專利名稱：一株對柑橘木虱具強致病力的淡紫擬青霉菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株對柑橘木風具強致病力的淡紫擬青霉iPaeci1myceslilacinus')菌株,屬于微生物技術領域。
背景技術：
柑橘木風citri )屬同翅目(Homoptera )、木風科(Chermidae),是柑橘、檸檬、黃皮、九里香、枸杞等蕓香科植物新梢期的主要害蟲，也是傳播柑橘黃龍病的唯一自然蟲媒。柑橘黃龍病作為當前柑橘生產(chǎn)上防治最難、威脅最大的一種毀滅性病害，對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展帶來了嚴重的威脅。但目前對該病害尚未獲得有效的防治藥劑，以防治柑橘木虱為主的綜合防治是當前該病害防控的主要辦法。因此，加強對柑橘木虱的防治，無論對于控制柑橘黃龍病的流行還是降低蟲體本身對柑橘的危害都具有重要的意義。目前對于柑橘木虱的防治多采用化學防治措施，然而化學農(nóng)藥的頻繁使用造成了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、生物多樣性破壞和柑橘木虱產(chǎn)生 抗藥性等諸多問題，而生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性和原料易得等特性被人們認為是未來化學農(nóng)藥的理想替代藥劑。因此，利用生物農(nóng)藥防治柑橘木虱也逐漸引起人們的重視。目前，國內(nèi)外研究者在利用植物提取物、昆蟲天敵等防治柑橘木虱方面進行了諸多有益的嘗試，在柑橘木虱蟲生真菌方面也開展了一定的研究，如目前已報道的對柑橘木虱具有致病效果的真菌有檬形被毛孢citriformis、、氣氏敬著霉 ipaeci lomyces varioti )、玫煙色擬青霉 iPaecilomyces fumosoroseus )、球抱白僵菌 QBeauveria bassiana )、蟲牙笑頂抱霉(Acros talagmus aphit/ia )、黃色鍵刀菌iFusarium cuImorum )和臘階輪枝菌{Lecanicillium 7eca/ ii)等。目前對于柑橘木風生防菌的研究多處于實驗室階段,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中利用生防菌制劑成功防治柑橘木虱的實例尚未有見報道。因此，目前對于柑橘木虱蟲生真菌進一步的分離篩選和生物潛能的深入研究，對于促進將來柑橘木虱生物防治的順利開展具有重要的意義。淡紫擬青霉iPaecilomyces 7i7aci/W5.)是一種重要的生防真菌,研究發(fā)現(xiàn)該菌除對多種植物線蟲具有較強的致病性外，還可寄生荔枝蝽象、葉蟬、褐飛虱、白蟻、象鼻蟲和茶蠶等多種昆蟲，另外，該菌對小麥赤霉病菌、黃瓜炭疽病菌和棉花枯萎病菌等多種植物病原菌具有一定的拮抗作用，且其代謝產(chǎn)物還可促進種子萌發(fā)、促進植物根系和植株生長等，其產(chǎn)生的多種功能酶還具有一定的農(nóng)藥降解效應。目前，已有市場化的針對防治根結線蟲等的淡紫擬青霉生防菌制劑。然而，對于淡紫擬青霉可寄生于柑橘木虱的現(xiàn)象及利用淡紫擬青霉防治柑橘木虱的研究在國內(nèi)外尚未有見報道。本發(fā)明所提供的對柑橘木虱具有強致病力的淡紫擬青霉菌株，是對目前柑橘木虱蟲生真菌資源的有益補充，具有被開發(fā)為柑橘木風生防菌制劑的潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株對柑橘木虱具強致病力的淡紫擬青霉菌株，該菌株具有被開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛能，具有良好的市場應用前景。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
本發(fā)明所提供的淡紫擬青霉菌株為淡紫擬青霉Iilacinus)ZJPL08,已于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為 CGMCC N0.7318。本發(fā)明還提供了所述淡紫擬青霉菌株在防控柑橘黃龍病中的應用，以及在制備用于防治柑橘木虱的生物農(nóng)藥中的應用，菌株ZJPL08的分生孢子懸浮液對柑橘木虱具有強致病力。所述淡紫擬青霉QPaecilomyces Iilacinus.)舊取ZJPL08是從浙江省臺州市黃巖區(qū)的橘園中采集的柑橘木虱蟲體上分離獲得的，該菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、ITS1-5.8SrDNA-1TS2序列和菌種分類結果如下:
