一種重組人胰島素的工業(yè)制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體是指一種重組人胰島素的工業(yè)制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術的迅猛發(fā)展，基因工程重組人胰島素面世，較動物來源胰島素優(yōu)勢更加明顯，與人體內胰島素的序列完全一致，且純度更高，含宿主蛋白少，安全無毒副作用。
[0003]現(xiàn)有的人胰島素的制取方法，工序復雜，對原料及設備要求較高，無法適應批量化生產的需要。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種重組人胰島素的工業(yè)制備方法，簡化工藝流程，提高生廣效率，改進廣品品質，適應工業(yè)制備需求。
[0005]本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn):一種重組人胰島素的工業(yè)制備方法，包括以下步驟:
步驟SlOO:制備菌種；
步驟S200:培養(yǎng)菌種；
步驟S300:包涵體的收集；將培養(yǎng)的菌種在-20°C以下凍干，然后用緩沖液A溶解，室溫狀態(tài)下振蕩2-4h，固液分離后收集沉淀，得包涵體；
步驟S400:RRhPI初步純化；將收集的包涵體用緩沖液B完全溶解后，再以緩沖液B與緩沖液C體積比為1:2-1:10添加緩沖液C，使蛋白濃度為0.05-0.5mg/ml，然后上于已用緩沖液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脫，收集含RRhPI的洗脫液；
步驟S500:RRhPI重組復性；初步純化后的RRhPI通過Sephadex G-25脫尿素，再轉換到緩沖液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI復性液；
步驟S600:酶切轉化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的質量比為2:1:2000，向RRhPI復性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室溫酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12終止反應并沉淀生成hi ；
步驟S700:hl的純化；hl的純化包括粗純化和精純化；所述粗純化時，將步驟S600中的hi通過預置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的兩步柱層析，對hi進行初步提純得到粗品；所述精純化時，用10-20mmol/L的色譜乙腈對粗品進行精制得到精品；步驟S800:hl成品；精品再經多次結晶和水洗后進入過濾除菌室，-20°C以下凍干，得到hi成品；
所述步驟SlOO具體是指:
步驟SllO:以人胰腺CDNA文庫為模板，用PCR擴增技術提取目的基因；
步驟S120:從用細胞工程培養(yǎng)的大腸桿菌中通過堿裂解法提取環(huán)裝的pQE-40質粒；步驟S130:分別取出目的基因和pQE-40質粒，分別利用限制性內切酶Bam HI和HindIII同時酶切并產生粘性末端； 步驟S140:在20°C以下，T4DNA連接酶的作用下，將目的基因與pQE_40質粒結合通過粘性末端互補，形成一個能表達胰島素的重組DNA ;
步驟S150:將含有目的基因的重組DNA放入大腸桿菌的培養(yǎng)液中并加入氯化鈣，使大腸桿菌將重組DNA吸收，重組DNA轉化E.coli感受態(tài)細胞Ml5 ；
所述步驟S200具體是指:
步驟S210:取出步驟SlOO中制備的菌種進行活化；
步驟S220:采用二級發(fā)酵方式，恒溫振蕩2-3h ；
步驟 S230:用 0.5mmol/L 的 IPTG 誘導 RRhPI/pQE40 E.coli M15 菌種表達 RRhPI。
[0006]進一步地，所述步驟S210具體是指:取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌種一環(huán)接種于PH值為6.8-7.6的培養(yǎng)基中，室溫條件下以200-280rpm的速度進行振蕩培養(yǎng)，通氣量為1:1.3-1:1.6 ;所述培養(yǎng)基的主要成分為3-8g/L胰蛋白胨，l-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L 硫酸錢，2-3g/L 葡萄糖，2-3g/L 甘油，90-110mg/L 氨節(jié)青霉素，40_60mg/L卡那霉素。
[0007]進一步地，所述培養(yǎng)基的最優(yōu)配比為5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸錢，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨節(jié)青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培養(yǎng)基用NaOH調節(jié)PH值至7.2。
[0008]進一步地，所述步驟S300中緩沖液A的主要成分為40-60mmol/L Tris-HCl,0.2-0.8mmol/L EDTA，40-60mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1-0.5mmol/L DTT ;所述緩沖液 A 的 PH值為 7.8-8.2 ο
[0009]進一步地，所述步驟S300中緩沖液A的主要成分為50mmol/L Tris-HCl, 0.5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl，5% 甘油，0.3mmol/L DTT ;所述緩沖液 A 的 PH 值為 7.9。
