專利名稱：肌－肌醇單磷酸酶的功能表征的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肌-肌醇單磷酸酶2(IMPA2)的功能表征，IMPA2是在磷脂酰肌醇信號路徑中起作用的酶之一。特別地，本發(fā)明提供證據(jù)表明IMPA2與抑郁和焦慮引起的癥狀相關(guān)。
背景技術(shù)：
在磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)中，肌-肌醇單磷酸酶(IMPA)具有重要作用，其催化各種肌-肌醇單磷酸酯發(fā)生脫磷酸作用，釋放肌-肌醇(Berridge和Irvine，1989)。生物化學(xué)試驗表明鋰對IMPA酶起無競爭性的抑制作用，可能是通過結(jié)合并阻斷該酶的金屬結(jié)合位點。IMPA的還原活性會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離的肌-肌醇損耗，肌-肌醇用于再合成信號前體肌醇磷脂(Berridge等人，1989)。數(shù)十年來，在狂躁抑郁癥(兩極的)的治療中，鋰被用作穩(wěn)定情緒的試劑。但是，其穩(wěn)定情緒的分子機制還未被確定。鋰對IMPA活性的抑制作用及其抗兩極的作用出現(xiàn)在同一濃度范圍內(nèi)，并且對于鋰的穩(wěn)定情緒的作用來說，這種生物化學(xué)作用仍然是令人好奇的假設(shè)。
已經(jīng)有人提出，在編碼肌-肌醇單磷酸酶的基因中發(fā)生的改變(例如功能缺失或者產(chǎn)生功能突變)可能暗示在兩極紊亂中，神經(jīng)元活性發(fā)生擾亂，或者解釋所觀察到的鋰治療效率的變化(Steen等人，1996)。迄今，兩種人基因IMPA1和IMPA2已經(jīng)被克隆，并被預(yù)測編碼IMPA酶(McAllister等人，1992；Sjoholt等人，2000)。有趣的是，人IMPA2基因位于染色體18p11.2上，在數(shù)個連接試驗中，該區(qū)域被認(rèn)為是兩極紊亂的易感基因座。在B原淋巴細(xì)胞系的試驗中，提供了IMPA2可能與兩極相關(guān)的另一個證據(jù)，該細(xì)胞系來自I型兩極情感紊亂(BD-I)患者。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與健康雄性受試者相比，這些來自雄性BD-1患者的細(xì)胞具有顯著較低的IMPA2 mRNA水平，并且其細(xì)胞內(nèi)的基線鈣水平升高了(Yoon等人，2001)。
在探究該酶作為鋰在狂躁抑郁癥疾病中起穩(wěn)定情緒作用的靶點的可能作用中，采用了大量的傳統(tǒng)行為測試，對IMPA2敲除小鼠進行了表型分型。
本發(fā)明的結(jié)果表明，IMPA2敲除小鼠較少傾向于焦慮和抑郁引起的癥狀，并且指向了IMPA2在情感紊亂中的可能作用，特別是指向在存在于嚴(yán)重的情緒和焦慮紊亂中的神經(jīng)可塑性和細(xì)胞恢復(fù)力下降中所起的作用。
通過本發(fā)明將IMPA2功能性表征為與神經(jīng)元的可塑性相關(guān)的基因，提供了鑒定可用于神經(jīng)元細(xì)胞性能降低的患者的化合物的手段，以長期改變IMPA2的循環(huán)量(circuitery)，并功能性地對新的輸入響應(yīng)(學(xué)習(xí))，該化合物還可以用于治療神經(jīng)組織性能降低的患者，以通過再組織其功能來彌補由退行性紊亂引起的組織部分破壞或者功能喪失，從損傷中恢復(fù)。
發(fā)明概述第一個方面，本發(fā)明提供IMPA2酶在鑒定抗焦慮或抗抑郁的化合物的分析中的用途，其中所示抗焦慮或抗抑郁化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性。因此，在還有一個方面，本發(fā)明提供IMPA2酶在鑒定能夠增強哺乳動物的CNS中的神經(jīng)元可塑性的化合物的分析中的用途。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦慮或抗抑郁化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性，所述方法包括步驟a)提供一種包含IAMPA2蛋白的化合物；b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物為抗焦慮或抗抑郁化合物。
第二個方面，本發(fā)明提供一種用于確定一種化合物是否能夠增強神經(jīng)元可塑性的方法，所述方法包括步驟a)提供一種包含IAMPA2蛋白的化合物；b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物為增強神經(jīng)元可塑性的化合物。
第三個方面，本發(fā)明提供按照本發(fā)明的分析所鑒定的化合物的用途，用于制備治療焦慮的藥物或者用于制備提高神經(jīng)元可塑性的藥物，特別是用于制備增強記憶力或治療記憶功能障礙以及治療神經(jīng)元損傷的藥物，神經(jīng)元損傷是如下種類的中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷，包括(但是不限于)由攻擊、事故引起的損傷、腫瘤(例如影響大腦的大腦腫瘤或非腦部腫瘤，例如侵犯大腦的頭蓋骨的骨瘤)或者去除腫瘤或者治療癲癇癥的手術(shù)；多發(fā)性硬化癥；和影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(cerebellar-spinal adrenoleucodystrophy)、皮克病或威爾遜病。
第四個方面，本發(fā)明提供治療與神經(jīng)元適應(yīng)性反應(yīng)降低相關(guān)的癥狀的方法，例如治療記憶功能障礙，以及治療影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺營養(yǎng)失調(diào)白斑病、皮克病或威爾遜病，包括將有效量的IMPA2抑制劑施用給需要該治療的受試者的步驟。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療神經(jīng)學(xué)上的癥狀的方法，包括增強神經(jīng)元可塑性的治療，例如增強記憶力和學(xué)習(xí)能力，以及治療如下種類的神經(jīng)元損傷中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷，包括(但是不限于)由攻擊、事故引起的損傷、腫瘤(例如影響大腦的大腦腫瘤或非腦部腫瘤，例如侵犯大腦的頭蓋骨的骨瘤)或者去除腫瘤或者治療癲癇癥的手術(shù)；多發(fā)性硬化；和影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良皮克病或威爾遜病，包括將有效量的IMPA2抑制劑施用給需要該治療的受試者的步驟。
最后一個方面，本發(fā)明提供IMPA2敲除動物作為研究增強神經(jīng)元可塑性的作用的模型的用途。特別是在動物模型中，研究增強對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)的作用。在其他用途中，這種轉(zhuǎn)基因動物可以被銷售給研究人員。
在下文中，將更加詳細(xì)地討論本發(fā)明的這些和其他方面。
附圖簡介附

圖1載體VICTR48的示意圖，該載體用于從OST203987產(chǎn)生IMPA2敲除。
附圖2不同小鼠組織樣本中的IMPA1和IMPA2的表達(dá)水平。在歸一化為小鼠的β-肌動蛋白后，在不同小鼠組織樣本中的表達(dá)水平被表示為相對水平。
附圖3不同小鼠組織樣本中的IMPA1和IMPA2的表達(dá)水平。在不同小鼠的組織樣本中的表達(dá)水平被表示為平均循環(huán)閾(CT)值。
附圖4在升高的零迷宮(Elevated Zero Maze)測試中監(jiān)測的不同參數(shù)的結(jié)果，即總移動距離、在開放臂(open arm)中的相對持續(xù)時間和在開放臂中的相對距離。
附圖5在Porsolt強迫游泳測試的第一個段時間內(nèi)監(jiān)測的不同參數(shù)的結(jié)果，即在前180秒中的相對靜止不動的持續(xù)時間、在最后180秒中的相對靜止不動的持續(xù)時間和在整個測試過程中靜止不動的相對持續(xù)時間。
附圖6在Porsolt強迫游泳測試的第二個時段內(nèi)的結(jié)果。記錄了相同的參數(shù)。
附圖7在開闊場地測試(Open Field Test)中監(jiān)測的不同參數(shù)的結(jié)果，即在中央花費的時間、在中央的移動距離、總的移動距離、移動次數(shù)、移動持續(xù)的時間、直立活動(rearing)次數(shù)和直立活動的持續(xù)時間。
