基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及試劑盒，包括：在同一PCR擴增體系中，通過PCR對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增以及針對SNPs基因型和單堿基突變的類型進行位點特異性區(qū)分的AS-PCR擴增；對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。從對樣本核酸的提取到給出檢測結(jié)果，只需要2～3小時，同時還具有結(jié)果判讀簡單，檢測通量大，檢測成本低的優(yōu)點。在一般的分子實驗室和醫(yī)院檢驗科完成相應(yīng)的檢測；在臨床檢驗進行使用，可大大增加臨床診斷的準確性，縮短患者就醫(yī)的時間，也可醫(yī)療保健系統(tǒng)成本降低。
【專利說明】基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程中單核苷酸多態(tài)性和單堿基突變的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在兩種或兩種以上不同的堿基，其中任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。隨著人類基因組測序工作完成，SNPs篩選及檢測已經(jīng)成為研究者們廣泛關(guān)注的焦點。目前用于SNPs檢測的方法大多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，與熒光、質(zhì)譜法、基因芯片或直接測序等方法結(jié)合，并已進入SNPs檢測的高通量時代。但這些方法大多操作復雜、價格昂貴、檢測時間長，因此并不適合于大規(guī)模使用。本發(fā)明利用PCR&AS-PCR核酸擴增技術(shù)和DNA溶解曲線技術(shù)發(fā)明的一種操作簡單、價格低廉的檢測技術(shù)。因此，可廣泛地應(yīng)用于與單核苷酸多態(tài)性檢測相關(guān)的領(lǐng)域。
[0003]以下是現(xiàn)有的幾種SNP檢測技術(shù)，如1、限制性酶切片斷長度多態(tài)(RFLP):利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一 DNA片斷，如果存在SNPs位點，酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果就可以判斷是否有SNPs位點以及出現(xiàn)的堿基替換的類型。2、寡核苷酸連接分析(OligosLigat1n Assay, OLA):0LA技術(shù)是通過設(shè)計兩種能與祀序列DNA精確并列雜交的寡核苷酸來完成的。寡核苷酸雜交后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基以共價連接。連接產(chǎn)物可以通過凝膠電泳或固相印跡雜交的方法進行檢測，根據(jù)這些檢測結(jié)果就可以進行SNPs的分型。3、基因芯片(Gene chip):基因芯片，又稱為DNA微探針陣列(Micro-array)。雖然僅用一張芯片，就可以通過芯片上密集排列的已知序列的探針，與若干靶序列進行互補匹配雜交，從而達到同時檢測多個基因的多態(tài)性的目的。4、實時熒光定量PCR (Real-timeQuantitive PCR):根據(jù)突光共振(Fluorescence resonance)的原理,利用突光檢測裝置檢測供試者-接受者(donor-acc印tor)之間的熒光變化，從而進行SNPs的分型。5.DNA測序法:DNA Sanger測序能夠準確、直接反應(yīng)序列的差異，但是從操作周期來看，該方法從樣品的處理到給出報告至少需要3-4天，而且價格也比較昂貴。6、熒光偏振檢測技術(shù)(Fluorescence polarizat1n):對目的基因進行PCR擴增,然后用特異探針與擴增產(chǎn)物中待測核苷酸的下游序列雜交，使探針的3’可在聚合酶的作用下，依據(jù)其互補鏈上的待測堿基連接上一個標有特定熒光素的ddNTP，然后檢測該3’端帶有熒光素的探針，根據(jù)檢測到的熒光素種類和偏振光強度判定待測點是何種堿基。7、雜交雙探針熒光PCR技術(shù):雜交雙探針熒光PCR技術(shù)除常規(guī)的一對引物外，還在PCR反應(yīng)體系中另加有兩個能與PCR產(chǎn)物雜交的橫跨突變位點的突光標記探針。通過熔解曲線(melting curve)的分析而對DNA變性過程的監(jiān)控實現(xiàn)點突變的檢測。
[0004]隨著人基因組測序的完成，各種SNPs數(shù)據(jù)庫不斷的建成，SNPs的功能研究逐步轉(zhuǎn)為科學家們研究的重點。同時，越來越多的研究證明很多遺傳病都與基因組上存在單堿基突變相關(guān)。因此針對不同特定DNA區(qū)域上的不同的SNPs類型在特定群體的序列驗證和頻率分析以及基因片段上的突變位點與特定生理或病理狀態(tài)關(guān)系正成為研究的熱點。但目前市場上，針對多個基因片段中的多個基因位點上的單堿基點突變的檢測方法大多需要專門的分析儀器，不僅價格昂貴，而且操作復雜，所以在應(yīng)用上受到了一定的限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其試劑盒，從對樣本核酸的提取到給出檢測結(jié)果，只需要2~3小時，同時還具有結(jié)果判讀簡單，檢測通量大，檢測成本低的優(yōu)點。因此可在一般的分子實驗室和醫(yī)院檢驗科完成相應(yīng)的檢測；在臨床檢驗進行使用，可大大增加臨床診斷的準確性，縮短患者就醫(yī)的時間，也可醫(yī)療保健系統(tǒng)成本降低。
