專利名稱：一種依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶及其編碼基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種橡膠樹依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖酵解是存在一切生物體內(nèi)糖分解的普遍途徑，該途徑在細(xì)胞質(zhì)中分解葡萄糖生成丙酮酸，此過程中有少量ATP和NADH生成，同時還會產(chǎn)生一些重要的前體代謝物，為生物體提供必須的碳源和能源，是處于中樞位置的代謝途徑(Plaxton，WC.The organization and regulation of plant glycolysis.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol..1996;48:185-214.)。因此，糖酵解過程的精確調(diào)節(jié)，在生物體的生長發(fā)育及生物與非生物脅迫中起著重要作用，以滿足機(jī)體的需要并保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而此過程中的調(diào)控及調(diào)節(jié)主要是通過調(diào)節(jié)酶的活性來實現(xiàn)的(Danson J, WasanoK，Nose A.1nfection of rice plants with the sheath blight fungus causesan activation of pentose phosphate and glycolytic pathways.Eur.J.Plant.Pathol..2000;106:555-61.Mutuku M，Nose A.Changes in the contents of metabolitesand enzyme activities in rice plants responding to Rhizoctonia solani (Kuhn)infection:activation of glycolysis and connection to phenylpropanoid pathway.Plant Cell Physiol..2012; 53 (6): 1017-32.) 0很多研究認(rèn)為磷酸果糖激酶是糖酵解途中的一個限速酶，糖酵解的速度取決于此酶的活性，并且它的存在可以作為糖酵解途徑存在的標(biāo)志(Racker E.The rate-limiting steps in glycolysis.Trends BiochemSc1..1984;9:516.) 0根據(jù)磷酸果糖激酶催化反應(yīng)提供能量和磷酸基的不同，分為依賴ATP的磷酸果糖激酶(PFK-1，EC2.7.1.11)，另一類依賴焦磷酸(PPi)的磷酸果糖激酶(PFP，EC2.7.1.90) (Botha A, Botha F.Pyrophosphate dependent phosphofructokinaseof Citrullus lanatus:molecuIar forms and expression of subunits.PlantPhysiol.1991;96:1185-92.Podesta FE,Plaxton, WC.Regulation of cytosolic carbonmetabolism in germinating Ricinus communis cotyledons.1.Developmentalprofiles for the activity,concentration, and molecular structure of thepyrophosphate-dependent and ATP-dependent phosphofructoinase，phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate kinase.Planta.1994; 194:374-380.) 與憐酸果糖激酶(PFK-1)相比，磷酸果糖激酶(PFP)同樣作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1，6-雙磷酸，但提供能量及磷酸基不是ATP而是焦磷酸(PPi)，且此催化反應(yīng)為可逆反應(yīng)。眾多的研究結(jié)果表明這個特殊的酶在細(xì)菌及綠色植物中也廣泛存在，并且認(rèn)為此酶同樣分布在胞質(zhì)中，在哺乳動物中還未見報道，因此一些研究人員提出與哺乳動物不同在植物中可能存在著一條依賴于 PFP 的糖酵解途徑(O’ Brien WE, Bowien S，Wood HG..Isolationand characterization of a pyrophosphate-dependent phosphofructokinase fromPropionibacterium shermani1.J.Biol.Chem..1975 ；250:8690-5.)。PFP 廣泛的存在于植物生物合成旺盛的組織，果糖-2，6-雙磷酸為PFP關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，但對植物PFP-1活性無影響，而在哺乳動物中果糖-2，6 -雙磷酸對PFP-1具有明顯的活化效應(yīng)(S t i 11，M.Fructose-2,6-bisphosphate as a regulatory molecule in plants.Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol..1990 ；41:153-158.)。這種植物與動物之間調(diào)節(jié)方式的差異意味著PFP在植物糖酵解途徑調(diào)節(jié)中占有重要的地位。磷酸果糖激酶主要有兩種，一個是依賴于ATP的(PFK)，一個是依賴PPi (PFP)的，但是有相同的磷酸果糖激酶的功能，區(qū)分主要是通過序列比對來區(qū)分的，PFK與PFP的序列不同。巴西橡膠樹是四大工業(yè)原料之一天然橡膠的主要來源，天然橡膠具有合成橡膠所不可比擬的綜合優(yōu)良特性，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值及應(yīng)用前景。糖酵解為橡膠樹的生命活動提供了部分能量，為其他代謝途徑提供中間產(chǎn)物(提供碳骨架)，同時又是有氧代謝的準(zhǔn)備階段(d' Auzac J, Jacob JL.Regulation of glycolysis in the latex of Heveabrasiliensis.J.Rubber Res.1nst.Malaya.1969 ；21:417.)。因此，糖酵解在橡膠樹生長發(fā)育及抵御生物與非生物脅迫中具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶，來源于大戟科橡膠樹屬的巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis),名稱為HbPFP-Ι,是如下I)或2)的蛋白質(zhì):1)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列I所示蛋白具有相同活性的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列I由487個氨基酸殘基組成。為了便于序列I編碼的HbPFP-1純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下I)或2)所示的蛋白質(zhì): 1)由序列表中的SEQID N0.1的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中的SEQID N0.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸果糖激酶功能的由SEQ ID Na:1衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于:所述蛋白質(zhì)為具有磷酸果糖激酶功能的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因的cDNA核苷酸序列如下1)、2)、3)或4)所示: 1)序列表中SEQID Na:2的核苷酸序列； 2)序列表中SEQID Ns:2自5'末端第221-1684位核苷酸所示的核苷酸序列； 3)在嚴(yán)格條件下可與I)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列； 4)與序列表中SEQID Na:2的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且編碼蛋白具有磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述 的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因的基因組基因的核苷酸序列如下1)、2)、或3)所示: 1)序列表中SEQID Na:3的核苷酸序列； 2)在嚴(yán)格條件下可與I)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列； 4)與序列表中SEQ ID Na:3的核苷酸序列具有90%以上的同源性的且編碼蛋白具有磷酸果糖激酶功能的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白及其編碼基因在培育能以甘露醇為唯一碳源培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因工程菌中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白及其編碼基因在培育能以甘露醇為碳源培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因工程菌中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述培育能以甘露醇為唯一碳源培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因菌株的方法或者培育能以甘露醇為碳源培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因工程菌的方法是將權(quán)利要求3、4或5所述的基因轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株中，篩選得到轉(zhuǎn)基因工程菌；所述出發(fā)菌株為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌磷酸果糖激酶缺陷株RL257 ;所述權(quán)利要求3、4或5所述的基因通過重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株中；所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求3、4或5所述的基因與PEASY-El連接獲得的重組表達(dá)載體。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白及其編碼基因在制備磷酸果糖激酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID№.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有依賴焦磷酸的磷酸果糖激酶的由SEQ ID№1衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灡砻?，該基因具有磷酸果糖激酶功能，該基因的cDNA轉(zhuǎn)入磷酸果糖激酶缺陷株RL257后獲得的轉(zhuǎn)基因菌株可以在以甘露醇為唯一碳源的M63基本培養(yǎng)基上正常生長。
文檔編號C12N1/21GK103146663SQ201310096439
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日
發(fā)明者龍翔宇, 唐朝榮, 戚繼艷, 陽江華, 方永軍, 秦云霞 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所