附圖8在非受脅迫和受脅迫的Impa2 KO小鼠和WT同窩小鼠中，MIP合成酶的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)基因型和脅迫對表達(dá)水平具有顯著的影響。表達(dá)水平在被歸一化為小鼠的β-肌動蛋白后被表示為相對水平。
附圖9在非受脅迫和受脅迫的Impa2 KO小鼠和WT同窩小鼠中，BDNF的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)了基因型和脅迫對表達(dá)水平具有顯著的作用。表達(dá)水平在被歸一化為小鼠的β-肌動蛋白后被表示為相對水平。
通過參考如下的實驗性詳細(xì)描述，將會更好地理解本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到，實驗性的詳細(xì)描述僅僅是示例性地說明在后面的權(quán)利要求書中所更加充分地描述的發(fā)明。另外，在整個申請中，引用了各種出版物。這些出版物的公開在此通過參考被結(jié)合到本申請中，以更加充分地描述與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。
發(fā)明詳述第一個發(fā)方面，本發(fā)明提供IMPA2酶在鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中抗焦慮或抗抑郁化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性。接著，在另一個方面，本發(fā)明提供IMPA2酶在用于鑒定能夠增強哺乳動物的CNS中的神經(jīng)元的可塑性的化合物的分析中的用途。在此所用的IMPA2蛋白或功能片段是指能夠水解肌-肌醇1-磷酸鹽的分離蛋白而生成肌醇和無機磷酸鹽的分離的蛋白。該蛋白質(zhì)優(yōu)選選自i.小鼠IMPA2(SEQ ID No4)、大鼠IMPA2(SEQ ID No6)、人IMPA2(SEQ ID No2)或其功能性片段，或者ii.編碼IMPA2蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的全長與人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，優(yōu)選至少90％序列同一性，更加優(yōu)選至少95％或最優(yōu)選至少98％序列同一性。
特別是編碼所述IMPA2蛋白的分離的多核苷酸在根據(jù)本發(fā)明的分析中的用途，其中所述IMPA2蛋白優(yōu)選選自i.編碼小鼠(EMBLBC011093-SFQ ID No3)、大鼠(EMBLAY160191-SEQ ID No5)或人(EMBLBC011093-SEQ ID No1)的IMPA2酶的多核苷酸；或ii.編碼蛋白IMPA2的多核苷酸序列，其中所述氨基酸序列的全長與編碼人IMPA2蛋白的多核苷酸(SEQ ID No1)具有至少80％序列同一性，優(yōu)選至少90％序列同一性，更加優(yōu)選至少95％或最優(yōu)選至少98％序列同一性。
如在此所用，“神經(jīng)元的可塑性”、“可塑性”、“神經(jīng)可塑性”等是指神經(jīng)系統(tǒng)改變和/或發(fā)展神經(jīng)元之間的連接以改變大腦或脊髓的功能的能力，通常對感覺或動作刺激或損害作出反應(yīng)。該術(shù)語包括神經(jīng)形成，在結(jié)構(gòu)上存在但無活性的突觸的活化，突觸的強化和消弱、突觸的生成和破壞。
存在許多神經(jīng)學(xué)癥狀，對這些癥狀中進行增強神經(jīng)元可塑性的治療正在研究中。例如，為了提高記憶力或治療記憶功能障礙，以及治療如下種類的神經(jīng)元損害中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷，包括(但是不限于)由攻擊、事故引起的損傷、腫瘤(例如影響大腦的大腦腫瘤或非腦部腫瘤，例如侵犯大腦的頭蓋骨的骨瘤)或者去除腫瘤或者治療癲癇癥的手術(shù)；多發(fā)性硬化；和影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(cerebellar-spinaladrenoleucodystrophy)、皮克病或威爾遜病。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦慮或抗抑郁化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性，所述方法包括步驟a)提供包含IMPA2蛋白的組合物；b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物為抗焦慮或抗抑郁化合物。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于確定一種化合物是否能夠增強神經(jīng)元可塑性的方法，所述方法包括步驟a)提供一種包含IAMPA2蛋白的化合物；b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物為增強神經(jīng)元可塑性的化合物。
包含IMPA2蛋白的組合物可以是表達(dá)按照本發(fā)明的IMPA2蛋白的細(xì)胞提取物、全細(xì)胞或者生物體。在特定的實施方案中，包含IMPA2蛋白的組合物由表達(dá)IMPA2的全細(xì)胞組成，更加特別是由表達(dá)IMPA2的CHO細(xì)胞組成。
典型地，進行從約1分鐘到約24小時的接觸，優(yōu)選從約2分鐘到約1小時的接觸，更加優(yōu)選接觸約1小時。
在這些分析中，通過測量水解肌-肌醇1-磷酸鹽生成肌醇和無機磷酸鹽來評價IMPA2蛋白活性，特別是通過測量放射標(biāo)記的肌醇形式的肌-肌醇單磷酸鹽產(chǎn)物或者放射標(biāo)記的32Pi形式的無機磷酸鹽(Pi)的積累或者在比色分析中來評價IMPA2蛋白活性。例如，可以如Ragan(1988)Biochem.J.249143-148，或者Vadnal(1995)Neuropsychopharmacol.12277-285所述，進行基于比色手段的Pi釋放分析來測量Pi濃度隨時間的變化。
如上文的Vadnal(1995)中所述，反應(yīng)混合物含有0.05ml的120mM Tris-HCI，pH 7.8；0.05ml的18mM或3mM氯化鎂；0.05ml的4.2mM D-肌-肌醇1-磷酸鹽，單獨的0.125ml水或者具有陽性對照或者推定的調(diào)節(jié)劑測試化合物或組合物。各種含量的已知肌-肌醇單磷酸酶抑制劑(拮抗劑)作為對照，例如鋰、卡巴咪嗪和/或丙戊酸。加入0.025ml的肌-肌醇單磷酸酶(例如人IMPA2)溶液，將反應(yīng)混合物在37℃下溫育約15分鐘到1小時。加入0.05ml的20％三氯乙酸(TCA)來終止反應(yīng)。離心上清液，用0.10ml上清液來估計釋放的Pi，采用孔雀綠試劑方法，如Eisenberg(1987)Methods Enzymol.141127-143所描述。用Lowry(1951)J.Biol Chem.193265-275的方法來分析蛋白。
通常重復(fù)分析三次?？商娲?，如上面的Ragan(1988)所述，反應(yīng)混合物的最終體積為0.300ml，含有0.1mM底物、250mM氯化鉀、50mM TrisHCL，pH 8.0，和3mM氯化鎂，反應(yīng)時間為15分鐘到1小時。采用Itaya(1966)Clin.Chem.Ac ta 14361-366的方法通過比色測量所釋放的Pi(還可以參見Kodaina(1986)″The initialphosphate burst in ATP hydrolysis by myosin and subfragment-1as studied by a modified malachite green method fordetermination of inorganic phosphate，″J Biochem.(東京)991465-1472)。肌-肌醇單磷酸酶的特定活性被表示為每分鐘(mU)每毫克蛋白所釋放的磷酸根的納摩爾數(shù)。
還可以通過采用例如Atack(1993)J.Neurochem.60652-658；或者Ragan(1988)同上文所述的分析方法，在體外和體內(nèi)測量底物肌-肌醇單磷酸鹽(肌-肌醇I-磷酸鹽)的積累，確定本發(fā)明的IMPA2蛋白的可能調(diào)節(jié)物的動力學(xué)活性，并進行評價。例如，如Atack(1993)同上文所述，存在推定的肌-肌醇單磷酸酶拮抗劑時，測量在表達(dá)IMPA2蛋白的組織培養(yǎng)細(xì)胞中的放射標(biāo)記的肌醇單磷酸鹽的積累。如下文所述，通過遺傳操作組織培養(yǎng)細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明的IMPA2蛋白或其片段或變體。