[0006]本發(fā)明的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括:
[0007](I)在同一 PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A，通過PCR對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增；通過位點特異性引物B，針對SNPs基因型和單堿基突變的類型進行位點特異性區(qū)分的AS-PCR擴增；
[0008](2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0009]所述擴增引物A能對包含SNPs位點和單堿基突變位點的DNA序列進行特異性的擴增，其退火溫度在60~75°C，因此可形成長度為A的DNA雙鏈產(chǎn)物；能針對不同SNPs位點和單堿基突變位點的基因型設(shè)計位點特異性引物B，其退火溫度為35~55°C ;只有當引物B與模板序列完全互補的時候，引物B才能在DNA聚合酶的作用下進行延伸；并形成長度為B的雙鏈產(chǎn)物；
[0010]所述擴增引物A的退火溫度優(yōu)選為65~70°C，引物B的退火溫度優(yōu)選為35~45。。。
[0011]所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料等。
[0012]所述的PCR擴增體系為:
[0013]模板2-6微升；
[0014]正向引物A:0.025~0.5微摩；
[0015]反向引物A:0.025~0.5微摩；
[0016]特異性引物B:0.025~0.5微摩(一條特異性引物B的加入量)；
[0017]dNTP:0.2 ~0.5 毫摩
[0018](NH4) 2S04:10 ~30 毫摩
[0019]KCl: 10 ~30 毫摩
[0020]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~30 毫摩
[0021]Triton-100: 1.0% ~2%
[0022]MgCl2:2.5 ~5 毫摩
[0023]熒光染料:0.I~3X ;
[0024]DNA聚合酶:0.5~3單位；
[0025]總體積為20~50微升。
[0026]優(yōu)選的PCR擴增體系為:
[0027]模板3-4微升；
[0028]正向引物A:0.2~0.4微摩;
[0029]反向引物A:0.2~0.4微摩;
[0030]引物B:0.03 ~0.3 微摩；
[0031]dNTP:0.2 ~0.3 毫摩
[0032](NH4) 2S04:10 ~20 毫摩
[0033]KCl: 10 ~20 毫摩
[0034]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~20 毫摩
[0035]Triton-100: 1.0%
[0036]MgCl2:2.5 ~3 毫摩
[0037]熒光染料:0.2~2X ;
[0038]DNA聚合酶:0.5~2單位；
[0039]總體積為30~40微升。
[0040]所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0041]第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘；
[0042]第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)；
[0043]第三階段:90~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)；
[0044]優(yōu)選的PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0045]第一階段:92~95°C保溫2~4分鐘；
[0046]第二階段:92~94°C保溫10~20秒，66~72°C保溫20~30秒，共35~45個循環(huán):
[0047]第三階段:92~94°C保溫10~15秒，45~50°C保溫15~30秒，共10~15個循環(huán)。
[0048]所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40V~50V復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50V~66V開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/秒；然后在40°C~60°C進行冷卻；優(yōu)選的溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；45°C~48°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度55°C~58°C開始升溫至90°C~92°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次每秒；然后在50°C~55 °C進行冷卻。