[0010]進一步地，所述步驟S400中緩沖液B的主要成分為0.1%-0.3%β-硫基乙醇，5-50mmol/L Tris-HCl，5-lOmol/L 尿素；所述緩沖液 B 的 PH 值為 7.8-8.2。
[0011]進一步地，所述步驟S400中緩沖液B的主要成分為0.2%β-硫基乙醇，30mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素；所述緩沖液B的PH值為8.0。
[0012]進一步地，所述步驟S400中緩沖液C的主要成分為40-70mmol/L Gly-NaOH,0.3%-0.5%的半胱氨酸；所述緩沖液C的PH值為9-10。
[0013]進一步地，所述步驟S500中緩沖液D的主要成分為40-70mmol/L Gly-NaOH,10-50mmol/L GSSG，10-50mmol/L GSH ;所述緩沖液 D 的 PH 值為 9-10。
[0014]進一步地，所述步驟S500中緩沖液D的主要成分為50mmol/L Gly-NaOH, 30mmol/L GSSG，30mmol/L GSH ;所述緩沖液 D 的 PH 值為 9.5。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點及有益效果:簡化工藝流程，提高生產效率，改進廣品品質，適應工業(yè)制備需求。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明的工藝流程不意圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步地詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0018]實施例1:
本實施例的一種重組人胰島素的工業(yè)制備方法，主要是通過下述技術方案實現(xiàn):包括以下步驟:
步驟SlOO:制備菌種；
步驟S200:培養(yǎng)菌種；
步驟S300:包涵體的收集；將培養(yǎng)的菌種在-20°C以下凍干，然后用緩沖液A溶解，室溫狀態(tài)下振蕩2-4h，固液分離后收集沉淀，得包涵體；
步驟S400:RRhPI初步純化；將收集的包涵體用緩沖液B完全溶解后，再以緩沖液B與緩沖液C體積比為1:2-1:10添加緩沖液C，使蛋白濃度為0.05-0.5mg/ml，然后上于已用緩沖液B平衡的DEAE-S印harose FF柱，用NaCl梯度洗脫，收集含RRhPI的洗脫液；
步驟S500:RRhPI重組復性；初步純化后的RRhPI通過Sephadex G-25脫尿素，再轉換到緩沖液D中，4°C放置18h以上，得RRhPI復性液；
步驟S600:酶切轉化；按胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白的質量比為2:1:2000，向RRhPI復性液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B，室溫酶切50-80min，然后用0.lmol/L ZnC12終止反應并沉淀生成hi ；
步驟S700:hl的純化；hl的純化包括粗純化和精純化；所述粗純化時，將步驟S600中的hi通過預置8_12mmol/L的Tris-HCl和0-1.0mmol/L的NaCl的兩步柱層析，對hi進行初步提純得到粗品；所述精純化時，用10-20mmol/L的色譜乙腈對粗品進行精制得到精品；步驟S800:hl成品；精品再經多次結晶和水洗后進入過濾除菌室，-20°C以下凍干，得到hi成品；
所述步驟SlOO具體是指:
步驟SllO:以人胰腺CDNA文庫為模板，用PCR擴增技術提取目的基因；
步驟S120:從用細胞工程培養(yǎng)的大腸桿菌中通過堿裂解法提取環(huán)裝的pQE-40質粒；步驟S130:分別取出目的基因和pQE-40質粒，分別利用限制性內切酶Bam HI和HindIII同時酶切并產生粘性末端；
步驟S140:在200C以下，T4DNA連接酶的作用下，將目的基因與pQE_40質粒結合通過粘性末端互補，形成一個能表達胰島素的重組DNA ;
步驟S150:將含有目的基因的重組DNA放入大腸桿菌的培養(yǎng)液中并加入氯化鈣，使大腸桿菌將重組DNA吸收，重組DNA轉化E.coli感受態(tài)細胞Ml5 ；
所述步驟S200具體是指:
步驟S210:取出步驟S100中制備的菌種進行活化；
步驟S220:采用二級發(fā)酵方式，恒溫振蕩2-3h ；
步驟 S230:用 0.5mmol/L 的 IPTG 誘導 RRhPI/pQE40 E.coli M15 菌種表達 RRhPI。
[0019]實施例2:
本實施例在上述實施例的基礎上做進一步優(yōu)化，進一步地，所述步驟S210具體是指:取RRhPI/pQE40 E.coli M15斜面菌種一環(huán)接種于PH值為6.8-7.6的培養(yǎng)基中，室溫條件下以200-280rpm的速度進行振蕩培養(yǎng)，通氣量為1: 1.3-1:1.6 ;所述培養(yǎng)基的主要成分為3-8g/L胰蛋白胨，l-3g/L谷氨酸，6-8g/L酵母浸膏，0.1-1.0g/L硫酸錢，2_3g/L葡萄糖，2-3g/L甘油，90-110mg/L氨芐青霉素，40_60mg/L卡那霉素。本實施例的其他部分與上述實施例相同，故不再贅述。
[0020]實施例3:
本實施例在上述實施例的基礎上做進一步優(yōu)化，進一步地，所述培養(yǎng)基的最優(yōu)配比為5g/L胰蛋白胨，2g/L谷氨酸，7g/L酵母浸膏，0.5g/L硫酸錢，2.5g/L葡萄糖，2.7g/L甘油，100mg/L氨芐青霉素，50mg/L卡那霉素；所述培養(yǎng)基用NaOH調節(jié)PH值至7.2。本實施例的其他部分與上述實施例相同，故不再贅述。
[0021]實施例4:
本實