例如，如上所述，可以操作CHO細(xì)胞來表達(dá)數(shù)量巨大的異源蛋白。特別地，為了評價推定的拮抗劑或激動劑對體內(nèi)的肌-肌醇單磷酸酶的作用，首先用3H-肌醇標(biāo)記CHO細(xì)胞。預(yù)先標(biāo)記包括培養(yǎng)細(xì)胞，以便在含有放射標(biāo)記的肌醇(例如，14C-肌醇或3H-肌醇)的培養(yǎng)基中匯合兩天。如果采用3H-肌醇，則使用0.5uCi/mI 80Ci/mmol(AmershamInternational)。試驗當(dāng)天，在含有0.5uCi/mI3H-肌醇的Krebs-Henselcit緩沖液中收集細(xì)胞，濃度為2×106細(xì)胞/ml。
在存在10ul各種濃度的已知酶抑制劑和測試化合物-推定的酶調(diào)節(jié)物時，將所收集的細(xì)胞的等分試樣在37℃的搖動水浴中培養(yǎng)1小時。加入300ul的1.0M TCA來終止反應(yīng)，并離心。用水飽和的二乙醚洗滌500ul上清液。用1M Tris調(diào)節(jié)pH到約7.0。然后，將上清液加載到Dowex柱中。用5ml水洗滌柱4次，以洗脫3H-肌醇；然后用5ml的25mM甲酸胺洗滌3次，以洗脫β-甘油磷酸。用10ml的200mM磷酸胺洗滌柱，收集3H-肌醇1-單磷酸鹽，在閃爍計數(shù)器上進行計數(shù)。
可替代地，如Ragan(1988)同上文所述，采用14C-肌醇。抑制肌-肌醇單磷酸酶會導(dǎo)致底物肌-肌醇單磷酸鹽(肌-肌醇1-磷酸鹽)的水平升高，而激活該酶會導(dǎo)致底物水平下降和產(chǎn)物(肌醇和無機磷酸鹽)的水平升高。
采用這些分析及其變化形式，可以采用已知方法(例如，Lineweaver-Burke plots，如被Lee(1996)Xenobiotica 268′)1-83)8采用)，可以在有和無測試調(diào)節(jié)劑(例如，競爭性或非競爭性的拮抗劑)時分析IMPA2酶的動方學(xué)；對于酶動力學(xué)的討論通?？梢詤⒁娎纾琒uarez(1997)Proc.Nad.Acad.Sci.USA 947065-7069；Northrop(1997)Bioorg.Med Chem.5641-644)；Sterrer(1997)J.Recept.Signal Transduct.Res.17511-520)。
因此，本發(fā)明的目的是提供組織培養(yǎng)細(xì)胞如CHO細(xì)胞或HEK293細(xì)胞在按照本發(fā)明的分析中的用途，細(xì)胞通常被遺傳操作來表達(dá)IMPA2。適合實施按照本發(fā)明的分析的細(xì)胞優(yōu)選為來源于多細(xì)胞生物體的高等真核細(xì)胞，有利地為哺乳動物細(xì)胞。細(xì)胞可以用本領(lǐng)域可獲得的任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)化。許多技術(shù)如磷酸鈣沉淀和電穿孔被描述在Sambrook等，(1989)Molecular BiologyA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor中，其在此引入作為參考。
在另一個方面，本發(fā)明提供使用按照本發(fā)明的分析所確定的化合物的用途，用于制備用于治療焦慮的藥劑或者用于制備提高神經(jīng)元可塑性的藥劑，特別是用于制備增強記憶力或治療記憶功能障礙，以及治療神經(jīng)元損傷的藥劑，神經(jīng)元損傷是如下種類的中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷，包括(但是不限于)由攻擊、事故引起的損傷、腫瘤(例如影響大腦的大腦腫瘤或非腦部腫瘤，例如侵犯大腦的頭蓋骨的骨瘤)或者去除腫瘤或者治療癲癇癥的手術(shù)；多發(fā)性硬化；和影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺營養(yǎng)失調(diào)白斑病、皮克病或威爾遜病。
在本領(lǐng)域，用于制備藥物組合物的方法和藥物載體是已知的，列舉在教科書如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Williams & Wilkins，Pensylvania，USA中。
本發(fā)明的化合物和組合物可以通過任何合適的路徑來施用，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易為所治療的癥狀確定最合適的路徑和劑量。劑量可以由從業(yè)醫(yī)師或者獸醫(yī)來確定，取決于所治療的癥狀的狀態(tài)和性質(zhì)、所治療的受試者的年齡和基本健康狀況、施用路徑和可能已經(jīng)給予的任何在先治療。采用本發(fā)明的分析被鑒定為抗焦慮的化合物或者神經(jīng)可塑性增強化合物的化合物可選擇地與一種或多種藥學(xué)活性試劑一起施用，該活性試劑適合治療癥狀，即化合物可以與一種或多種這種試劑一起給予，或者在一種或多種試劑之前或之后給予。例如，當(dāng)該癥狀涉及阿爾茨海默病時，該化合物與另一種試劑治療一起使用，試劑例如是乙酰膽堿脂酶活性位點抑制劑，例如膽堿酯酶抑制劑、加蘭他敏(galantamine)或tracine。
載體或稀釋劑和其他的賦形劑將取決于施用路徑，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定用于各種特定情況的最適合的劑型。本發(fā)明的化合物可以經(jīng)口腔、體表或胃腸外，以含有常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和運載體的劑量單位制劑形式施用。在此所用的胃腸外包括皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、膜內(nèi)的、頭顱內(nèi)的注射或灌注技術(shù)。特別感興趣的是，穿過血腦屏障將化合物施用到CNS中。優(yōu)選的施用路徑是直接施用到CNS中，例如通過插管(canulla)灌注或注射。這種施用將直接進入到損傷部位，進入鄰近組織或者進入腦脊髓液。
本發(fā)明包括用于改善疾病的各種藥物組合物。使用載體、賦形劑和添加劑或者佐劑，將本發(fā)明的組合物和任選的一種或多種其他藥學(xué)上有活性的試劑，或者本發(fā)明的化合物和一種或多種其他藥學(xué)上有活性的試劑的組合制備成適合施用給受試者的形式，來制備按照本發(fā)明的一個實施方案的藥物組合物。
經(jīng)常使用的載體和佐劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇和其他糖、滑石粉、牛乳蛋白質(zhì)、白明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動植物油、聚乙二醇和溶劑，例如無菌水、酒精、甘油和多元醇。靜脈內(nèi)運載體包括液體和營養(yǎng)補充物。防腐劑包括抗生素、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。其他藥學(xué)上可接受的載體包括水溶液、無毒性的賦形劑，包括鹽水、防腐劑、緩沖液等，如Remington′sPharmaceutical Sciences，第20版。Williams & Wilkins(2000)和The British National Formulary第43版(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of GreatBritain，2002；http//bnf.rhn.net)所描述，其內(nèi)容在此引入作為參考。藥物組合物的pH和各種組成的精確濃度按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來調(diào)整。參見Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basisfor Therapeutics(第7版，1985)。
優(yōu)選以劑量單位形式來制備和施用藥物組合物。固體劑量單位包括片劑、膠囊和栓劑。對于受試者的治療，根據(jù)化合物的活性、施用方式、紊亂的性質(zhì)和嚴(yán)重性、受試者的年齡和體重，可以采用不同的日劑量。但是，在特定條件下，較高或較低的日劑量是合適的。日劑量的施用可以通過以單個劑量單位或者數(shù)個較小劑量單位的單次施用來進行，或者在特定間隔時間內(nèi)多次施用細(xì)分的劑量。
