅活第三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢泊肟)和單環(huán)內(nèi)酰胺(氨曲南)。ESBL是常見(jiàn)β-內(nèi)酰胺酶(例如TEM和SHVi1-內(nèi)酰胺酶)的衍生物，這種衍生物在酶的活性部位附近進(jìn)行一次或多次氨基酸置換，從而增加其對(duì)第三代頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺的親和力以及水解活性。新一代頭孢菌素的廣泛使用促使進(jìn)化出了更多種類的ESBL。ESBL由可轉(zhuǎn)移的接合質(zhì)粒編碼，這些接合質(zhì)粒負(fù)責(zé)將抗性傳播給其他的革蘭氏陰性菌。根據(jù)其物理特性，ESBL被區(qū)分為450多種，克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦對(duì)ESBL有不同程度的抑制，這一特性可用于在實(shí)驗(yàn)室中檢測(cè)ESBL。目前，在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中僅采用表型ESBL檢測(cè)試驗(yàn)。分子(基因型)試`驗(yàn)正處于開(kāi)發(fā)階段。然而，分子試驗(yàn)存在的問(wèn)題在于基因型和表型之間缺少100%的相關(guān)性。因此，包括ESBL生成細(xì)菌在內(nèi)的任何細(xì)菌表型的分子試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值均受到限制。一般情況下，目前的實(shí)驗(yàn)室表型試驗(yàn)較之ESBL基因型確證試驗(yàn)更具有靈敏性和針對(duì)性。所有的表型ESBL檢測(cè)試驗(yàn)依據(jù)同樣的原理:試驗(yàn)評(píng)估在β -內(nèi)酰胺類抗生素存在時(shí)或β_內(nèi)酰胺類抗生素與β_內(nèi)酰胺酶抑制劑組合存在時(shí)，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用的變化情況。還有一些從商業(yè)渠道獲得的各種人工試驗(yàn)和自動(dòng)化平臺(tái)，可用于實(shí)施這些表型試驗(yàn)。人工試驗(yàn)采用浸有β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合的圓盤或試片。浸透的材料放置在固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基事先接種了已知密度的細(xì)菌懸浮液。之后進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)觀察確定生長(zhǎng)抑制的情況，并根據(jù)抑菌圈的直徑對(duì)生長(zhǎng)抑制的情況進(jìn)行定量分析。自動(dòng)化系統(tǒng)建立在細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)量的基礎(chǔ)之上，測(cè)量細(xì)菌在不同濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素存在時(shí)或β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合存在時(shí)的細(xì)菌生長(zhǎng)情況。在4到18小時(shí)之后，獲得此類系統(tǒng)的結(jié)果。目前，需要能夠更為迅速地診斷ESBL生成細(xì)菌的設(shè)備和方法。同時(shí)，也需要可以用于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的ESBL檢測(cè)試驗(yàn)以便在酶動(dòng)力學(xué)方面表征ESBL，從而可以跟蹤進(jìn)化趨勢(shì)，并評(píng)估和預(yù)測(cè)抗生素治療中的有效劑量。一般來(lái)說(shuō)，這些設(shè)備廣泛地應(yīng)用于表征微生物的抗生素抗性。發(fā)明概述本發(fā)明現(xiàn)提供用于快速診斷產(chǎn)生抗生素修飾酶的微生物、尤其是(在優(yōu)選實(shí)施方式中)生成ESBL的微生物的設(shè)備和方法。本發(fā)明還提供了可表征抗生素修飾酶本身的設(shè)備和方法。此類表征可提早檢測(cè)出新型抗性。第一方面，本發(fā)明提供了一種用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供抗微生物化合物或其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或者其修飾酶底物化合物的參考質(zhì)譜；b)使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露的樣品；c)獲取被暴露 樣品的質(zhì)譜；d)比較在c)步驟中獲取的質(zhì)譜和在a)步驟中的參考質(zhì)譜，以及e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現(xiàn)所述抗微生物化合物、其修飾產(chǎn)物或所述底物的修飾，或者其分子靶標(biāo)是否過(guò)量生成，并確立在觀察到所述修飾時(shí)所述微生物對(duì)所述抗微生物化合物潛在地存在抗性。在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾包括所述抗微生物化合物的酶鈍化或酶降解和/或其分子靶標(biāo)的甲基化或過(guò)量生成。更優(yōu)選地，酶降解是由內(nèi)酰胺酶的降解導(dǎo)致。在這種情況下，抗微生物化合物可以是β-內(nèi)酰胺類抗生素或任何其他β-內(nèi)酰胺酶底物。因此，在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾抗微生物化合物的酶的底物化合物可以替代抗微生物化合物。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，抗微生物化合物是β_內(nèi)酰胺類抗生素，優(yōu)選地選自青霉素、頭孢菌素、頭霉素類和碳青霉烯類，更優(yōu)選地選自頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢泊廂和氨曲南。清楚的是，根據(jù)抗生素抗性的機(jī)制，可能也會(huì)過(guò)量生成抗微生物化合物的分子靶標(biāo)(例如葉酸)，這會(huì)導(dǎo)致對(duì)葉酸拮抗劑產(chǎn)生抗性?？梢酝ㄟ^(guò)使用內(nèi)標(biāo)物并觀察目標(biāo)物/內(nèi)標(biāo)物的比例增大來(lái)檢測(cè)過(guò)量生成靶標(biāo)。核酸(例如DNA)可以作為適用的內(nèi)標(biāo)物。此外，再次根據(jù)抗生素抗性的機(jī)制，也可以檢測(cè)出抗微生物化合物的分子靶標(biāo)(例如，如核酸)甲基化。在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)將所述微生物同時(shí)暴露于多種抗微生物化合物中來(lái)實(shí)施本方法，從而表征所述微生物對(duì)多種抗生素化合物的抗性。在本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗微生物化合物的酶鈍化或酶降解是由內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)酰胺酶可以選自頭孢菌素酶(包括超廣譜頭孢菌素酶)、青霉素酶、羧芐西林酶、氯唑西林酶和碳青霉烯酶。