[0049]本發(fā)明的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測試劑盒，包括:
[0050]( 1)-200C保存的陽性對照液；
[0051 ](2)-20°C保存的陰性對照液；
[0052](3)_20°C保存的擴增引物A，對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增；
[0053](4)_20°C保存的特異性引物B，針對SNPs基因型和單堿基突變的類型進行位點特異性區(qū)分的AS-PCR擴增；
[0054](5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑；
[0055](6)-20°C保存的 ddH20。
[0056]其中，所述的陽性對照液為含有可以產(chǎn)生陽性信號的模板序列，陰性對照為不含產(chǎn)生陽性信號的模板序列的液體。
[0057]本發(fā)明還涉及相關(guān)試劑盒在病原體已知耐藥突變基因的檢測、親子鑒定或者腫瘤相關(guān)基因突變檢測中的應(yīng)用，如:1)與SNPs直接相關(guān)的人類遺傳性疾病的分子診斷；2)人群中可以確定人類健康遺傳基礎(chǔ)的SNPs的篩查與分型；3)人體藥物反應(yīng)差異性檢測與篩查；4)人群中某種疾病易感基因的篩查；5)病原體已知耐藥基因的檢測。
[0058]本發(fā)明檢測SNPs和單堿基突變的方法，主要包括3個步驟:
[0059]I)通過PCR對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增。PCR反應(yīng)的退火溫度在66~72°C之間，循環(huán)數(shù)為35~45。該步驟PCR擴增步驟并不對單堿基突變的堿基類型進行區(qū)分，只是為了達到富集靶序列的目的，PCR擴增的引物的Tm應(yīng)該在66~72°C左右。
[0060]2)針對SNPs位點的堿基類型進行AS-PCR。AS-PCR反應(yīng)的退火溫度在40~55°C之間，共5~20個循環(huán)。通過控制AS-PCR的反應(yīng)退火溫度和位點特異性引物的退火溫度，使得只有當參與AS-PCR擴增的引物與靶模板完全互補的時候，位點特異性引物才能得以延伸。因此，可針對SNPs位點的不同堿基類型設(shè)計不同的位點特異性引物進行特異性擴增，從而達到區(qū)分SNPs不同基因類型的目的。設(shè)計引物時，可將所需檢測的位點設(shè)計在位點特異性引物的靠近3，末端位置。位點特異性引物的Tm在40~55°C，以避免其參與到步驟I)中，從而提高反應(yīng)的特異性。
[0061]3)擴增產(chǎn)物溶解曲線分析技術(shù)。通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況。如果擴增反應(yīng)中只有步驟I的PCR擴增產(chǎn)物而沒有AS-PCR擴增產(chǎn)物時，在進行擴增產(chǎn)物溶解曲線分析，將只出現(xiàn)所引物A所擴增產(chǎn)物的特異性曲線；如果擴增反應(yīng)中既有步驟I的PCR擴增產(chǎn)物又有步驟2的AS-PCR擴增產(chǎn)物時，在進行擴增產(chǎn)物溶解曲線分析，將同時出現(xiàn)由引物A所擴增得到的產(chǎn)物的特異性曲線和引物B所擴增得到的產(chǎn)物的特異性曲線，由于引物A和引物B所擴增的產(chǎn)物在長度和堿基的組成上存在比較大的差異，因此可以比較容易從熒光強度與時間曲線上進行區(qū)分。而不同的SNPs基因類型可通過設(shè)計不同的位點特異性引物也可對SNPs的不同基因類型從熒光強度與時間曲線上進行區(qū)分，從而得到SNPs和單堿基突變位點的基因類型檢測結(jié)果。
[0062]本發(fā)明的檢測方法通過在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，具體包括如下4個技術(shù)方案:
[0063]技術(shù)方案一:克拉霉素耐藥位點A2143G、A2142G和A2142C的檢測方法，包括:
[0064](I)抽取樣品的基因組DNA，在同一 PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A進行目標靶模板擴增，以及特異性引物B1、B2、B3對A2143G、A2142G和A2142C突變位點的AS-PCR擴增；
[0065](2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0066]所述擴增引物A的序列為:
[0067]A 正向引物:5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG(SEQ ID NO:1)
[0068]A 反向引物:5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2) ?