用于該說明目的，應(yīng)當(dāng)清楚理解，措辭“包含(comprising)”是指“包括但是不限于”，而措辭“包含(comprises)”具有相應(yīng)的含義。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療與神經(jīng)元適應(yīng)性反應(yīng)降低相關(guān)的癥狀的方法，例如治療記憶功能障礙以及治療影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺營養(yǎng)失調(diào)白斑病、皮克病或威爾遜病的方法，包括將有效量的IMPA2抑制劑施用給需要該治療的受試者的步驟。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療神經(jīng)學(xué)上的癥狀的方法，包括增強神經(jīng)元可塑性的治療，例如增強記憶力和學(xué)習(xí)能力以及治療如下種類的神經(jīng)元損傷中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷，包括(但是不限于)由攻擊、事故引起的損傷、腫瘤(例如影響大腦的大腦腫瘤或非腦部腫瘤，例如侵犯大腦的頭蓋骨的骨瘤)或者去除腫瘤的手術(shù)或者治療癲癇癥；多發(fā)性硬化；和影響皮層的神經(jīng)退行性疾病，例如老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺營養(yǎng)失調(diào)白斑病、皮克病或威爾遜病，包括將有效量的IMPA2抑制劑施用給需要該治療的受試者的步驟。
通常，術(shù)語“治療(treating)”、“治療(treatment)”等，在此用于指作用于受試者、組織或細(xì)胞，以獲得期望的藥學(xué)上的和/或生理上的效果。該效果可以是預(yù)防性的、完全或部分地預(yù)防疾病或其征候或癥狀和/或是治療性的、部分或完全地治愈疾病。如在此所用的“治療”包括任何的治療或預(yù)防脊椎動物、哺乳動物特別是人中的疾病，包括預(yù)防疾病在受試者中發(fā)生，該受試者易患該疾病但是還未被診斷患有該疾病，抑制該疾病，即阻止疾病發(fā)展；或者減輕或改善疾病的作用，即使疾病作用消退。
如在此所用，術(shù)語“有效量”是指本發(fā)明的化合物的含量，其足以產(chǎn)生期望的治療性反應(yīng)，例如預(yù)防或治療疾病，該疾病容易(suspectible to)通過施用包含本發(fā)明的化合物作為活性成分的藥物組合物來治療。特定的“治療有效量”可以由從業(yè)醫(yī)師或獸醫(yī)確定，必將隨著如所治療的特定癥狀、受試者的生理條件和臨床史、所治療的動物類型、治療持續(xù)時間、協(xié)同治療(如果有)的性質(zhì)和所使用的特定劑型的因素而變化。
在此還描述了非人的動物和細(xì)胞，其含有至少一種被整合的打靶構(gòu)建體，該構(gòu)建體功能性地破壞所述非人的動物或細(xì)胞的內(nèi)源性IMPA2基因的基因座，典型地通過缺失或突變有效地功能性表達(dá)IMPA2基因產(chǎn)物所需的遺傳元件，例如外顯子序列、剪接信號、啟動子增強子。在該實施方案中，打靶構(gòu)建體的一部分整合到內(nèi)源性IMPA2基因的基因座的基本結(jié)構(gòu)或調(diào)控元件中，從而功能性地破壞該元件，產(chǎn)生無效的等位基因。典型地，雖然可以采用其他策略，但是通過將編碼可選擇的標(biāo)記的非同源序列(例如neo基因表達(dá)盒)整合到IMPA2基因的基本結(jié)構(gòu)和/或調(diào)控序列中，通過使打靶構(gòu)建體的同源夾子(homologyclamp)與內(nèi)源性IMPA2基因序列發(fā)生同源重組，來產(chǎn)生無效的等位基因。
最通常，通過電穿孔或微注射將打靶構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到全能胚胎干(ES)細(xì)胞系，例如鼠AB-1或CCE細(xì)胞系中。在IMPA2基因的基因座上或側(cè)面，打靶構(gòu)建體與內(nèi)源性序列同源重組，功能性地破壞IMPA2基因的至少一個等位基因。典型地，打靶構(gòu)建體與內(nèi)源性IMPA2基因座序列同源重組，導(dǎo)致編碼和表達(dá)可選擇標(biāo)記的非同源序列的整合，例如neo非同源序列通常為陽性選擇表達(dá)盒的形式。被功能性破壞的等位基因被稱作為IMPA2無效的等位基因。在培養(yǎng)基中繁殖細(xì)胞，選擇具有至少一種IMPA2無效等位基因的ES細(xì)胞，該培養(yǎng)基允許優(yōu)先繁殖表達(dá)可選擇標(biāo)記的細(xì)胞。通過PCR分析和/或Southern印跡分析，檢查所選擇的ES細(xì)胞，證實存在正確打靶的IMPA2等位基因。繁育與無效等位基因異源的非人動物，生成與所述無效等位基因同源的非人動物，即所謂的“敲除”動物(Donehower等，(1992)Nature 256215；Science2561392，在此引入作為參考)?？商娲?，通過在含有高水平選擇試劑(例如，G418或潮霉素)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，來生產(chǎn)對于無效的等位基因來說是純合子的ES細(xì)胞，該等位基因具有整合的可選擇標(biāo)記。采用PCR分析和/或Southern印跡分析從所選擇的ES細(xì)胞克隆和/或尾巴活組織檢查分離的DNA，來證實正確打靶的無效等位基因的雜合性和/或純合性。
已經(jīng)被描述了數(shù)種基因打靶技術(shù)，包括但是不限于共同電穿孔，“一打即跑(hit-and-run)”，單交換整合和雙交換重組(Bradley等，(1992)Bio/Technology 10534)。本發(fā)明基本上可以采用本領(lǐng)域知曉的任何IMPA2可用的同源基因打靶策略來實施。打靶構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)取決于所選擇的特定打靶技術(shù)。例如，用于單交換整合或“一打即跑”的打靶構(gòu)建體僅需要連接到靶向區(qū)域上的單一同源片段，而雙交換替換類型的打靶構(gòu)建體需要兩個同源片段，與置換區(qū)域的兩側(cè)連接。
例如，而不是限制，優(yōu)選的實施方案是打靶構(gòu)建體，包括，按順序(1)具有基本上與內(nèi)源性IMPA2基因外顯子上游(即，在與外顯子的翻譯閱讀框相反方向上)的約3kb內(nèi)的序列相同的第一個同源片段，(2)替換區(qū)，包含驅(qū)動neo基因轉(zhuǎn)錄的pgk啟動子的陽性選擇表達(dá)盒，(3)具有基本上與所述內(nèi)源性IMPA2基因外顯子下游的約3kb內(nèi)的序列相同的第二個同源片段，和(4)陰性選擇表達(dá)盒，包含驅(qū)動HSV tk基因轉(zhuǎn)錄的HSV啟動子。這種打靶構(gòu)建體適合雙交換替換重組，該重組缺失了跨越所述外顯子的內(nèi)源性IMPA2基因座的一部分，并且用具有陽性選擇表達(dá)盒的置換區(qū)來替換它。如果被缺失的外顯子對于功能性IMPA2基因產(chǎn)物的表達(dá)是必需的，則所生成的外顯子缺失的等位基因被功能性地破壞，并且被稱作為無效的等位基因。
本發(fā)明的打靶構(gòu)建體包括至少一個IMPA2同源夾子，它以多核苷酸鍵(即通過磷酸二酯鍵)的形式連接到靶向區(qū)域上。同源夾子具有一條序列，該序列基本上與非人宿主動物的內(nèi)源性IMPA2基因序列相對應(yīng)或互補，并且可能包含IMPA2基因兩側(cè)的序列。
雖然，在本領(lǐng)域中，最終未確定用于基因打靶的重組同源性的最低或最高的大小界線，一般認(rèn)為，同源片段的最佳模式在約50kb到數(shù)萬kb的范圍內(nèi)。因此，打靶構(gòu)建體通常至少為約50-100個核苷酸，優(yōu)選至少為約250-500個核苷酸，更加優(yōu)選至少為約1000-2000個核苷酸，或者更長。構(gòu)建體同源區(qū)(同源片段)通常至少為約50-100個堿基，優(yōu)選至少為約100-500個堿基，更加優(yōu)選至少為約750-2000個堿基。一般認(rèn)為，長度為約7-8kb的同源區(qū)是優(yōu)選的，在一個優(yōu)選的實施方案中，具有在置換區(qū)一側(cè)的側(cè)面的約7kb的第一個同源區(qū)和在置換區(qū)另一側(cè)的側(cè)面的約1kb的第二個同源區(qū)。