在本發(fā)明方法的另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，β -內(nèi)酰胺酶是超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)。在所述方法的另一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，微生物是可能會(huì)生成ESBL的微生物，優(yōu)選是選自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)的革蘭氏陰性菌。本發(fā)明的各方面中使用的樣品包括微生物或其裂解產(chǎn)物。微生物樣品可以是微生物培養(yǎng)物樣品。此類培養(yǎng)物不必為純培養(yǎng)物?；蛘撸囵B(yǎng)基的部分或直接臨床材料也可以作為樣品來(lái)源。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法也是用于表征微生物的抗微生物修飾酶的方法的一部分，優(yōu)選地所述抗微生物修飾酶最好是超廣譜β_內(nèi)酰胺酶(ESBL)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法是用于表征超廣譜β_內(nèi)酰胺酶(ESBL)的方法的一部分。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的用于表征所述酶的方法包括確定在存在或不存在特定酶抑制劑的情況下，所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修飾(優(yōu)選降解)速率和/或所述化合物或底物的酶修飾產(chǎn)物的生成速率，或者所述化合物分子祀標(biāo)的過(guò)量生成速率，從而確定所述酶的米-曼(Km)常數(shù)和最大反應(yīng)速率。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用MALDI三重四極質(zhì)譜分析獲取質(zhì)譜。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，被暴露樣品是被暴露的所述微生物的粗細(xì)胞裂解物。在所述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法還包括定量分析所述微生物的步驟。優(yōu)選地，通過(guò)定量分析所述樣品中的從微生物衍生的一種或多種結(jié)構(gòu)生物分子或代謝物來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行定量分析。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)生物分子或代謝物選自核酸，優(yōu)選(基因組)DNA。DNA作為單分子存在于細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)使用例如PCR和/或DNA探測(cè)介導(dǎo)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量分析。另一方 面，本發(fā)明提供用于表征微生物的內(nèi)酰胺類抗生素抗性的試劑盒，其包含:a)用于裂解微生物的裂解緩沖液；b)至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物，以及c) MALDI 基質(zhì)，優(yōu)選地所述試劑盒進(jìn)一步包含:d)攜帶至少一種抗微生物化合物或底物的載體，其中所述載體任選地是一次性質(zhì)譜分析樣品載板的形式。另一方面，本發(fā)明提供了適用于通過(guò)上述本發(fā)明的方法表征微生物的β_內(nèi)酰胺類抗生素抗性的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含以下一種或多種組成部分:-至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物；-容器，用于使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于所述水成液中的至少一種抗微生物化合物中，優(yōu)選地所述至少一種底物化合物在所述容器中提供；-用于裂解所述微生物種的裂解緩沖液；-MALDI 基質(zhì)；-質(zhì)譜分析裝置；-抗微生物化合物、其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或者其修飾酶底物化合物的參考質(zhì)譜，以及-質(zhì)譜分析樣品載板，
任選地進(jìn)一步包含-用于液體處理的自動(dòng)移液器；-包含計(jì)算機(jī)程序代碼工具的計(jì)算機(jī)程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，實(shí)施如上所述的本發(fā)明方法的所有步驟，程序包括例如結(jié)果轉(zhuǎn)譯算法、界面軟件和/或?qū)＜蚁到y(tǒng)軟件。本發(fā)明在另一方面提供了包含計(jì)算機(jī)程序代碼工具的計(jì)算機(jī)程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，實(shí)施如上所述的本發(fā)明方法的所有步驟。在另一方面，本發(fā)明提供了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，它包含存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)程序代碼工具，當(dāng)所述程序產(chǎn)品在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，實(shí)施所述的本發(fā)明方法。發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“抗生素”和“抗微生物化合物”在本文可互換使用，在本文用于描述降低微生物生存能力或抑制微生物生長(zhǎng)或繁殖的化合物或組合物。“抑制生長(zhǎng)或繁殖”意味著世代周期時(shí)間增加至少2倍、優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少100倍、且最優(yōu)選無(wú)限地，也就是全部細(xì)胞均死亡。正如本公開(kāi)中所使用的，抗生素還意于包括抗菌劑、抑菌劑或殺菌劑。本發(fā)明中可用的抗生素的非限制性實(shí)例包括青霉素、頭孢菌素、氨基糖苷類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、林可酰胺類、喹諾酮類、氯霉素、糖肽類、甲硝唑、利福平、異煙肼、壯觀霉素、葉酸抑制劑、磺胺甲惡唑等等。術(shù)語(yǔ)“ β -內(nèi)酰胺類抗生素”用于指具有包括β -內(nèi)酰胺類功效在內(nèi)的抗生素特性的化合物。β -內(nèi)酰胺環(huán)(β -內(nèi)酰胺類)是含有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)酰胺，由三個(gè)碳原子和一個(gè)氮原子組成。本發(fā)明中涉及的有效β_內(nèi)酰胺類抗生素的非限制性實(shí)例包括青霉素、頭孢菌素、頭霉素類、青霉烯類、碳青霉烯類和單環(huán)內(nèi)酰胺。