1、菌株ZJPL08的形態(tài)特征:菌株ZJPL08在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基生長良好，在PDA平板上菌落呈圓形、隆起，菌絲較致密，表面無分泌物；培養(yǎng)初期菌落顏色為白色，產(chǎn)生孢子后菌落顏色顯示為淡紫色，分生孢子呈粉質(zhì)狀。隨著產(chǎn)孢量的增多，菌落顏色逐漸加深，至培養(yǎng)后期，菌落顏色變?yōu)樯钭仙?。在光學顯微鏡下觀察，菌株ZJPL08分生孢子梗單生或輪生，瓶?；恐鶢罨蚱繝?，向上變?yōu)榧氶L管狀，7.5、X 1.8 3 μ mo分生孢子為單細胞，卵形或紡錘形，無色至黃色，1.5^2.8X1.3^2.5 μ m,在孢子梗上呈鏈狀排列。2、菌株ZJPL08的生物學特性:菌株ZJPL08在PDA培養(yǎng)基上于15°C 35°C的溫度條件下均可生長，但不同溫度對菌株的生長有顯著影響。25°C 30°C時菌絲生長速率明顯高于其他溫度，為菌株ZJPL08的適宜生長溫度。而15°C及以下低溫或35°C及以上高溫下菌株ZJPL08的菌絲生長緩慢，產(chǎn)孢量減少。在全光照、全黑暗和12 h光照/12 h黑暗條件下，菌株ZJPL08在PDA培養(yǎng)基上均生長良好，光照時間的長短對菌株ZJPL08的生長影響不明顯。接種后I d菌 株ZJPL08在馬鈴薯蔗糖(PS)液體培養(yǎng)基中的分生孢子產(chǎn)量明顯高于馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基、薩氏葡萄糖酵母浸膏(SDY)液體培養(yǎng)基、察氏(CD)液體培養(yǎng)基和麥芽浸膏(ME)液體培養(yǎng)基。在接種后7 d，菌株ZJPL08在H)液體培養(yǎng)基中的菌絲產(chǎn)量最高，而在PS培養(yǎng)基中的菌絲產(chǎn)量較低。菌株ZJPL08的分生孢子在15°C 35°C的溫度條件下均能萌發(fā)，其適宜萌發(fā)溫度為25°C 30°C，15°C以下的低溫和35°C以上的高溫孢子均難以萌發(fā)。孢子萌發(fā)率隨時間的延長而升高，至培養(yǎng)9 h后，30°C下菌株ZJPL08的分生孢子萌發(fā)率達99.5%。3、菌株 ZJPL08 的 ITS1-5.8S rDNA_ITS2 序列:測序所得菌株 ZJPL08 的 ITS1-5.8SrDNA-1TS2序列SEQ ID N0.1所示，利用NCBI Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與GenBank中淡紫擬青霉lilacinus)的多個分離物(如 JN650588、FR751342、HM439952、HM032028.EU553316等)的對應序列相似性高達100%，與購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種資源庫的淡紫擬青霉的3個對照菌株(ACCC30640、ACCC32480和ACCC31532)的相似性也高達99.8%。根據(jù)以上關于菌株ZJPL08的形態(tài)特征、生物學特性及ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列特征，將菌株ZJPL08鑒定為絲孢目(Hyphomycetales)擬青霉屬的淡紫擬青霉(.Paecilomyces IiIacinus )。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:(1)目前國內(nèi)外尚無關于淡紫擬青霉侵染柑橘木虱的報道，而本發(fā)明的菌株ZJPL08是從浙江省臺州市黃巖區(qū)柑橘園中被侵染的柑橘木虱蟲體上分離獲得的，與分離自其它基物的淡紫擬青霉菌株相比，本發(fā)明所述的淡紫擬青霉ZJPL08對柑橘木虱具有更強的致病力；(2)本發(fā)明所述的淡紫擬青霉ZJPL08是一種昆蟲病原真菌，可被開發(fā)為生防菌制劑用于對柑橘木虱的生物防治，較目前防治柑橘木虱的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性的特征；(3)本發(fā)明所述的淡紫擬青霉ZJPL08的分生孢子懸浮液對柑橘木虱具有強致病力，接種柑橘木風后第3 d的LC5tl為5.77 X IO9 spores/mL,濃度為LOX IO8 spores/mL的孢子懸浮液的LT5tl僅為3.1 d。菌株ZJPL08較其他淡紫擬青霉菌株對柑橘木虱有更強的作用效果，具有良好的市場應用前景。(4)菌株ZJPL08培養(yǎng)快，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高，易于制備。