根據(jù)內(nèi)源性IMPA2基因靶向序列的序列組成和復(fù)雜性，以及本領(lǐng)域提供的教導(dǎo)(Hasty等，(1991)Mol.Cell.Biol.115586；Shulman等，(1990)Mol.Cell.Biol.104466)，從業(yè)人員進行判斷，會選擇同源區(qū)的同源(即基本上相同)長度。打靶構(gòu)建體具有至少一個同源區(qū)，該同源區(qū)具有與內(nèi)源性IMPA2基因序列基本上相對應(yīng)或者基本上互補的序列(例如，外顯子序列、增強子、啟動子、內(nèi)含子序列或者在IMPA2基因的約3-20kb內(nèi)的側(cè)翼序列)。這種靶向轉(zhuǎn)基因同源區(qū)作為與基本上相同的內(nèi)源性IMPA2基因序列同源配對和重組的模板。在打靶構(gòu)建體中，這種同源區(qū)典型地在置換區(qū)的側(cè)面，置換區(qū)是打靶構(gòu)建體的一個區(qū)域，它將要與被打靶的內(nèi)源性IMPA2基因序列發(fā)生置換(Berinstein等，(1992)Mol.Cell.Biol.12360)。因此，兩側(cè)是同源區(qū)的打靶構(gòu)建體的一個區(qū)段可以通過雙交換同源重組而置換內(nèi)源性IMPA2基因序列的一個區(qū)段。同源區(qū)與靶向區(qū)以傳統(tǒng)的線性多核苷酸鍵(5′到3′磷酸二酯骨架)方式連接在一起。打靶構(gòu)建體通常是雙鏈DNA分子，最通常是線性的。
不愿受同源重組或者基因轉(zhuǎn)換的任何特定理論的約束，一般認(rèn)為，在這種雙交換置換重組中，第一個打靶構(gòu)建體同源區(qū)和第一個內(nèi)源性IMPA2基因序列之間的第一個同源重組(例如，鏈交換、鏈配對、鏈分離、鏈連接)是通過第二個靶向結(jié)構(gòu)域同源區(qū)與第二個內(nèi)源性IMPA2基因序列之間的第二個同源重組來實現(xiàn)的，從而產(chǎn)生位于兩個同源區(qū)之間的打靶構(gòu)建體的一部分，替換了位于第一個和第二個內(nèi)源性IMPA2基因序列之間的內(nèi)源性IMPA2基因的部分。因此，同源區(qū)通常用于相同方向(即，對于轉(zhuǎn)基因的各個同源區(qū)來說，上游方向相同，以避免發(fā)生重排)。因此，用雙交換置換重組來缺失內(nèi)源性IMPA2基因的一部分，伴隨著將非同源部分(例如，neo基因表達(dá)盒)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的染色體位點上。還可以用雙交換重組來將非同源部分(nortion)添加到內(nèi)源性IMPA2基因中，而不缺失內(nèi)源性染色體部分。但是，還可以僅用雙交換重組來缺失內(nèi)源性IMPA2基因序列的一部分，而不將非同源的部分轉(zhuǎn)移到內(nèi)源性IMPA2基因中(參見，Jasin等，(1988)Genes Devel.21353)。非同源部分的上游和/或下游可以是一種基因，該基因提供用于確定雙交換重組是否發(fā)生；這種基因典型地是HSV tk基因，該基因用于陰性選擇。
典型地，本發(fā)明的打靶構(gòu)建體用于功能性地破壞內(nèi)源性IMPA2基因，包含至少兩個通過非同源的序列分開的同源區(qū)，非同源序列含有編碼可選擇標(biāo)記如neo的表達(dá)盒(Smith和Berg(1984)Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.49171；Sedivy和Sharp(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86227；Thomas和Capecchi(1987)op.cit.)。但是，一些本發(fā)明的打靶構(gòu)建體可以僅在非同源序列一側(cè)的側(cè)翼具有同源區(qū)。本發(fā)明的打靶轉(zhuǎn)基因可以是在本領(lǐng)域被稱作為“一打即跑”或者“一進就出”的轉(zhuǎn)基因類型的(Valancius和Smithies(1991)Mol.Cell.Biol.111402；Donehower等，(1992)Nature356215；(1991)J.NIH Res.359；在此引入作為參考)。
陽性選擇表達(dá)盒編碼一種可選擇標(biāo)記，該標(biāo)記提供用于選擇整合了跨越陽性選擇表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因序列的細(xì)胞的手段。陰性選擇表達(dá)盒編碼一種可選擇標(biāo)記，該標(biāo)記提供用于選擇不具有陰性選擇表達(dá)盒的整合拷貝的細(xì)胞的手段。因此，通過將陽性-陰性選擇方法結(jié)合起來，有可能通過選擇陽性標(biāo)記的存在和陰性標(biāo)記的缺乏，來選擇已經(jīng)發(fā)生了同源置換的重組并且將同源區(qū)之間的轉(zhuǎn)基因部分(即置換區(qū))摻入到染色體位置上的細(xì)胞。包含在本發(fā)明的打靶構(gòu)建體中的優(yōu)選的表達(dá)盒編碼和表達(dá)可選擇的抗藥性標(biāo)記和/或HSV胸苷激酶。合適的抗藥性基因包括，例如gpt(黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)，其可以用霉酚酸進行篩選；neo(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，其可以用G418或潮霉素進行選擇；和DFHR(二氫葉酸還原酶)，其可以用氨甲蝶呤選擇(Mulligan和Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782072；Southern和Berg(1982)J.Mol.IMPA21.Genet.1327；其在此引入作為參考)。
篩選正確打靶的重組體通常至少采用陽性選擇，其中非同源的表達(dá)盒編碼和表達(dá)功能性的蛋白(例如，neo或者gpt)，該蛋白賦予具有內(nèi)源性整合的表達(dá)盒的靶向細(xì)胞以一種可選擇的表型，因此，通過添加選擇試劑(例如，G418或霉酚酸)，這種被打靶的細(xì)胞具有超過不具有整合的表達(dá)盒的細(xì)胞的生長或存活優(yōu)勢。優(yōu)選地，篩選正確打靶的同源重組體還采用陰性選擇，使得淘汰掉僅具有非同源的轉(zhuǎn)基因整合的細(xì)胞。典型地，這種陰性選擇采用編碼單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的表達(dá)盒，該基因位于轉(zhuǎn)基因中，使得僅通過非同源重組來整合。這種布置通常通過將HSV tk表達(dá)盒(或者其他陰性選擇表達(dá)盒)連接到引起重組的同源區(qū)的末端上來實現(xiàn)，使得同源區(qū)的雙交換置換重組將陽性選擇表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到染色體位置上，而不會將基因(或者其他陰性選擇表達(dá)盒)轉(zhuǎn)移到染色體位置上。核苷酸類似物9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]-鳥嘌呤優(yōu)先對表達(dá)HSV tk的細(xì)胞產(chǎn)生毒性，它在選擇不具有整合HSV tk的表達(dá)盒的細(xì)胞時被用作陰性選擇試劑。FIAU也可以被用作選擇試劑來選擇缺乏HSV tk的細(xì)胞。
為了降低具有不正確整合的打靶構(gòu)建體序列的細(xì)胞的背景，通常采用組合陽性-陰性選擇的方案(Mansour等，(1988)op.cit.，在此引入作為參考)。
通常，本發(fā)明的打靶構(gòu)建體優(yōu)選包括(1)兩側(cè)是兩個同源區(qū)的陽性選擇表達(dá)盒，這兩個同源區(qū)與宿主細(xì)胞的內(nèi)源性IMPA2基因序列基本上相同，和(2)末端的陰性選擇表達(dá)盒。但是，還可以使用僅包括陽性選擇表達(dá)盒的打靶構(gòu)建體。典型地，打靶構(gòu)建體含有陽性選擇表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括連接到啟動子下游的neo基因(即，在翻譯閱讀框方向朝向所編碼的多肽的羧基末端)，該啟動子例如是HSV tk啟動子或者pgk啟動子。更典型地，打靶構(gòu)建體還含有陰性選擇表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括連接到HSV tk啟動子下游的HSV tk基因。
優(yōu)選地，本發(fā)明的打靶構(gòu)建體具有同源區(qū)，該同源區(qū)與預(yù)先確定的靶點內(nèi)源性DNA序列高度同源，優(yōu)選是同基因的(即相同的序列)。通過基因組克隆或者高保真PCR擴增基因組DNA，從非人動物的系中獲得同基因的序列或幾乎同基因的序列，該非人動物是用于基因打靶程序的ES細(xì)胞的來源。