β -內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)多種細(xì)菌感染均有效(不存在抗藥性的情況下)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)內(nèi)酰胺類抗生素”是指包括任何經(jīng)抗生素抗性微生物滅活而發(fā)生質(zhì)量或結(jié)構(gòu)變化的抗生素，如果所述的質(zhì)量或結(jié)構(gòu)變化可通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“第三代頭孢菌素”是指這樣一類化合物，包括但不限于頭孢克肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢卡品、頭孢達(dá)肟、頭孢地尼、頭孢妥侖、頭孢他美、頭孢甲肟、頭孢地嗪、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢咪唑、頭孢匹胺、頭孢泊肟、頭孢磺啶、頭孢特侖、頭孢布烯、頭孢噻林、頭孢唑肟和氧頭孢烯類。
術(shù)語(yǔ)“ β -內(nèi)酰胺酶”是指由微生物(優(yōu)選細(xì)菌)生成的酶(EC3.5.2.6)，這種酶能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β_內(nèi)酰胺環(huán)。根據(jù)所謂的Ambler分類法，這一類酶通常被分為4大類(A、B、C和D類)，這種分類法主要依據(jù)蛋白質(zhì)同源性。β-內(nèi)酰胺酶的示例包括頭孢菌素酶、青霉素酶、卡羧芐西林酶、氯唑西林酶、碳青霉烯酶和頭孢他啶酶。這表示該術(shù)語(yǔ)包括“普通的”β -內(nèi)酰胺酶、超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)和AmpCP -內(nèi)酰胺酶。根據(jù)Ambler分類法，本發(fā)明中優(yōu)選的內(nèi)酰胺酶為A和D類的β-內(nèi)酰胺酶，或者根據(jù)Bush分類，屬于 2 類的 β -內(nèi)酸胺酶(Bush 等人 1995.Antimicrob Agents Chemother.39:1211-33)。Ambler分類法中A類抗生素為典型的活性部位絲氨酸β -內(nèi)酰胺酶，而Ambler分類法中D類抗生素是一組特定的絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，和A類的β-內(nèi)酰胺酶幾乎沒(méi)有序列相似性，D類抗生素俗稱為OXA (苯唑西林酶)類。還優(yōu)選是金屬碳青霉烯酶。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“超廣譜β_內(nèi)酰胺酶”(縮寫ESBL)最初被稱為“擴(kuò)展廣譜β-內(nèi)酰胺酶”，首次發(fā)明用于TEM和SHV酶的衍生物，這兩種酶能夠水解氧亞氨基頭孢菌素。這些均屬于β_內(nèi)酰胺酶官能團(tuán)2be。此后，該術(shù)語(yǔ)的含義得到了擴(kuò)展，包括:(1)與TEM和SHV突變體的譜相似、但是從其他來(lái)源衍生的酶，例如CTX-M和VEB類型；(2)具有臨界ESBL活性的TEM和SHV突變體，例如TEM-12 ；以及(3)多種比其親本型提供更寬的抗性、但不符合官能團(tuán)2be定義的β -內(nèi)酰胺酶，例如對(duì)頭孢吡肟具有增強(qiáng)活性的OXA衍生物和突變體AMpC類型。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗性的”和“抗性”是指微生物暴露在通過(guò)正常人體治療劑量方案能夠達(dá)到的抗微生物劑的濃度下，微生物的生存能力沒(méi)有降低并且生長(zhǎng)或繁殖也未得到抑制的現(xiàn)象。這意味著無(wú)法使用這種抗微生物劑成功治療由這種微生物引起的感染。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“微生物”尤其指病原微生物，例如細(xì)菌、酵母、真菌和細(xì)胞內(nèi)外的寄生蟲。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，該術(shù)語(yǔ)指病原細(xì)菌或機(jī)會(huì)細(xì)菌。這些包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌可能是以下屬中的細(xì)菌:假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根氏菌屬(Morganella)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、布拉漢菌屬(Branhame I la)、奈瑟氏菌屬(Neisse ria)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、朽1檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛(ài)德華菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、巴斯德菌屬(PasteureI la)、普羅威登斯菌屬(Provideneia)、放線桿菌屬(Actinobaci I Ius )、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、包特氏菌屬(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、黃單抱菌屬(Xanthomonas)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)。革蘭氏陽(yáng)性菌可能是以下屬中的細(xì)菌:腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿`菌屬(Bacillus)、李斯特菌屬(Listeria)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、加德納菌屬(Gardnerella)、考克氏菌屬(Kocuria)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Micrococcus)、微球菌屬(Leuconostoc)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)和棒狀桿菌屬(Corynebacteria)。酵母和真菌可能是以下屬中的酵母:念珠菌屬(Candida)、隱球菌屬(Cryptococcus)、酵母屬(Saccharomyces)和絲抱酵母屬(Trichosporon)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)譜”是指一種圖譜，以分子質(zhì)量或其函數(shù)(例如質(zhì)荷比(m/ζ)、離子質(zhì)量等)作為自變量。因變量通常為定量測(cè)量，例如豐度、相對(duì)豐度、強(qiáng)度、濃度、離子數(shù)量、分子數(shù)量、原子數(shù)量、計(jì)數(shù)/毫伏、計(jì)數(shù)等等。例如，在離子環(huán)境內(nèi)，質(zhì)譜通常以質(zhì)荷比(m/z)作為自變量，其中m是離子質(zhì)量，ζ是離子電荷，而因變量最常見(jiàn)的是各分子離子和/或其碎片離子的豐度。