[0069]所述特異性引物B1、B2、B3的序列為:
[0070]位點特異性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO: 3)
[0071]位點特異性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)
[0072]位點特異性引物B35-CGGCAAGACGGAGA (SEQ ID NO: 5) ?
[0073]所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料等。
[0074]所述的PCR擴增體系為:
[0075]模板2-6微升；
[0076]正向引物A:0.025~0.5微摩;
[0077]反向引物A:0.025~0.5微摩;
[0078]引物B1:0.025 ~0.5 微摩；
[0079]引物B2:0.025 ~0.5 微摩；
[0080]引物B3:0.025 ~0.5 微摩；
[0081]dNTP:0.2 ~0.5 毫摩
[0082](NH4) 2S04:10 ~30 毫摩
[0083]KCl: 10 ~3O 毫摩
[0084]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~30 毫摩
[0085]Triton-100:1.0% ~2%
[0086]MgCl2:2.5 ~5 毫摩
[0087]熒光染料:0.I~3X ;
[0088]DNA聚合酶:0.5~3單位；
[0089]總體積為20~50微升。
[0090]優(yōu)選的PCR擴增體系為:
[0091]模板3-4微升；
[0092]正向引物A:0.2~0.4微摩;
[0093]反向引物A:0.2~0.4微摩;
[0094]引物B1:0.1 ~0.5 微摩；
[0095]引物B2:0.1 ~0.5 微摩；
[0096]引物B3:0.1 ~0.5 微摩；
[0097]dNTP:0.2 ~0.3 毫摩
[0098](NH4) 2SO4:10 ~20 毫摩
[0099]KCl: 10 ~20 毫摩
[0100]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~20 毫摩
[0101]Triton-100:1.0%
[0102]MgCl2:2.5 ~3 毫摩
[0103]熒光染料:0.2~2X;
[0104]DNA聚合酶:0.5~2單位；
[0105]總體積為30~40微升。
[0106]所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0107]第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘；
[0108]第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)；
[0109]第三階段:90~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)；
[0110]優(yōu)選的PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0111]第一階段:92~95°C保溫2~4分鐘；
[0112]第二階段:92~94°C保溫10~20秒，66~72°C保溫20~30秒，共35~45個循環(huán):
[0113]第三階段:92~94°C保溫10~15秒，45~50°C保溫15~30秒，共10~15個循環(huán)。
[0114]所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40°C~50°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50°C~66°C開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/s ;然后在40°C~60°C進行冷卻；優(yōu)選的溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；45°C~48°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度55°C~58°C開始升溫至90°C~92°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次每秒；然后在50°C~55 °C進行冷卻。
[0115]克拉霉素耐藥位點A2143G、A2142G和A2142C的檢測試劑盒，包括:
[0116](I) -20V保存的陽性對照液；
[0117](2)_20°C保存的陰性對照液；
[0118](3)_20°C保存的擴增引物A:
[0119]A 正向引物:5-CGTCAGTCGCAAGATGAAGCG (SEQ ID NO:1)
[0120]A 反向引物:5-CGCATGATATTCCCATTAGCAG(SEQ ID NO:2)；
[0121](4) _20°C保存的特異性引物B:用于檢測A2143G、A2142G和A2142C突變位點
[0122]位點特異性引物B15-GCGGCAAGACGGGA(SEQ ID NO: 3)
[0123]位點特異性引物B25-GCGGCAAGACGGCA(SEQ ID NO:4)
[0124]位點特異性引物B35-CGGCAAGACGGAGA(SEQ ID NO: 5)；
[0125](5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑；
[0126](6) _20°C保存的 ddH20。
[0127]其中，所述的陽性對照液為含有可以產(chǎn)生陽性信號的模板序列，陰性對照為不含產(chǎn)生陽性信號的模板序列的液體。
[0128]技術(shù)方案二:克拉霉素耐藥位點Asn87Lys 和 Asp (GAT) 9 IGly (GGT) /Tyr (TAT) /Asn (AAT)的檢測方法，包括:
[0129](I)抽取樣品的基因組DNA，在同一 PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A進行目標靶模板擴增，以及特異性引物B1、B2、B3、B4、B5對Asn87Lys和Asp (GAT) 9IGly (GGT) /Tyr (TAT) /Asn (AAT)突變位點的 AS-PCR 擴增；
[0130](2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0131]所述擴增引物A的序列為:
[0132]A 正向引物:5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT (SEQ ID NO:6)
[0133]A 反向引物:5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)；
[0134]所述特異性引物B1、B2、B3、B4、B5的序列為:
[0135]位點特異性引物B15-CCATGGCGATAAAG(SEQ ID NO:8)
[0136]位點特異性引物B25-CCATGGCGATAAGG(SEQ ID NO:9)
[0137]位點特異性引物B35-ACGCGGTTTATTA(SEQ ID NO: 10)
[0138]位點特異性引物B45-ACGCGGTTTATAA(SEQ ID NO: 11)
[0139]位點特異性引物B55-ACCGGTTTATGGT(SEQ ID NO: 12)；
[0140]所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料等。
[0141]所述的PCR擴增體系為:
[0142]模板2_6微升；
[0143]正向引物A:0.025~0.5微摩；
[0144]反向引物A:0.025~0.5微摩；
[0145]引物B1:0.025 ~0.5 微摩；
[0146]引物B2:0.025 ~0.5 微摩；
[0147]引物B3:0.025 ~0.5 微摩；
[0148]引物B4:0.025 ~0.5 微摩；
[0149]引物B5:0.025 ~0.5 微摩；
[0150]dNTP:0.2 ~0.5 毫摩[0151 ](NH4) 2S04:10 ~30 毫摩
[0152]KCl: 10 ~30 毫摩
[0153]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~30 毫摩
[0154]Triton-100: 1.0% ~2%
[0155]MgCl2:2.5 ~5 毫摩
[0156]熒光染料 0.1~3Χ;
[0157]DNA聚合酶:0.5~3單位；
[0158]總體積為20~50微升。
[0159]優(yōu)選的PCR擴增體系為:
[0160]模板3_4微升；
[0161]正向引物A:0.2~0.4微摩；
[0162]反向引物A:0.2~0.4微摩；
[0163]引物B1:0.1 ~0.5 微摩；
[0164]引物B2:0.1 ~0.5 微摩；
[0165]引物B3:0.1 ~0.5 微摩；
[0166]引物B4:0.1 ~0.5 微摩；
[0167]引物B5:0.1 ~0.5 微摩;
[0168]dNTP:0.2 ~0.3 毫摩
[0169](NH4) 2S04:10 ~20 毫摩
[0170]KCl:10 ~20 毫摩
[0171]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0):10 ~20 毫摩
[0172]Tri ton-100:1.0%
[0173]MgCl2:2.5 ~3 毫摩
[0174]熒光染料:0.2~2X;
[0175]DNA聚合酶:0.5~2單位；
[0176]總體積為30~40微升。
[0177]所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0178]第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘；
[0179]第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)；
[0180]第三階段:90~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)；
[0181]優(yōu)選的PCR 擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0182]第一階段:92~95°C保溫2~4分鐘；
[0183]第二階段:92~94°C保溫10~20秒，66~72°C保溫20~30秒，共35~45個循環(huán):
[0184]第三階段:92~94°C保溫10~15秒，45~50°C保溫15~30秒，共10~15個循環(huán)。
[0185]所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40°C~50°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50°C~66°C開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/s ;然后在40°C~60°C進行冷卻；優(yōu)選的溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；45°C~48°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度55°C~58°C開始升溫至90°C~92°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次每秒；然后在50°C~55 °C進行冷卻。
[0186]克拉霉素耐藥位點Asn87Lys 和 Asp (GAT) 9IGly (GGT) /Tyr (TAT) /Asn (AAT)的檢測試劑盒，包括:
[0187](I) -20V保存的陽性對照液；