含有打靶構(gòu)建體的載體典型地在大腸桿菌中生長，然后用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法來分離，或者被合成為寡核苷酸。還可以進行不需要原核載體或真核載體的定向打靶滅活。通過任何合適的技術(shù)，其中包括微注射、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、生物導(dǎo)彈術(shù)、磷酸鈣沉淀和病毒載體，將打靶轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的其他方法包括使用Polybrene、原生質(zhì)體融合和其他方法(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其在此引入作為參考)。
因此，本發(fā)明的另一個目的是提供IMPA2敲除的動物作為神經(jīng)可塑性模型的用途，特別是用于研究增強神經(jīng)元可塑性的作用。特別是在動物模型中研究增強對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)的作用。在其他用途中，這種轉(zhuǎn)基因動物被銷售給研究人員?！扒贸齽游铩被蛘摺稗D(zhuǎn)基因動物”用于此是指非人類的動物，通常為哺乳動物，特別是嚙齒類動物小鼠，具有20種非內(nèi)源的(即異源的)核酸序列，在細(xì)胞的一部分中作為染色體外元件存在，或者被穩(wěn)定地整合到其種系DNA中。采用本領(lǐng)域已知的方法，通過遺傳操作，例如宿主動物的胚胎或胚胎干細(xì)胞的遺傳操作，將該異源核酸導(dǎo)入所述轉(zhuǎn)基因動物的種系中。
本發(fā)明的這些和其他的方面將在下文中被更加詳細(xì)地討論。
實驗材料和方法IMPA2敲除小鼠IMPA2敲除小鼠從Lexicon Genetics Inc.獲得，它是從OST203987產(chǎn)生的。用載體VICTR48建立基因陷阱(gene-trap)，在內(nèi)含子1中發(fā)生插入(附圖1)。
IMPA1和IMPA2的實時定量反轉(zhuǎn)錄(RTQ)PCR分析從野生型小鼠上切取不同組織(大腦、肝臟、脊髓、胃、腎臟、脾臟、大腸、肺、心臟食管、胰腺、回腸)，從這些組織中分離總RNA，用實時定量PCR分析總RNA，分析IMPA1和IMPA2的組織分布。
采用隨機六聚體引物和Superscript II RT(Invitrogen LifeTechnologies)，用1μg總RNA進行第一鏈cDNA合成。采用Taqman PCR試劑盒，在ABIPrism 7000熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)上進行定量PCR。連續(xù)稀釋cDNA來產(chǎn)生閾值循環(huán)(treshold cycle)與β-肌動蛋白濃度的對數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。RTQ特異引物對和探針被列舉在下文中。
●小鼠IMPA2篩選 RTQ引物和探針I(yè)MPA2_FW 5′-GAG GTG GCC GTG CAG TTG-3′(SEQ ID No.7)IMPA2_REV 5′-AGA CGC GTT TTT CCT CTG TCA-3′(SEQ ID No.8)IMPA2_探針 5′-CCT GAT GAT TTG TCC CGC ACG CA-3′[5′FAM][3′TAMRA](SEQ ID No.9)●小鼠IMPA1篩選 RTQ引物和探針I(yè)MPA1_FW 5′-AGC TGT TTC AAT TGG CTT CCT T-3′(SEQ IDNo.10)IMPA1_REV 5′-GCC GGT GTA CAT CTT ATC TTC CA-3′(SEQ IDNo.11)IMPA1_探針 5′-TGA ATA AAG AGA TGG AGT TTG GAA TTG TGT ACAGCT-3′[5′FAM][3′TAMRA](SEQID No.12)重復(fù)實驗樣本三次，僅顯示符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。在歸一化為小鼠β-肌動蛋白后，將不同小鼠組織中的表達(dá)水平表示為相對水平(附圖2)，并且表示為平均CT值(附圖3)。
表型分析小鼠行為測試對由10只野生型(+/+)、12只雜合的(+/-)和11只純合的(-/-)IMPA2小鼠，雄性和雌性的混合組成的組進行三種行為測試升高的零迷宮測試(本領(lǐng)域已知的評價與焦慮相關(guān)的行為的方法)，Porsolt強迫游泳測試(本領(lǐng)域已知的評價與抑郁相關(guān)的行為的方法)和開闊場地測試(本領(lǐng)域已知的評價運動活性的方法)。
升高的零迷宮測試在正常的光照/黑暗循環(huán)的黑暗階段，進行升高的零迷宮測試。在升高的零迷宮測試中，每只小鼠接受6分鐘的測試時段。在該時段，記錄如下參數(shù)總移動距離，在開放臂中的相對距離和在開放臂中的相對持續(xù)時間(附圖4)。使用未校準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗用于所獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析(表1)。
表1對于從升高的零迷宮測試從IMPA2小鼠獲得的數(shù)據(jù)用未校準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗檢驗數(shù)據(jù)而得到的描述性的統(tǒng)計學(xué)和P值。
Porsolt強迫游泳測試Porsolt強迫游泳測試進行了2天。第一天，讓IMPA2小鼠游泳10分鐘，對前6分鐘進行記錄。24小時后，讓同一小鼠進行第二次游泳，進行6分鐘，并對該6分鐘進行記錄。將每個記錄時期分為兩個分開的時間段0→180秒和180→360秒。在正常光照/黑暗循環(huán)的光照階段進行Porsolt強迫游泳測試。在這兩個時段中記錄如下參數(shù)在第一個180秒鐘內(nèi)的靜止不動持續(xù)時間和在后一個180秒鐘內(nèi)的靜止不動持續(xù)時間(圖5和6)。用未標(biāo)準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗對所獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(表2和3)。
表2對來自第一天的IMPA2小鼠的強迫游泳測試的數(shù)據(jù)用未校準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗而得到的描述性的統(tǒng)計學(xué)和P值。
表3對來自第二天的IMPA2小鼠的強迫游泳測試的數(shù)據(jù)用未校準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗而得到的描述性的統(tǒng)計學(xué)和P值。
開闊場地測試在正常的光照/黑暗循環(huán)的光照階段進行開闊場地測試。在自動開闊場地系統(tǒng)中，讓每只小鼠進行30分鐘的測試時段。記錄在水平的和垂直的方格上的運動。在該時段中，記錄如下參數(shù)在中央的停留時間、在中央的移動距離、總移動距離、移動次數(shù)、移動持續(xù)時間、直立活動的次數(shù)和直立活動的持續(xù)時間(附圖7)。采用未校準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗，用于對所獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析(表4)。
表4對來自IMPA2小鼠的開闊場地測試的數(shù)據(jù)采用未標(biāo)準(zhǔn)的Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分試驗而獲得的描述性的統(tǒng)計學(xué)和P值。
表4(續(xù))
相對于溫和脅迫的Impa2 KO小鼠和野生型同窩小鼠，針對未受脅迫的小鼠中的MIP合成酶和BDNF進行的實時定量反轉(zhuǎn)錄(RTQ)PCR分析。
連續(xù)7天，對Impa2 KO小鼠和WT同窩小鼠進行受限性脅迫。第一天，脅迫小鼠6小時。第二天到第七天，每天脅迫小鼠1小時。第八天，斷頸處死小鼠，取出大腦，小心解剖出海馬。WT和KO小鼠未接受刺激，作為對照。從海馬中分離總RNA。如“IMPA1和IMPA2的實時定量反轉(zhuǎn)錄(RTQ)PCR分析”章節(jié)中所述進行RTQ PCR。RTQ特異性引物對和探針被列舉在下文中。