術(shù)語(yǔ)“離子”是指通過(guò)得到或失去一個(gè)或多個(gè)電子或質(zhì)子而獲得凈電荷的一個(gè)原子或原子團(tuán)。可以多種方式形成離子，其中包括在電流、紫外線和某些其他射線和/或高溫作用下分解氣體分子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“參考質(zhì)譜”是指用于比較分析的對(duì)照質(zhì)譜。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“修飾酶的底物化合物”是指任何可被抗生素修飾酶水解的化合物(無(wú)論是否為抗生素)。所述底物的酶修飾會(huì)使產(chǎn)生與原始底物化合物具有不同質(zhì)荷比(或質(zhì)譜)的反應(yīng)產(chǎn)物。如果酶轉(zhuǎn)化是酶降解，那么本文中使用的“反應(yīng)產(chǎn)物”是指“降解產(chǎn)物”。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“修飾酶”泛指抗微生物化合物修飾酶，例如β -內(nèi)酰胺酶。本文中使用的“修飾”是指抗微生物化合物的化學(xué)或物理變化(優(yōu)選是化學(xué)變化)，這種變化會(huì)滅活化合物的抗微生物活性。修飾可包括降解，降解是指化合物分子的化學(xué)基團(tuán)缺失，導(dǎo)致分子質(zhì)量降低，有時(shí)還會(huì)伴隨質(zhì)荷比的變化?；蛘撸揎検侵富衔锓肿拥幕瘜W(xué)基團(tuán)被置換或添加，從而滅活化合物的抗微生物活性，這種修飾模式會(huì)改變分子的質(zhì)量，有時(shí)還會(huì)伴隨質(zhì)荷比的變化。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞裂解物”是指通過(guò)破碎或裂解細(xì)胞而得到的細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞碎片。粗細(xì)胞裂解物包含所有的蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、脂質(zhì)和核酸。本發(fā)明中的細(xì)胞裂解物可以包括全細(xì)胞，但是基本上由裂解步驟之后獲取的細(xì)胞成分或任何碎片或其混合物組成。然而，細(xì)胞裂解物溶液可以包括但不限于是裂解細(xì)胞溶液，可將這種溶液處理為清除或滅活了所選分子的溶液。這樣，與最純化的細(xì)胞成分相比，該溶液依然基本上是“原液”。例如，細(xì)胞裂解 物可以是一種經(jīng)制劑處理過(guò)的裂解細(xì)胞溶液，這種制劑可以滅活或清除聚合酶抑制劑。此外，細(xì)胞裂解物還可以是一種經(jīng)抗凝劑處理過(guò)的裂解細(xì)胞溶液。任何方法均可用于裂解細(xì)胞樣品中的細(xì)胞。例如，滲透休克法、超聲裂解法、加熱法、物理破碎法、微波處理和酶和/或堿裂解法均為可用于裂解細(xì)胞的方法。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)培養(yǎng)基”是指包含微生物基因表達(dá)和/或微生物種生長(zhǎng)所需的所有元素的培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以含有一種或多種元素，例如氨基酸、胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、活性分子例如抗生素、酶、表面活性劑、緩沖液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽、一種或多種可以檢測(cè)酶的活性的底物等等。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“上清液”是指通過(guò)離心、過(guò)濾、沉淀或其他技術(shù)中的已知方法清除液體培養(yǎng)基(例如液體肉湯培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)剩余的液體懸浮液，懸浮液中還包含溶解物質(zhì)和懸浮物質(zhì)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”和“MALDI基質(zhì)”可互換使用，它是指一種液態(tài)或固態(tài)的化合物，可用來(lái)形成基質(zhì)用于MALDI質(zhì)譜分析。為了進(jìn)行MALDI，分析物必須嵌入大量對(duì)激光器發(fā)射的波長(zhǎng)具有良好吸收特性的分子中。這些基質(zhì)分子通常為小分子有機(jī)化合物，主要是酸類。在現(xiàn)有技術(shù)中，每種用于MALDI的激光的合適基質(zhì)材料是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)清楚地理解“MALDI基質(zhì)”這一術(shù)語(yǔ)。不限制本發(fā)明，常用基質(zhì)材料包括芥子酸(SA)、α -氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)、7_羥基_4_(三氟甲基)香豆素(HFMC)、3-羥基吡啶甲酸(3-ΗΡΑ)、5-(三氟甲基)尿嘧啶、咖啡酸、琥珀酸、鄰氨基苯甲酸、3-氨基吡嗪-2-羧酸、四(五氟苯基)卟啉和阿魏酸?；|(zhì)適宜地溶于乙腈/水/甲酸(500:500:1 ;ν/ν/ν),或其他適用比例取決于所用基質(zhì)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”是指含有或疑似含有分析物的物質(zhì)，例如要表征的微生物或內(nèi)酰胺酶，或者內(nèi)酰胺酶底物或其內(nèi)酰胺酶降解產(chǎn)物。本發(fā)明方法中使用的樣品可以為液態(tài)或是固態(tài)，可溶于或懸浮于液體、乳液或凝膠中，也可與某種物質(zhì)結(jié)合或被其吸附。樣品可以是生物樣品、環(huán)境樣品、實(shí)驗(yàn)樣品、診斷樣品或任何含有或疑似含有目標(biāo)分析物的其他類型樣品。同樣，樣品可以是或者可包含生物體、器官、組織、細(xì)胞、體液、活檢樣品或其碎片。本發(fā)明方法中使用的樣品可以是任何疑似含有分析物的物質(zhì)，例如β -內(nèi)酰胺酶和ESBL的底物。在生物環(huán)境中，樣品可以包含生物流體、整個(gè)生物體、器官、組織、細(xì)胞、微生物、培養(yǎng)基上清液、亞細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合物、單體蛋白、重組蛋白、融合蛋白、病毒、病毒粒子、肽和氨基酸。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“樣品載板”是指可適用于接受MALDI分析樣品的所有載板。常用載板為 10x10 不銹鋼祀板(Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA),如果適用，可在靶板上涂一層疏水涂層。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“米-曼常數(shù)” ΒΓΚπι”是指酶反應(yīng)速率為最大值的一半時(shí)的底物濃度。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“最大反應(yīng)速率”即“Vmax”是指飽和底物濃度下的最大酶反應(yīng)速率。