[0188](2) -20V保存的陰性對照液；
[0189](3) -20V保存的擴增引物A:
[0190]A 正向引物:5-TTTAGCTTATTCAATGAGCGT (SEQ ID NO:6)
[0191]A 反向引物:5-GCAGACGGCTTGGTAGAATA(SEQ ID NO:7)；
[0192](4) _20°C保存的特異性引物B:用于檢測AGC — AAC, AGC — ACC突變位點
[0193]位點特異性引物B15-CCATGGCGATAAAG(SEQ ID NO:8)
[0194]位點特異性引物B25_CCATGGCGATAAGG(SEQ ID NO:9)
[0195]位點特異性引物B35-ACGCGGTTTATTA(SEQ ID NO: 10)
[0196]位點特異性引物B45-ACGCGGTTTATAA(SEQ ID NO: 11)
[0197]位點特異性引物B55-ACCGGTTTATGGT(SEQ ID NO: 12)；
[0198](5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑；
[0199](6) _20°C保存的 ddH20。
[0200]其中，所述的陽性對照液為含有可以產(chǎn)生陽性信號的模板序列，陰性對照為不含產(chǎn)生陽性信號的模板序列的液體。
[0201]技術(shù)方案三:Leber’ s病線粒體DNA G11778A單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括:
[0202](I)抽取樣品的基因組DNA，在同一 PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A進行目標靶模板擴增，以及特異性引物BI對G11778A突變位點的AS-PCR擴增；
[0203](2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0204]所述擴增引物A的序列為:
[0205]A 正向引物:5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO: 13)
[0206]A 反向引物:5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG (SEQ ID NO: 14)。
[0207]所述特異性引物BI的序列為:
[0208]位點特異性引物B15-CACTCACAGTCGC(SEQ ID NO: 15)。
[0209]所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料等。
[0210]所述的PCR擴增體系為:
[0211 ]模板2-6微升；
[0212]正向引物A:0.2~0.4微摩；
[0213]反向引物A:0.2~0.4微摩；
[0214]引物B1:0.025 ~0.5 微摩；
[0215]dNTP:0.2 ~0.5 毫摩
[0216](NH4) 2S04:10 ~30 毫摩
[0217]KCl: 10 ~30 毫摩
[0218]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~30 毫摩
[0219]Triton-100: 1.0% ~2%
[0220]MgCl2:2.5 ~5 毫摩
[0221]熒光染料:0.1~3X;
[0222]DNA聚合酶:0.5~3單位；
[0223]總體積為20~50微升。
[0224]優(yōu)選的PCR擴增體系為:
[0225]模板3-4微升；
[0226]正向引物A:0.2~0.4微摩；
[0227]反向引物A:0.2~0.4微摩;
[0228]引物B1:0.1 ~0.5 微摩；
[0229]dNTP:0.2 ~0.3 毫摩
[0230](NH4) 2S04:10 ~20 毫摩
[0231]KCl: 10 ~20 毫摩
[0232]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~20 毫摩
[0233]Tri ton-100:1.0%
[0234]MgCl2:2.5 ~3 毫摩
[0235]熒光染料:0.2~2X ;
[0236]DNA聚合酶:0.5~2單位；
[0237]總體積為30~40微升。
[0238]所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0239]第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘；
[0240]第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)；
[0241]第三階段:9 0~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)；
[0242]優(yōu)選的PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0243]第一階段:92~95°C保溫2~4分鐘；
[0244]第二階段:92~94°C保溫10~20秒，66~72°C保溫20~30秒，共35~45個循環(huán):
[0245]第三階段:92~94°C保溫10~15秒，45~50°C保溫15~30秒，共10~15個循環(huán)。
[0246]所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40°C~50°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50°C~66°C開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/s ;然后在40°C~60°C進行冷卻；優(yōu)選的溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；45°C~48°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度55°C~58°C開始升溫至90°C~92°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次每秒；然后在50°C~55 °C進行冷卻。