圖1為淡紫擬青霉lilacinus、H ZJPL08在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。圖2為淡紫擬青霉Iilacinus.)舊取ZJPL08對柑橘木風的侵染情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。一種對柑橘木虱具強致病力的淡紫擬青霉菌，菌種命名為ZJPL08，分類命名:淡紫擬青霉 7i7aci/W5.),其保藏編號:CGMCC N0.7318,保藏日期:2013 年 3月15日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。實施例1:昆蟲病原菌的分離和篩選 1、病菌的分離純化:從浙江省臺州市黃巖區(qū)柑橘園內(nèi)采集柑橘木虱蟲尸，帶回實驗室將其放于70%乙醇中浸泡30 S,再經(jīng)過0.1%升萊浸泡3 min,最后用無菌水沖洗3次,用無菌濾紙吸干蟲體上的水分，然后將其放于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(配制方法為:稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸半個小時，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝至錐形瓶或玻璃試管中，121°C，高壓滅菌20 min)中，置于微生物培養(yǎng)箱中28°C恒溫培養(yǎng)，至蟲體周圍長出菌絲后，挑取菌絲轉(zhuǎn)至新的PDA平板上培養(yǎng)(重復此操作2 3次)，持續(xù)培養(yǎng)5 d左右，待菌落上產(chǎn)生分生孢子，用無菌水洗脫分生孢子制備成分生孢子懸浮液，然后參照《植病研究方法》中所述的稀釋純化法(方中達.植病研究方法(第三版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1998: 122-140)對病菌進行單孢分離。最后將分離純化獲得的菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)31 d后，置于4 °C冰箱保存。2、致病菌的篩選:將上述分離純化保存的菌株接種到PDA平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)10 d左右后，以無菌水洗脫菌落上產(chǎn)生的分生孢子，制備獲得分生孢子懸浮液，向其中加入適量的吐溫-80至終濃度為0.1%。取于溫室飼養(yǎng)的30頭健康柑橘木虱成蟲(本說明書實施例均以柑橘木虱成蟲為測試對象)浸沒于含0.1%吐溫-80的分生孢子懸浮液中1(T15 s，挑取處理后仍能自由活動的柑橘木虱置于培養(yǎng)皿中的九里香葉片上(培養(yǎng)皿底部鋪有2層用無菌水濕潤過的濾紙，其上放置一個帶10個左右葉片的九里香嫩枝，枝條底端以無菌水濕潤的脫脂棉包裹)，然后放于28°c光照培養(yǎng)箱中(每天14 h光照/10 h黑暗，濕度95%以上)培養(yǎng)，同時設立含0.1%吐溫-80的無菌水處理柑橘木虱為對照，培養(yǎng)7 d后觀察病菌對柑橘木虱的侵染和致死情況。之后再按步驟I中的方法從處理后的柑橘木虱蟲體中分離病菌，比較再分尚的病菌與初始接種的病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征。通過以上操作，篩選出符合科赫氏法則的對柑橘木虱具致病性的菌株，排除從柑橘木虱蟲體上分離到的腐生菌等非致病菌。通過篩選，獲得I株對柑橘木虱具有致病力的菌株，將其命名ZJPL08。3、菌株的復壯:制備上述篩選到的對柑橘木虱具致病力的菌株ZJPL08的分生孢子懸浮液，接種到健康柑橘木虱蟲體上，然后再從發(fā)病的柑橘木虱蟲體上分離純化病菌，具體操作方法同上。最后獲得分離純化的菌株ZJPL08。實施例2:菌株ZJPL08的鑒定
1、菌株ZJPL08的形態(tài)特征:將上述分離純化的菌株ZJPL08接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置于28°C恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況并記錄菌落顏色和形態(tài)。將菌株ZJPL08接種到另一 PDA培養(yǎng)基平板中央，同時將滅菌后的蓋玻片(I cmXl cm)斜插入距接種點約Icm左右處的培養(yǎng)基內(nèi)，置于28 1:恒溫培養(yǎng)5 d左右待菌絲爬到蓋玻片上后，取出蓋玻片置于光學顯微鏡下觀察菌株ZJPL08的菌絲和孢子形態(tài)。圖1示菌株ZJPL08在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的形態(tài)特征，可見菌株ZJPL08菌落呈圓形、隆起，菌絲較致密，表面無分泌物；培養(yǎng)初期菌落顏色為白色，產(chǎn)生孢子后菌落顏色顯示為淡紫色，分生孢子呈粉質(zhì)狀。隨著產(chǎn)孢量的增多，菌落顏色逐漸加深，至培養(yǎng)后期，菌落顏色變?yōu)樯钭仙?。在光學顯微鏡可觀察到菌株ZJPL08分生孢子梗單生或輪生，瓶?；恐鶢罨蚱繝?，向上變?yōu)榧氶L管狀，7.5^9 X 1.8^3 μ mo分生孢子為單細胞，卵形或紡錘形，無色至黃色，1.5^2.8 X 1.3^2.5 μ m,在孢子梗上呈鏈狀排列。