米-曼動(dòng)力學(xué)描述了酶化學(xué)反應(yīng)生成分子的生成速率。為了確定酶反應(yīng)的最大速率，應(yīng)不斷增加底物濃度直至產(chǎn)物形成速率恒定。這是酶的“最大速率”(Vmax)。在這種情況下，酶的活性部位充滿底物。由于Vmax時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量底物濃度，因此可以通過(guò)最大速率達(dá)到一半時(shí)的底物濃度來(lái)表征酶。這個(gè)底物濃度就是米-曼常數(shù)(KM)。對(duì)于展示簡(jiǎn)單米-曼動(dòng)力學(xué)的酶反應(yīng)，這代表酶-底物(ES)復(fù)合物的解離常數(shù)(底物的親和力)。值越低，親和力越高。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“MALDI三重四極MS”是指一種基質(zhì)輔助激光解析/電離方法，其中質(zhì)譜儀具有三個(gè)與進(jìn)入離子平行的四極子。第一個(gè)四極子充當(dāng)濾質(zhì)器。第二個(gè)四極子充當(dāng)碰撞池，其中所選離子碎裂成碎片。第三個(gè)四極子對(duì)所產(chǎn)生的離子碎片進(jìn)行掃描。四極桿質(zhì)量分析器利用振蕩電場(chǎng)有選擇地穩(wěn)定或擾動(dòng)通過(guò)射頻(RF)四極場(chǎng)的離子的路徑。僅有一種質(zhì)荷比可以在任何時(shí)間穿過(guò)系統(tǒng)，而改變磁透鏡上的電勢(shì)可以讓多種m/z值快速擺動(dòng)，以持續(xù)的方式或連續(xù)的離散跳躍方式。四極桿質(zhì)譜分析器充當(dāng)質(zhì)量選擇濾質(zhì)器。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“定量分析”是指用于獲取定量測(cè)量的任何方法。例如，對(duì)微生物進(jìn)行定量分析 包括確定微生物的豐度、相對(duì)豐度、強(qiáng)度、濃度和/或計(jì)數(shù)等等。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)生物分子”是指數(shù)量在微生物培養(yǎng)基的各個(gè)細(xì)胞間基本上恒定的任何細(xì)胞蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、脂質(zhì)、核酸等，這一數(shù)量可用于定量分析那些微生物。例如，如果采用DNA，那么可通過(guò)DNA擴(kuò)增或利用(可鑒定質(zhì)譜的)核酸探針進(jìn)行定量分析。此類定量分析方法可采用諸如標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，其中可繪制DNA含量與細(xì)胞數(shù)量或其他生物量參數(shù)(例如培養(yǎng)基光密度或碳總質(zhì)量)關(guān)系的圖表。 本文中使用的術(shù)語(yǔ)“代謝物”是指在細(xì)胞或生物體內(nèi)進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)而生成的化合物，化合物的數(shù)量在微生物培養(yǎng)基的各個(gè)細(xì)胞間基本上恒定，這一數(shù)量可用于定量分析那些微生物。優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明提供用于表征微生物的抗生素抗性的方法。本方法的第一步是提供待表征對(duì)其抗性的抗生素化合物、其合適的模擬底物、抗生素化合物的分子靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)參考質(zhì)譜表征?？赏ㄟ^(guò)使用任何用于樣品分析的質(zhì)譜分析(MS)技術(shù)來(lái)制作參考光譜。優(yōu)選MS 技術(shù)為 MALD1-MS。適用的內(nèi)酰胺酶底物可以是任何內(nèi)酰胺類抗生素。或者，可以使用誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶在微生物中表達(dá)和/或能夠被β-內(nèi)酰胺酶的酶活性水解的β-內(nèi)酰胺類衍生物或模擬物。本發(fā)明中使用的模擬底物本身可以但不是必須顯示任何抗生素活性。β -內(nèi)酰胺酶底物優(yōu)選是一種β -內(nèi)酰胺酶降解產(chǎn)物能夠易于被MS識(shí)別的化合物，最好是底物及其降解產(chǎn)物具有不同的質(zhì)荷比。用于表征微生物的β -內(nèi)酰胺類抗生素抗性的優(yōu)選方法的另一步驟涉及使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的底物化合物，從而提供被暴露樣品。適用的被暴露樣品可以是疑似攜帶要表征β -內(nèi)酰胺類抗生素抗性的微生物的受試者(即人或動(dòng)物受 試者)的體液或體組織樣品。適用的體液樣品可以是血液、糞便、尿液樣品?？梢栽隗w內(nèi)或體外使微生物暴露于底物化合物。在某些實(shí)施方案中，暴露可以包含培養(yǎng)步驟，其中在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)微生物，例如在含有目標(biāo)抗微生物劑的溶液中培養(yǎng)1-5分鐘到1-3小時(shí)。此外，也可以使用微生物的裂解物和微生物培養(yǎng)基的上清液。有特定的酶存在時(shí)，抗微生物劑或其模擬底物被修飾或被滅活，從而導(dǎo)致與活性藥物形式相比在元素組成上有所不同。這會(huì)導(dǎo)致可通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)的抗微生物劑的質(zhì)量發(fā)生變化。本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)勢(shì)在于粗細(xì)胞裂解物也可用于提供被暴露樣品。因此，將要表征的微生物不需要存活，并且也無(wú)需在檢測(cè)其中的β_內(nèi)酰胺酶活性之前提純被暴露樣品。當(dāng)微生物含有β -內(nèi)酰胺酶基因卻在通行的生長(zhǎng)條件下沒(méi)有生成所述酶時(shí)，可通過(guò)在β-內(nèi)酰胺類抗生素或β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)化合物存在的情況下培養(yǎng)微生物來(lái)誘導(dǎo)微生物在生物體中生成內(nèi)酰胺酶。優(yōu)選地，在細(xì)菌細(xì)胞裂解之前，可選擇性地進(jìn)行誘導(dǎo)或刺激β -內(nèi)酰胺酶的生成。一般來(lái)說(shuō)，被暴露樣品對(duì)抗生素化合物的修飾能力可以通過(guò)檢測(cè)抗生素底物化合物的減少量來(lái)檢測(cè)，或者通過(guò)檢測(cè)修飾酶和底物化合物之間的水解反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物增加量來(lái)檢測(cè)。因此，被暴露樣品中β_內(nèi)酰胺酶的活性可以通過(guò)檢測(cè)β_內(nèi)酰胺酶底物化合物的減少量來(lái)檢測(cè)，或者通過(guò)檢測(cè)β_內(nèi)酰胺酶和底物化合物之間的水解反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物增加量來(lái)檢測(cè)?；蛘?