MIP合酶_FW 5′-CTGCGCCTTCCTCAATGG-3′(SEQ ID No.13)MIP合酶_REV 5′-GCTGCGAAGCCAGTTCCA-3′(SEQ ID No.14)MIP合酶_探針 5′-TCCCCACAGAACACACTGGTACCCG[5′]6_FAM[3′]TAMRA(SEQ ID No.15)BDNF_FW 5′-CGGGACGGTCACAGTCCTA-3′(SEQ ID No.16)BDNF_REV 5′-CACTTGGTCTCGTAGAAATACTGCTT-3′(SEQ IDNo.17)BDNF_探針5′-AGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAAC[5′]FAM[3′]TAMRA(SEQ ID No.18)用雙因子方差分析來分析所獲得的數(shù)據(jù)，接著進行Wilcoxon-Mann-Whitney等級總分后分析。在數(shù)據(jù)分布不正常的情形下，通過log-轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)歸一化。
結(jié)果對IMPA1和IMPA2的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析對多種小鼠組織中的IMPA1和IMPA2實時定量反轉(zhuǎn)錄(RTQ)PCR分析，顯示大范圍的組織分布，包括大腦(附圖2)。另外，小鼠IMPA1的表達(dá)水平通常高于小鼠IMPA2的表達(dá)水平(附圖3)。
在未受脅迫的小鼠與受溫和脅迫的野生型Impa2 KO小鼠和野生型同窩小鼠中對MIP合酶和BDNF進行實時定量反轉(zhuǎn)錄(RTQ)PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT同窩小鼠相比，IMPA2 KO小鼠中的MIP合酶表達(dá)水平較高。此外，在對脅迫反應(yīng)時，IMPA2 KO小鼠和WT同窩小鼠中的MIP合酶被顯著地上調(diào)(附圖8)。
另外，與WT同窩小鼠相比，IMPA2 KO小鼠中的BDNF的基因型表達(dá)水平更高，并且與未受脅迫的動物相比，在受脅迫的動物中，該表達(dá)水平被顯著上調(diào)(附圖9)。
對于MIP合酶和BDNF來說，均未出現(xiàn)顯著的基因型表達(dá)水平與脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)水平之間的協(xié)同作用。
表型分析小鼠行為測試升高的零迷宮測試與野生型的同窩小鼠相比，IMPA2+/-小鼠在開放臂中的相對移動距離顯著增加(p＝0.0358)。本發(fā)明人還觀察到一種趨勢，與野生型的同窩小鼠相比，IMPA2-/-小鼠在開放臂中的相對移動距離增加了(p＝0.061)。在升高的零迷宮中誘導(dǎo)焦慮的條件下，與WT同窩小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠在“產(chǎn)生焦慮的”開放臂中花費顯著更長的時間(分別為p＝0.0357和p＝0.0426)。
Porsolt強迫游泳測試在強迫游泳測試誘導(dǎo)脅迫的條件下，在記錄的第一天的10分鐘游泳時段的前6分鐘內(nèi)，在IMPA2-/-、+/-和WT同窩小鼠之間，未觀察到顯著性差異(表2)。但是，第一天的這種刺激性試驗在第二天使IMPA2-/-和+/-小鼠具有優(yōu)勢。也就是說，在6分鐘游泳時段的前3分鐘內(nèi)，與WT同窩小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠的靜止不動時間顯著增加(分別為p＝0.0513和p＝0.0375；表3)。
開闊場地測試對于所試驗的所有參數(shù)來說，在開闊場地測試中，在IMPA2-/-、+/-和WT同窩小鼠之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差別。
討論肌-肌醇單磷酸酶2(IMPA2)是在磷脂酰肌醇信號路徑中起作用的關(guān)鍵酶之一。鋰是最簡單的穩(wěn)定情緒的藥物，它抑制肌醇合成和再循環(huán)中的關(guān)鍵酶IMPA1和IMPA2。此外，兩極紊亂的易感基因座被繪制在染色體18p上，在IMPA2所處的區(qū)域中。為了進一步評價IMPA2在情感譜線(affective spectrum)異常中的潛在生物學(xué)作用，產(chǎn)生和評價了IMPA2敲除(Lexicon Genetics Inc.)。
在多個小鼠組織中進行了IMPA2的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR，顯示了大范圍的組織分布，包括大腦。但是與IMPA1水平相比，IMPA2的表達(dá)水平相對較低。在開闊場地測試、升高的零迷宮測試和強迫游泳中，測試了IMPA2缺陷小鼠的與焦慮和抑郁相關(guān)的行為。在零迷宮中觀察到了基因一劑量效應(yīng)，其中與WT同窩小鼠相比，IMPA2-/-小鼠在迷宮的開闊區(qū)域停留更長的時間，但是它們在運動活性方面不存在差別。在第一個強迫游泳時段內(nèi)，在IMPA2-/-、+/-和WT同窩小鼠之間未觀察到顯著性差別，但是在24小時后的第二個時段內(nèi)，與WT同窩小鼠相比，IMPA2-/-和+/-小鼠的靜止不動表現(xiàn)有顯著的減少。當(dāng)IMPA2-/-、+/-和WT同窩小鼠都探查開放場地30分鐘時，在它們之間沒有發(fā)現(xiàn)差別。
總之，在此提供的結(jié)果表明，IMPA2敲除小鼠表現(xiàn)出與憂慮和抑郁相關(guān)的行為減少，但是其運動功能與WT同窩小鼠無差別，指示了IMPA2在情感紊亂中的可能作用。
為了證實最初的假設(shè)，即IMPA2可能在情感紊亂中起作用，即IMPA2 KO小鼠適度的抗抑郁和抗焦慮的表型，通過研究MIP合酶和BNDF的海馬趾表達(dá)的改變，進行進一步了分子表征。
MIP合酶是與肌醇信號路徑相關(guān)的基因，已知該路徑在狂躁抑郁中起作用，而BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)信號路徑中的基因，已知它與食欲行為和抑郁樣表型的發(fā)展相關(guān)。
在IMPA2 KO小鼠和WT同窩小鼠中，脅迫引起MBP合酶和BDNF的上調(diào)，以及在IMPA2 KO中的基因型上調(diào)，表明了IMPA2在肌醇和神經(jīng)營養(yǎng)路徑對應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)中的作用，提示了IMPA2 KO具有改進的適應(yīng)性潛能(未受脅迫的條件下)和對應(yīng)激物的反應(yīng)。
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<221>CDS<222>(83)..(949)<223>
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100 105 110His Arg Phe Pro Thr Val Ala Val Ser Ile Gly Phe Ala Val His Gln115 120 125Glu Leu Glu Phe Gly Val Ile His His Cys Thr Glu Glu Arg Leu Tyr130 135 140Thr Gly Arg Arg Gly Gln Gly Ala Phe Cys Asn Gly Gln Arg Leu Gln145 150 155 160Val Ser Arg Glu Thr Asp Leu Ala Lys Ala Leu Val Leu Thr Glu Ile165 170 175Gly Pro Lys Arg Asp Pro Asp Thr Leu Lys ValPhe Leu Ser Asn Met180 185190Glu Arg Leu Leu His Ala Lys Ala His Gly Val Arg Val Ile Gly Ser195 200 205Ser Thr Leu Ala Leu Cys Tyr Leu Ala Ser Gly Ala Ala Asp Ala Tyr210 215 220Tyr Gln Phe Gly Leu His Cys Trp Asp Leu Ala Ala Ala Thr Val Ile225 230 235 240Ile Arg Glu Ala Gly Gly Ile Val Ile Asp Thr Ser Gly Gly Pro Leu245 250 255Asp Leu Met Ser Cys Arg Val Val Ala Ala Gly Thr Arg Glu Met Ala260 265 270Val Leu Ile Ala Gln Ala Leu Gln Thr Ile Asn Tyr Gly Arg Asp Asp
275 280 285Glu Lys290<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2正向引物<400>7gaggtggccg tgcagttg18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2正向引物<400>8agacgcgttt ttcctctgtc a21<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA2探針<400>9cctgatgatt tgtcccgcac gca 23<210>10