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2、菌株ZJPL08的序列分析:將菌株ZJPL08接種至PDA培養(yǎng)基平板，置于28 V恒溫培養(yǎng)至菌落長滿整個培養(yǎng)皿，以無菌藥匙刮取PDA平板上生長的真菌菌絲于無菌研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，采用改良的CTAB法提取菌株ZJPL08的總DNA，以純化的DNA為模板，用真菌通用引物ITS5 (5 ; -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ')和ITS4 (5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')進行PCR擴增(具體操作方法參考:鹿連明等.柑橘黃龍病菌核糖體蛋白基因的多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育分析.浙江大學學報，2011，37(2):125-132λΡΟ 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收后送交公司測序。測序所得菌株ZJPL08的ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列如SEQ ID N0.1所示，利用NCBI Blast比對分析發(fā)現(xiàn),該序列與GenBank中淡紫擬青霉lilacinus、的多個分離物(如 JN650588、FR751342、HM439952、HM032028、EU553316 等)的序列相似性高達100%，與購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種資源庫的淡紫擬青霉的3個對照菌株(ACCC30640、ACCC32480 和 ACCC31532)的相似性也高達 99.8%。根據(jù)以上關于菌株ZJPL08的形態(tài)特征及ITS1-5.8S rDNA_ITS2序列特征，可將菌株ZJPL08鑒定為絲孢目(Hyphomycetales)擬青霉屬)的淡紫擬青霉(.Paecilomyces lilacinus\實施例3:菌株ZJPL08的生物學特性1、不同溫度對菌株ZJPL08生長的影響:以無菌打孔器于在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d左右的菌株ZJPL08的菌落周圍打取5 mm大小的菌餅，然后將菌餅分別置于數(shù)個新鮮制備的PDA平板(直徑為9 cm)中央，分別于5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、3(TC和35°C光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每個溫度下設3個重復。培養(yǎng)14 d，每24 h觀察菌落生長情況并采用十字交叉法記錄菌落直徑。結果見表1，可以看出，菌株ZJPL08在PDA培養(yǎng)基上于15°C 35°C的溫度條件下均可生長，其中25°C和30°C時菌絲生長速率明顯高于其他溫度，培養(yǎng)14 d菌落幾乎可長滿整個培養(yǎng)皿，而35°C時菌落生長速度明顯減緩，10°C和5°C低溫下菌落幾乎不生長。因此，250C 30°C為菌株ZJPL08的適宜生長溫度。表I接種后不同天數(shù)不同溫度下菌株ZJPL08的生長情況
權利要求
1.一株淡紫擬青霉菌株,其特征在于該菌株為淡紫擬青霉lilacinus)ZJPL08,已于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.7318。
2.如權利要求1所述的淡紫擬青霉菌株在防控柑橘黃龍病中的應用。
3.如權利要求1所述的淡紫擬青霉菌株在制備用于防治柑橘木虱的生物農(nóng)藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株對柑橘木虱具強致病力的淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)菌株，屬于微生物技術領域。所述菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)ZJPL08，已于2013年3月15日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.7318。本發(fā)明所述的淡紫擬青霉ZJPL08對柑橘木虱具有更強的致病力，可被開發(fā)為生防菌制劑用于對柑橘木虱的生物防治，較目前防治柑橘木虱的化學藥劑相比，具有高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性的特征。菌株ZJPL08較其他淡紫擬青霉菌株對柑橘木虱有更強的作用效果，菌株ZJPL08培養(yǎng)快，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高，易于制備，具有良好的市場應用前景。
文檔編號C12N1/14GK103160442SQ20131011753
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月7日 優(yōu)先權日2013年4月7日
發(fā)明者鹿連明, 杜丹超, 蒲占湑, 胡秀榮, 陳國慶 申請人:浙江省柑桔研究所