，被暴露樣品對(duì)抗生素化合物的修飾能力還可以通過(guò)檢測(cè)對(duì)抗生素化合物的分子靶標(biāo)的修飾作用來(lái)檢測(cè)。例如，對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、甲氧西林和四環(huán)素的抗性基于靶標(biāo)修飾，例如RNA甲基化。同樣，這些靶標(biāo)修飾可以通過(guò)本文中所述的質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)。因此，本發(fā)明不限于檢測(cè)作為修飾酶的內(nèi)酰胺酶，也可以表征對(duì)內(nèi)酰胺類的抗性。同樣，也可以使用本發(fā)明表征不基于藥物修飾的對(duì)抗生素的其他抗性。盡管內(nèi)酰胺類通常通過(guò)水解作用滅活抗生素藥物，也可使用本發(fā)明中的設(shè)備和方法檢測(cè)和表征其他類型的酶修飾。例如，可通過(guò)添加磷酸基團(tuán)修飾氨基糖苷類抗生素。也可通過(guò)本發(fā)明中的方法檢測(cè)這類修飾酶底物的修飾。可通過(guò)質(zhì)譜分析非常精確地測(cè)量(定量)反應(yīng)或靶標(biāo)化合物的變化，這是本發(fā)明人的一項(xiàng)重要發(fā)現(xiàn)。因此，在培養(yǎng)步驟之后，可使用通用質(zhì)譜分析樣品制備方法，例如通過(guò)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)、固相萃取(SPE)或液液萃取(LLE)，來(lái)制備用于質(zhì)譜分析的被暴露樣品。大約使用IuL的制備溶液用于質(zhì)譜分析。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可采用MALDIMS，更優(yōu)選采用MALDI四極MS。使用MALDI MS，可精確測(cè)量反應(yīng)化合物，暴露時(shí)間(培養(yǎng)時(shí)段)可以非常短。通過(guò)大約5分鐘的培養(yǎng)時(shí)間即可成功表征。MALDI MS涉及將暴露樣品連同基質(zhì)涂布到質(zhì)譜分析樣品載板并在樣品載板上干燥樣品以制備質(zhì)譜分析樣品。適用的基質(zhì)在上文中已詳細(xì)說(shuō)明，而基質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有特殊的限制。可通過(guò)質(zhì)譜分析領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員的已知方法來(lái)從被暴露樣品制備質(zhì)譜樣品。樣品置于質(zhì)譜儀上之后，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序獲取樣品的質(zhì)譜，標(biāo)準(zhǔn)程序取決于所用設(shè)備和MS方法的類型。在本發(fā)明的方法中，采用MS、優(yōu)選串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS-MS)或基質(zhì)輔助激光解析/電離(MALDI)實(shí)施檢測(cè)底物或靶標(biāo)修飾(例如內(nèi)酰胺酶底物降解或RNA甲基化)步驟。質(zhì)譜分析提供一種有效的方法，用于確定復(fù)雜有機(jī)分子(包括蛋白質(zhì)和肽)的結(jié)構(gòu)和種類。在MS中，樣品化合物被高能電子轟擊，使其成為具有一定特性的碎片。這些重量和電荷各異的碎片隨后經(jīng)過(guò)一個(gè)磁場(chǎng)，并根據(jù)其質(zhì)荷比進(jìn)行分離。樣品化合物的最終特有碎片特征樣式(質(zhì)譜)可用于鑒定和定量分析此化合物。典型的MS程序包括以下步驟:1.通過(guò)將樣品任選地(在稱之為MALDI的特殊形式的MS的情況下)連同基質(zhì)涂布到質(zhì)譜分析樣品載板上將樣品裝載到MS儀器，并通過(guò)蒸發(fā)溶劑在載板上干燥樣品或混合物。2.通過(guò)多種方法(例如通過(guò)電子束沖擊樣品)之一電離樣品成分，從而形成帶電荷的粒子(離子)3.通過(guò)電場(chǎng)加速正離子4.根據(jù)離子在電磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)的詳細(xì)信息計(jì)算粒子的質(zhì)荷比(m/z)，并且5.檢測(cè)在步驟4中根據(jù)m/`z排列的離子。在MALDI MS中，基質(zhì)由結(jié)晶分子組成，其中三種適合的結(jié)晶分子示例分別是3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-氰基或α -基質(zhì))和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)?；|(zhì)溶液與被暴露樣品混合在一起。有機(jī)溶劑使疏水分子溶于溶液之中，而水則使可溶于水(親水)的分子溶于溶液之中。在MALDI板或載板上(通常是特制的金屬板)點(diǎn)涂此溶液。將溶劑蒸發(fā)掉，僅剩下重結(jié)晶的基質(zhì)和分散在基質(zhì)晶體上的樣品分子?？捎糜诒景l(fā)明的適用MS應(yīng)用包括MALD1-TOF MS質(zhì)譜分析、MALD1-FT質(zhì)譜分析、MALD1-FT-1CR質(zhì)譜分析、MALDI三重四極質(zhì)譜分析。采用MALD1-T0F質(zhì)譜分析，通量估計(jì)為每個(gè)樣品I分鐘。采用MALDI三重四極質(zhì)譜分析，試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間減少為每個(gè)樣品大約5秒，不會(huì)喪失靈敏度或針對(duì)性。采集質(zhì)譜后，以定性、半定量或定量分析的方式比較衍生樣品質(zhì)譜與抗微生物化合物、其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)的參考質(zhì)譜，也可與其修飾酶的底物化合物的參考質(zhì)譜進(jìn)行比較。通過(guò)此類比較，可以定性、半定量或定量分析的方式確定底物或靶標(biāo)的修飾和/或修飾產(chǎn)物的生成。質(zhì)譜分析可以同時(shí)測(cè)量失活或修飾的抗生素(例如降解產(chǎn)物)和未受損的抗生素底物(或模擬底物)以及分子靶標(biāo)，而產(chǎn)物與底物的比例可測(cè)量微生物滅活或修飾被測(cè)底物的能力?；蛘呋虼送猓瑯悠分械牡孜锼綔p少或產(chǎn)物水平增加的任意一個(gè)均可作為微生物的抗生素滅活或抗生素修飾能力的量度?；蛘?，分子靶標(biāo)水平增加或修飾(抗性)靶標(biāo)水平增加可以指示微生物的抗性。在表征對(duì)藥物的抗生素抗性(涉及靶標(biāo)修飾作為抗性機(jī)制)的情況下，使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的抗微生物化合物的步驟相當(dāng)于提供微生物、細(xì)胞裂解物或生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液的樣品并在其中檢測(cè)被修飾靶標(biāo)。因此，在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施方案中，抗微生物底物化合物的修飾作為微生物生成諸如β_內(nèi)酰胺酶的證據(jù)，并表明該微生物可能對(duì)例如通過(guò)降解、所提供的抗微生物底物化合物或適用的模擬底物的特定β-內(nèi)酰胺酶滅活的β-內(nèi)酰胺類抗生素化合物具有抗性。