[0247]Leber’ s病線粒體DNA G11778A單核苷酸多態(tài)性檢測試劑盒，包括:
[0248]1、檢測試劑盒組成,包括:
[0249](1)-20V保存的陽性對照液；
[0250](2)-20V保存的陰性對照液；
[0251 ] (3)-20°C保存的擴增引物A:
[0252]A 正向引物:5-GCGCAGTCATTCTCATAATCG(SEQ ID NO: 13)
[0253]A 反向引物:5-GGCGAGGTTAGCGAGGCTTG(SEQ ID NO: 14)；
[0254](4) _20°C保存的特異性引物B:用于檢測G11778A突變位點
[0255]位點特異性引物B15-CACTCACAGTCAC(SEQ ID NO: 15)
[0256](5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑；
[0257](6) _20°C保存的 ddH20。
[0258]其中，所述的陽性對照液為含有可以產(chǎn)生陽性信號的模板序列，陰性對照為不含產(chǎn)生陽性信號的模板序列的液體。
[0259]技術(shù)方案四:載脂蛋白E基因C112R單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，包括:
[0260](I)抽取樣品的基因組DNA，在同一 PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A進行目標靶模板擴增，以及特異性引物BI對載脂蛋白E基因C112R突變位點的AS-PCR擴增；
[0261](2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
[0262]所述擴增引物A的序列為:
[0263]A 正向引物:5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO: 16)
[0264]A 反向引物:5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO: 17)；
[0265]所述特異性引物BI的序列為:
[0266]位點特異性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO: 18)
[0267]所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料等。
[0268]所述的PCR擴增體系為:
[0269]模板2_6微升；
[0270]正向引物A:0.2~0.4微摩;
[0271]反向引物A:0.2~0.4微摩；
[0272]引物B1:0.025 ~0.5 微摩；
[0273]dNTP:0.2 ~0.5 毫摩
[0274](NH4) 2S04:10 ~30 毫摩
[0275]KCl: 10 ~30 毫摩
[0276]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~30 毫摩
[0277]Triton-100:1.0% ~2%
[0278]MgCl2:2.5 ~5 毫摩
[0279]熒光染料:0.1~3X ;
[0280]DNA聚合酶:0.5~3單位；
[0281]總體積為20~50微升。
[0282]優(yōu)選的PCR擴增體系為:
[0283]模板3-4微升；
[0284]正向引物A:(λ 2~0.4微摩；
[0285]反向引物A:0.2~0.4微摩;
[0286]引物B1:0.1 ~0.5 微摩；
[0287]dNTP:0.2 ~0.3 毫摩
[0288](NH4) 2S04:10 ~20 毫摩
[0289]KCl: 10 ~20 毫摩
[0290]Tris-HCL (PH8.5 ~9.0): 10 ~20 毫摩
[0291]Triton-100: 1.0%
[0292]MgCl2:2.5 ~3 毫摩
[0293]熒光染料:0.2~2X ;
[0294]DNA聚合酶:0.5~2單位；
[0295]總體積為30~40微升。
[0296]所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0297]第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘；
[0298]第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)；
[0299]第三階段:90~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)；
[0300]優(yōu)選的PCR擴增體系的反應(yīng)條件為:
[0301]第一階段:92~95°C保溫2~4分鐘；
[0302]第二階段:92~94°C保溫10~20秒，66~72°C保溫20~30秒，共35~45個循環(huán):
[0303]第三階段:92~94°C保溫10~15秒，45~50°C保溫15~30秒，共10~15個循環(huán)。
[0304]所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40°C~50°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50°C~66°C開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/s ;然后在40°C~60°C進行冷卻；優(yōu)選的溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；45°C~48°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度55°C~58°C開始升溫至90°C~92°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次每秒；然后在50°C~55 °C進行冷卻。