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA1正向引物<400>10agctgtttca attggcttcc tt 22<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMPA1反向引物<400>11gccggtgtac atcttatctt cca 23<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IMP1探針<400>12tgaataaaga gatggagttt ggaattgtgt acagct36<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶正向引物<400>13
ctgcgccttc ctcaatgg18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶反向引物<400>14gctgcgaagc cagttcca18<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MIP合酶探針<400>15tccccacaga acacactggt acccg25<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BDNF正向引物<400>16cgggacggtc acagtccta 19<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>BDNF反向引物<400>17cacttggtct cgtagaaata ctgctt 26<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>BDNF探針<400>18agaaagtccc ggtatccaaa ggccaac 2權(quán)利要求
1.分離的IMPA2蛋白在鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中所述化合物的特征在于它們能夠增強神經(jīng)元的可塑性。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中IMPA2蛋白選自；i.小鼠IMPA2(SEQ ID No4)、大鼠IMPA2(SEQ ID No6)、人IMPA2(SEQ ID No2)或其功能性片段，或者ii.編碼IMPA2蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在其全長上與人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，優(yōu)選至少90％序列同一性，更加優(yōu)選至少95％或最優(yōu)選至少98％序列同一性。
3.編碼IMPA2蛋白的分離的多核苷酸在鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的分析中的用途，其中所述化合物的特征在于它們能夠增強神經(jīng)元的可塑性。
4.按照權(quán)利要求3的用途，其中在按照本發(fā)明的分析中，所述分離的多核苷酸編碼IMPA2蛋白，其中所述IMPA2蛋白優(yōu)選選自；i.編碼小鼠(EMBLBC011093-SEQ ID No3)、大鼠(EMBLAY160191-SEQ ID No5)或人(EMBLBC011093-SEQ IDNo1)IMPA2酶的多核苷酸，或者ii.編碼IMPA2蛋白的多核苷酸序列，其中所述氨基酸序列在其全長上與人IMPA2蛋白(SEQ ID No2)具有至少80％序列同一性，優(yōu)選至少90％序列同一性，更加優(yōu)選至少95％或最優(yōu)選至少98％序列同一性。
5.鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的方法，其中所述抗焦慮或抗抑郁化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性，所述方法包括步驟a)提供包含IMPA2蛋白的組合物；將b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物是抗焦慮或抗抑郁的化合物。
6.用于確定一種化合物是否能夠增強神經(jīng)元的可塑性的方法，所述方包括a)提供包含IMPA2蛋白的組合物；將b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物是增強神經(jīng)元的可塑性的化合物。
7.按照權(quán)利要求5或6的方法，其中通過測量肌-肌醇1-磷酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和無機磷酸鹽來評定IMPA2蛋白活性。
8.按照權(quán)利要求5-7的任何一項的方法，其中通過測定放射標(biāo)記的肌醇形式的肌-肌醇單磷酸鹽產(chǎn)物或者放射標(biāo)記的32Pi形式的無機磷酸鹽(Pi)的積累或者通過比色分析來評定IMPA2蛋白的活性。
9.按照權(quán)利要求5-8的任何一項的方法，其中包含IMPA2蛋白的組合物可以是表達(dá)按照本發(fā)明的IMPA2蛋白的細(xì)胞提取物、全細(xì)胞或生物體。
10.治療與神經(jīng)元適應(yīng)性反應(yīng)受損相關(guān)的癥狀的方法，包含給需要這種治療的受試者施用有效量的IMPA2抑制劑的步驟。
11.按照權(quán)利要求9的方法，其中與神經(jīng)元適應(yīng)性反應(yīng)受損相關(guān)的癥狀選自記憶功能障礙或者神經(jīng)退行性疾病。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中神經(jīng)退行性疾病選自老年性癡呆、阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、腦脊髓腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、皮克病或威爾遜病。
13.治療神經(jīng)元損傷的方法，包含給需要這種治療的受試者施用有效量的IMPA2抑制劑的步驟。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中神經(jīng)元損傷選自中風(fēng)、多發(fā)性梗塞癡呆、頭部創(chuàng)傷、大腦缺血、大腦損傷和神經(jīng)退行性疾病。
15.增強記憶力和學(xué)習(xí)能力的方法，包含給需要這種治療的受試者施用有效量的IMPA2抑制劑的步驟。
16.按照權(quán)利要求1-9中任何一項的在分析中所鑒定的化合物的用途，用于制備治療焦慮的藥物或者用于制備促進神經(jīng)元的可塑性的藥物。
17.IMPA2敲除動物作為神經(jīng)可塑性的模型的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及?。〈紗瘟姿崦?(IMPA2)的功能表征，IMPA2是在磷脂酰肌醇信號路徑中起作用的酶之一。特別地，本發(fā)明提供證據(jù)表明IMPA2與抑郁和焦慮引起的癥狀，特別是焦慮和情感紊亂相關(guān)。第一個方面，本發(fā)明提供IMPA2酶在用于鑒定抗焦慮或抗抑郁化合物的分析中的用途。特別是編碼所述IMPA2蛋白的分離多核苷酸的用途，其中所述IMPA2蛋白優(yōu)選選自編碼小鼠、大鼠或人的IMPA2酶的多核苷酸。因此，本發(fā)明的目的在于提供用于鑒定抗焦慮或抗抑郁的化合物的方法，其中所述化合物能夠增強神經(jīng)元的可塑性，所述方法包括步驟a)提供包含IMPA2蛋白的組合物；b)將IMPA2蛋白與測試化合物接觸；和c)測量IMPA2蛋白的活性，其中在存在測試化合物時，IMPA2活性下降指示測試化合物為一種抗焦慮或抗抑郁的化合物。在這些分析中，通過對肌－肌醇1－磷酸鹽水解生成肌醇和無機磷酸鹽進行測量，來評價IMPA2蛋白的活性，特別是通過測量放射標(biāo)記的肌醇形式的?。〈紗瘟姿崦府a(chǎn)物或放射標(biāo)記的
文檔編號G01N33/573GK1791674SQ200480013358
公開日2006年6月21日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月16日
發(fā)明者W·M·A·巴勒曼斯, D·W·E·默查斯, T·H·W·施特克勒, K·克林斯 申請人:詹森藥業(yè)有限公司