例如,通過(guò)這種方法,可表征所述微生物種對(duì)內(nèi)酰胺類抗生素的抗性?；蛘撸诒景l(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物細(xì)胞中的抗微生物化合物分子靶標(biāo)的修飾(相對(duì)數(shù)量或化學(xué)成分的修飾)表明微生物可能對(duì)目標(biāo)抗生素化合物具有抗性。例如,通過(guò)這種方法,可表征微生物種對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、甲氧西林和四環(huán)素的抗性。如上所述，本發(fā)明在某些實(shí)施方案中提供一種快速診斷微生物的方法，微生物生成滅活或在結(jié)構(gòu)上修飾抗微生物劑的酶。該方法可用于快速檢測(cè)ESBL活性。特別是在醫(yī)院中，極為需要這種方法，因?yàn)榈谌^孢菌素廣泛用于針對(duì)感染的重癥患者的經(jīng)驗(yàn)療法。快速檢測(cè)患者樣品中的ESBL活性對(duì)于盡早開(kāi)始為患者提供最適用的抗生素藥物療法極為重要。本發(fā)明中的方法可用于快速檢測(cè)ESBL活性。此外，本發(fā)明中的方法同樣適用于微生物培養(yǎng)基上清液或直接從諸 如經(jīng)尿液樣品離心后的患者樣品分離出的微生物。通過(guò)這種方法，甚至在檢測(cè)出(培養(yǎng)的)細(xì)菌之前，應(yīng)當(dāng)有可能檢測(cè)出ESBL活性。質(zhì)譜分析尚未用于通過(guò)監(jiān)測(cè)底物強(qiáng)度的降低和/或產(chǎn)物強(qiáng)度的增加來(lái)檢測(cè)抗生素的酶失活或化學(xué)修飾。此外，質(zhì)譜分析也尚未用于研究復(fù)雜樣品(例如裂解微生物)的酶活性。更為具體地是，以前從未發(fā)表使用MS的ESBL酶檢測(cè)和表征?？焖贆z測(cè)ESBL活性的診斷方法還需要適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)使用裂解試劑裂解樣品從微生物中釋放出抑制抗微生物劑的β_內(nèi)酰胺酶。隨后，可轉(zhuǎn)移這些裂解物，最好使用自動(dòng)移液器移液到多孔試片，例如ΑΤΒ 或Rapidec 試片，這些試片包含一些帶有試劑的孔，可根據(jù)不同的抗微生物化合物進(jìn)行不同的試驗(yàn)反應(yīng)。例如，一些孔包含一定數(shù)量的一種或多種β -內(nèi)酰胺酶底物，以干燥或固定(膠合)的形式存在。一些孔還可包含一種或多種內(nèi)標(biāo)物，便于進(jìn)行定量分析。一些孔還可作為對(duì)照而未裝有底物，用于抗微生物化合物的自降解。轉(zhuǎn)移到孔中、并如本文所述培養(yǎng)一小段時(shí)間后，每個(gè)孔的被暴露樣品適于放置在MALDI板或其他MS載板上。在MALDI的情況下，將適用的基質(zhì)添加到載板上。之后，即可獲取質(zhì)譜。使用專用的分析算法進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)譜分析。隨后，使用計(jì)算機(jī)軟件比較從被暴露樣品獲得的質(zhì)譜和參考質(zhì)譜，以便確定每個(gè)孔的底物是否降解。如果出現(xiàn)降解，那么專用軟件可能會(huì)以報(bào)告的形式提供試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告可能包含諸如如下內(nèi)容:(I)微生物的種類(種名)(微生物種的鑒定可以通過(guò)參考試驗(yàn)進(jìn)行，也可在相同或平行的試片中進(jìn)行)，(2)多孔試片中提供的被測(cè)抗微生物劑清單，(3)被微生物種抑制或降解的抗微生物劑清單，(4)假設(shè)負(fù)責(zé)抗微生物抑制的抗性機(jī)制，(5)關(guān)于結(jié)果的專用解釋備注?；蛘撸梢栽谫|(zhì)譜載板上進(jìn)行使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的底物化合物(從而提供被暴露樣品)的步驟。在允許任選地存在的β_內(nèi)酰胺酶在樣品載板上降解β -內(nèi)酰胺酶底物化合物時(shí)，可將MALDI基質(zhì)直接添加到被暴露樣品O可使用復(fù)雜樣品(其中包括粗細(xì)胞裂解物或患者樣品)實(shí)施本發(fā)明中的方法。該方法允許精確評(píng)估抗微生物劑大小范圍(通常200到1000道爾頓)內(nèi)的分子，并且可適用于使用例如作為底物的抗微生物藥物確定抗生素滅活或抗生素修飾酶的活性。本發(fā)明中的方v法 還可作為ESBL確證試驗(yàn)使用。在大多數(shù)臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，首先要為ESBL表型篩選細(xì)菌，隨后可采用獨(dú)立的ESBL表型確證試驗(yàn)確定ESBL表型。本發(fā)明可用于確定細(xì)菌中的ESBL表型。較之目前的表型試驗(yàn)，本發(fā)明中的方法的優(yōu)勢(shì)在于本文中建議使用的方法不僅可以處理細(xì)菌懸浮液還可處理細(xì)菌裂解物。采用細(xì)菌裂解物能夠抵消因基于其他機(jī)制的抗性而導(dǎo)致的潛在偏差，特別是藥物的進(jìn)入減少，排出增加。細(xì)菌裂解物與目前的表型ESBL確證試驗(yàn)不能配套使用，因?yàn)檫@些試驗(yàn)均依靠細(xì)菌的生長(zhǎng)。本發(fā)明中的方法還可作為高通量篩選方法使用，用于醫(yī)藥行業(yè)的新型β_內(nèi)酰胺酶抑制劑。目前，內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦分別與氨基青霉素和哌拉西林配合使用，用于克服生成β_內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌帶來(lái)的問(wèn)題?？死S酸或他唑巴坦抑制β_內(nèi)酰胺酶的活性，而氨基青霉素或哌拉西林殺滅細(xì)菌?？紤]到日益增長(zhǎng)的ESBL問(wèn)題，醫(yī)藥行業(yè)急需篩選抑制ESBL的新型化合物的工具。本發(fā)明極為適用于此目的。
實(shí)施例我們通過(guò)使用作為底物的芐青霉素檢測(cè)出生成CTX-M-1和CTX-M-9的大腸桿菌的粗裂解物以及生成SHV-2的肺炎克雷伯菌中的β -內(nèi)酰胺酶的活性。以芐青霉素為底物，我們能夠監(jiān)測(cè)純青霉素酶(源于蠟樣芽胞桿菌(B.Cereus))的酶動(dòng)力學(xué)。
權(quán)利要求
