一種快速提取荷花花瓣總rna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法，涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域中提取總RNA的方法。本方法主要是：用液氮研磨荷花花瓣成粉末狀，加入65oC預(yù)熱的細(xì)胞裂解液破裂細(xì)胞，并添加乙酸鉀溶液作為沉淀輔助劑，經(jīng)氯仿抽提后離心沉淀RNA，最后用焦炭酸二乙酯處理水溶解。本發(fā)明所獲得的總RNA質(zhì)量和產(chǎn)率高；步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；試劑便宜；適用于在次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高的荷花花瓣中大量提取高質(zhì)量RNA。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域中提取總RNA (Ribonucleic Acid,核糖核酸)的方法，尤其涉及一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法；具體地說(shuō)，是以一種次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高的荷花花瓣為材料，快速、經(jīng)濟(jì)和有效地提取高質(zhì)量的總RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]騎花XNe I umbo /wci/era),又稱(chēng)蓮花,水芙蓉等,屬睡蓮科多年生水生草本花丼。荷花在我國(guó)已有近3000年的栽培歷史，是一種集觀賞、食用和藥用于一身的重要經(jīng)濟(jì)作物。目前對(duì)荷花在分子生物學(xué)方面的研究還很缺乏，主要集中于分子標(biāo)記研究品種多態(tài)性，一些功能基因的克隆等方面。目前，迫切需要一種有效地提取荷花花瓣的總RNA的方法，為深層地研究與花的發(fā)育、花的香氣形成、花瓣中與次級(jí)代謝物合成以及荷花感光感溫等相關(guān)的功能基因的研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而用于培育荷花新品種。 [0003]商業(yè)化的Trizol (試劑盒)雖然能簡(jiǎn)單快速地提取植物總RNA，但是無(wú)法有效地提取荷花花瓣的總RNA，分析可能是由于RNA被多糖多酚物質(zhì)吸附不能得到有效的沉淀所致。有報(bào)道利用改良的CTAB-LiCl法提取荷花花瓣的總RNA (楊峰，李創(chuàng)等，2009)，但是所用試劑繁多，而且耗時(shí)也很長(zhǎng)，增大了提取過(guò)程中RNA降解的可能性，實(shí)際使用效果欠佳。雖然快速提取植物總RNA的試劑盒采用吸附核酸的樹(shù)脂或膜，但經(jīng)實(shí)踐證明，依然不能解決上述問(wèn)題，同時(shí)存在步驟多和效率低的問(wèn)題。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單快速且經(jīng)濟(jì)的提取荷花花瓣總RNA的方法以便用于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
包括提取RNA用具的處理、試劑的配置以及提取的具體步驟。
[0006]具體地說(shuō):
1、提取RNA用具的處理和試劑的配置
研缽、研杵和藥勺用紙包好置于160 0C烘箱烘烤6個(gè)小時(shí)，槍頭和1.5ml的離心管用的是RNase free的Axygen公司產(chǎn)品(美國(guó))；所有用到水配制的試劑都是用DEPC處理水(即0.1%的DEPC水37 0C處理12小時(shí)后，再經(jīng)121°C高溫滅菌20min備用)。
[0007]2、具體步驟
①稱(chēng)取0.2g荷花花瓣于液氮預(yù)冷的研缽中迅速充分地研磨成粉末狀；
②將粉末狀樣品轉(zhuǎn)入1.5mL RNase free的離心管中，加入ImL 65°C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液，混勻后繼續(xù)65°C溫育lOmin，期間搖勻2~3次；
③加入300μ L的乙酸鉀溶液,上下溫和顛倒混勻15~20次,室溫靜置3~5min ；
④4°C,12000rpm,離心5min,取上清于一新的離心管中；⑤加入300μ L氯仿:異戊醇=24:1 (V:V)，震蕩15s，4°C，12000rpm，離心30s使分層，取上層水相于一新的離心管中，重復(fù)此步驟I~2次；
⑥加入與上層水相等體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇，置于_20°C冰箱30min；
⑦在4°C、12000rpm的條件下,離心5min使RNA沉淀；
⑧移去上清，用ImL的-200C預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀兩次，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干后，加入10~20 μ L的DEPC (焦炭酸二乙酯)處理水溶解RNA，于-80 0C保存。
[0008]本發(fā)明的工作原理如下:
細(xì)胞裂解液中的SDS(Sodium Dodecyl Sulfonate，十二烷基磺酸鈉)能破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制細(xì)胞內(nèi)的RNA酶，從而保證釋放出來(lái)的RNA的完整性。EDTA(Ethylene DiamineTetraacetic Acid,乙二胺四乙酸)是一種金屬離子螯合劑，也能抑制需要金屬離子輔助的RNA酶的活性。而PVP (Polyvinyl Pyrrolidone,聚乙烯吡咯燒酮)和β-巰基乙醇都是還原劑，防止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化而和RNA結(jié)合。
[0009]在65°C條件下，糖類(lèi)溶解在提取液的水相中。乙酸鉀可以在此條件下有效地沉淀RNA,從而達(dá)到有效去除多糖并沉淀高純度RNA之目的。氯仿可使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分開(kāi)，從而除去溶于有機(jī)相中的酚和蛋白的復(fù)合體，此外氯仿作為有機(jī)溶劑使部分蛋白變性，使之通過(guò)離心除去，而氯仿中加入少量的異戊醇(體積為1/25)可減少蛋白質(zhì)在變性過(guò)程中由于震蕩產(chǎn)生的泡沫，從而避免影響后續(xù)操作。最后經(jīng)異丙醇沉淀和75%乙醇洗滌后便可得到高質(zhì)量的RNA。
[0010]本發(fā)明具有下列 優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
①所獲得的總RNA質(zhì)量和產(chǎn)率高；
②步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；
③試劑便宜；
④適用于在次級(jí)代謝產(chǎn)物含量高的荷花花瓣中大量提取高質(zhì)量RNA。
【具體實(shí)施方式】
[0011]一、細(xì)胞裂解液
1、I升細(xì)胞裂解液中含有下列組分
SDS (十二烷基硫酸鈉)40克
Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)200毫摩爾
EDTA (乙二胺四乙酸)0.5毫摩爾
PVP (聚乙烯吡咯烷酮-40)20克
β-巰基乙醇10毫升
其它為DEPC (焦炭酸二乙酯)處理水。
[0012]2、細(xì)胞裂解液的制備方法
①用DEPC處理水配制200毫摩爾/升的Tris— HCl緩沖液(ρΗ7.4~7.5)置于容器
中；
②依次加入SDS、EDTA,PVP和β -巰基乙醇，搖勻；
③置于冰箱內(nèi)4°C保存。
[0013]二、乙酸鉀溶液稱(chēng)50克乙酸鉀，加入11毫升的冰醋酸，用DEPC處理水定容至100毫升，密封置于冰箱內(nèi)4°C保存。
[0014]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用等質(zhì)量的荷花花瓣材料，分別應(yīng)用本方法，Ttizol法和改良的CTAB-LiCl法得到荷花花瓣的總RNA,分別使用核酸測(cè)定儀(eppendorf Biophotometer plus 6132)測(cè)定其在紫外波長(zhǎng)分別為230納米、260納米和280納米的吸光值以及RNA的濃度，并計(jì)算出這三
種方法所得的RNA的A 260/ A 280和A 260/ A 230的比值，結(jié)果如下:_
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取荷花花瓣總RNA的方法，其特征在于包括下列步驟: ①稱(chēng)取0.2g荷花花瓣于液氮預(yù)冷的研缽中迅速充分地研磨成粉末狀； ②將粉末狀樣品轉(zhuǎn)入-1.5mL RNase free的離心管中，加入ImL 65°C預(yù)熱的細(xì)胞裂解液，混勻后繼續(xù)65°C溫育lOmin，期間搖勻2~3次；③加入300μ L的乙酸鉀溶液,上下溫和顛倒混勻15~20次,室溫靜置3~5min ； ④4°C,12000rpm,離心5min,取上清于一新的離心管中； ⑤加入300μ L氯仿:異戊醇=24:1，震蕩15s，4°C，12000rpm，離心30s使分層，取上層水相于一新的離心管中，重復(fù)此步驟I~2次； ⑥加入與上層水相等體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇，置于_20°C冰箱30min； ⑦在4°C、12000rpm的條件下,離心5min使RNA沉淀； ⑧移去上清，用ImL的-200C預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀兩次，在超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干后，加入10~20 μ L的焦炭酸二乙酯處理水溶解RNA，于-80 0C保存；
所述的I升細(xì)胞裂解液中含有下列組分: 十二烷基硫酸納40克 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽200毫摩爾 乙二胺四乙酸0.5毫摩爾 聚乙烯吡咯烷酮20克β-巰基乙醇10毫升 其它為焦炭酸二乙酯處理水。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103993003SQ201310053848
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月20日
【發(fā)明者】王坤, 鄧嬌, 楊平仿 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢植物園