[0305]載脂蛋白E基因C112R單核苷酸多態(tài)性的檢測試劑盒，包括:
[0306]1、檢測試劑盒組成，包括:
[0307](1)-20V保存的陽性對照液；
[0308](2)-20V保存的陰性對照液；
[0309](3)-20V保存的擴增引物A:
[0310]A 正向引物:5-GGCTGTCCAAGGAGCTGCAG(SEQ ID NO: 16)
[0311]A 反向引物:5-GCACCTCGCCGCGGTACTGC(SEQ ID NO: 17)；
[0312](4) _20°C保存的特異性引物B:
[0313]位點特異性引物B15-ATGGAGGACGTGTG(SEQ ID NO: 18)
[0314](5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑；
[0315](6) _20°C保存的 ddH20。
[0316]其中，所述的陽性對照液為含有可以產(chǎn)生陽性信號的模板序列，陰性對照為不含產(chǎn)生陽性信號的模板序列的液體。
[0317]本發(fā)明提供的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其試劑盒，從對樣本核酸的提取到給出檢測結(jié)果，只需要2~3小時。同時還具有結(jié)果判讀簡單，檢測通量大，檢測成本低的優(yōu)點，因此可在一般的分子實驗室和醫(yī)院檢驗科完成相應(yīng)的檢測。在臨床檢驗進行使用，可大大增加臨床診斷的準確性，縮短患者就醫(yī)的時間，也可醫(yī)療保健系統(tǒng)成本降低。
[0318]表1為本方法與目前比較常見的SNPs檢測技術(shù)的比較:
[0319]

【權(quán)利要求】
1.一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括: (1)在同一PCR擴增體系中，設(shè)計一對擴增引物A，通過PCR對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增；通過位點特異性引物B，針對SNPs基因型和單堿基突變的類型進行位點特異性區(qū)分的AS-PCR擴增； (2)通過對溶液中能與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料監(jiān)測和產(chǎn)物溶解曲線分析程序，檢測步驟(1)擴增產(chǎn)物中單核苷酸多態(tài)性的基因型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述擴增引物A的退火溫度在60~75°C，特異性引物B的退火溫度為35~55°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述擴增引物A的退火溫度為65~70°C，特異性引物B的退火溫度為35~45°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述的熒光染料為SYBR Green染料、Eve Green染料、LC Green PLUS染料或SYT09染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述的PCR擴增體系為: 模板2-6微升； 正向引物A0.025~0.5微摩； 反向引物A0.025~0.5微摩； 特異性引物B0.025~0.5微摩； dNTP0.2 ~0.5 毫摩 (NH4)2SO410 ~30 毫摩 KCl10~30毫摩 Tris-HCL (PH8.5 ~9.0)10 ~30 毫摩 Triton-1001.0% ~2% MgCl22.5~5毫摩 熒光染料I~3X ; DNA聚合酶0.5~3單位； 總體積為20~50微升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述步驟(1)中PCR擴增體系的反應(yīng)條件為: 第一階段:90~98°C保溫I~5分鐘； 第二階段:90~96°C保溫5~25秒，65~75°C保溫10~60秒，共30~50個循環(huán)； 第三階段:90~96°C保溫5~25秒，40~55°C保溫10~45秒，共5~20個循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中溶解曲線分析程序，其溶解檢測條件為:90°C~95°C變性I分鐘；40°C~50°C復性I分鐘；然后從初始溶解溫度50°C~66°C開始升溫至90°C~95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，20~40次/秒；然后在40°C~60°C進行冷卻。
8.一種基于溶解曲線的單核苷酸多態(tài)性檢測試劑盒，包括: (1)-20°C保存的陽性對照液；(2)_20°C保存的陰性對照液；(3)_20°C保存的擴增引物A，對包含SNPs和單堿基突變的位點目標靶模板進行擴增； (4)-20°C保存的特異性引物B，針對SNPs基因型和單堿基突變的類型進行位點特異性區(qū)分的AS-PCR擴增； (5)熒光染料及擴增反應(yīng)體系所需試劑； (6)-20°C保存的ddH20。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒在病原體已知耐藥突變基因的檢測、親子鑒定或者腫瘤相關(guān)基因突變檢測 中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073548SQ201310103399
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】徐高連 申請人:沈迪, 徐高連, 單洪波