1.一種用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步驟: a)提供抗微生物化合物、其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或者其修飾酶底物化合物的參考質(zhì)譜； b)使微生物、其細(xì)胞裂解物或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露樣品； c)獲取被暴露樣品的質(zhì)譜； d)比較在c)步驟中獲取的質(zhì)譜和在a)步驟中的參考質(zhì)譜，以及 e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現(xiàn)所述抗微生物化合物、其修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或所述底物的修飾，并確立在觀察到所述修飾時(shí)所述微生物潛在地對(duì)所述抗微生物化合物存在抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾包括所述抗微生物化合物或所述底物的酶鈍化或酶降解和/或其分子靶標(biāo)的甲基化或過(guò)量生成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述的酶降解是由β-內(nèi)酰胺酶降解導(dǎo)致。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的β-內(nèi)酰胺酶選自根據(jù)Ambler分類法的A和D類的β -內(nèi)酰胺酶，或者屬于根據(jù)Bush分類的2類的β -內(nèi)酰胺酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的β-內(nèi)酰胺酶是超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述的微生物是疑似生成ESBL的微生物，優(yōu)選地選自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia coli )、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述的抗微生物化合物是內(nèi)酰胺類抗生素，優(yōu)選地選自青霉素、頭孢菌素、頭霉素類和碳青霉烯類，更優(yōu)選選自頭孢他啶、頭孢噻月虧、頭孢曲松、頭孢泊廂和氨曲南。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述的方法也是用于表征微生物的抗微生物修飾酶的方法的一部分，優(yōu)選地所述抗微生物修飾酶是超廣譜內(nèi)酰胺酶(ESBL)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的用于表征所述酶的方法包括確定所述抗微生物化合物或所述底物化合物的修飾速率、優(yōu)選降解速率和/或所述化合物或底物的酶修飾產(chǎn)物的生成速率，或者所述化合物分子靶標(biāo)的生成速率，從而確定所述酶的米-曼(Km)常數(shù)和最大反應(yīng)速率(Vmax)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在步驟b)之后，所述被暴露樣品和基質(zhì)一同涂布在質(zhì)譜分析樣品載板上，其中所述樣品在樣品載板上干燥以制備質(zhì)譜樣品用于基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜分析(MALD1-MS)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述質(zhì)譜是通過(guò)使用MALDI三重四極MS獲得的。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述的被暴露樣品為所述微生物的被暴露于抗微生物化合物的粗細(xì)胞裂解物。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中，通過(guò)在所述樣品中定量分析由所述微生物衍生的一種或多種結(jié)構(gòu)生物分子或代謝物來(lái)定量分析所述微生物，優(yōu)選地其中所述結(jié)構(gòu)生物分子或代謝物為DNA分子。
14.用于表征微生物的抗生素抗性的試劑盒，其包含: a)用于裂解微生物的裂解緩沖液；b)至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物，以及c)MALDI 基質(zhì)， 優(yōu)選地所述試劑盒進(jìn)一步包含: d)攜帶所述至少一種抗微生物化合物或底物的載體，其中所述載體任選地是一次性質(zhì)譜分析樣品載板。
15.用于表征微生物的抗生素抗性的系統(tǒng)，其包含: -至少一種抗微生物化合物或抗微生物化合物修飾酶的底物； -容器，用于使微生物、其細(xì)胞裂解物、或其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的所述至少一種抗微生物化合物，優(yōu)選地其中至少一種底物化合物在所述容器中提供； -用于裂解所述微生物的裂解緩沖液； -MALDI 基質(zhì)； -質(zhì)譜分析裝置； -抗微生物化合物、其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或者其修飾酶底物化合物的參考質(zhì)譜，以及 -質(zhì)譜分析樣品載板， 任選地進(jìn)一步包含 -用于液體處理的自動(dòng)移液器； -計(jì)算機(jī)程序，其包含計(jì)算機(jī)程序代碼工具，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)或者其中所述的計(jì)算機(jī)程序在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上實(shí)現(xiàn)，可執(zhí)行權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的所有步驟。
16.計(jì)算機(jī)程序，其包含計(jì)算機(jī)程序代碼工具，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，可執(zhí)行權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的所有步驟。
17.計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，其包含存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)程序代碼工具，當(dāng)所述程序產(chǎn)品在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，可執(zhí)行權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表征微生物中抗生素抗性的方法，所述方法包括步驟(a)提供抗微生物化合物、其酶修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或者其修飾酶底物化合物的參考質(zhì)譜；(b)使微生物、其細(xì)胞裂解物、其生長(zhǎng)培養(yǎng)基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露樣品；(c)獲取被暴露樣品的質(zhì)譜；(d)比較在c)步驟中獲取的質(zhì)譜和在a)步驟中的參考質(zhì)譜，以及(e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現(xiàn)所述抗微生物化合物、其修飾產(chǎn)物、其分子靶標(biāo)或所述底物的修飾，并確立在觀察到所述修飾時(shí)所述微生物對(duì)所述抗微生物化合物潛在地存在抗性。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103108958SQ201080068659
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者T·M·魯威德, J·J·A·范坎朋, A·F·范貝爾庫(kù)姆, W·H·F·格森斯, G·P·胡弗 申請(qǐng)人:伊拉斯謨大學(xué)鹿特丹醫(yī)藥中心