專利名稱：一種棗實蠅快速鑒定的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于檢疫性害蟲檢測領域，具體的，本發(fā)明涉及一種檢疫性害蟲棗實蠅的檢測技術領域。
背景技術：
率實蜆(Carpomya vesuviana Costa)是一種入侵重大檢疫性害蟲，屬雙翅目Diptera 實妮科 Tephritidae 實妮亞科 Trypetinae 實妮族 Trypetini 咔實妮屬 CarpomyaCosta，原產(chǎn)于印度，是棗屬植物的重要蛀果害蟲，被列入我國“進境植物檢疫性有害生物名錄”。2007年首次在新疆吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市發(fā)現(xiàn)，發(fā)生面積為1029.42hm2，導致果實產(chǎn)量及品質(zhì)下降，喪失其經(jīng)濟價值，且造成的落果率高達70_90%，銷毀有蟲棗果2233.8t，對該地區(qū)I的棗果業(yè)造成了毀滅性的危害，嚴重影響農(nóng)民種植紅棗的積極性，農(nóng)林外來入侵生物的傳入給農(nóng)林產(chǎn)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。率實蜆(Carpomya vesuviana Costa)害蟲主要以幼蟲姓食果肉，成蟲不危害率果，通?？稍斐傻漠a(chǎn)量損失高達20%以上，發(fā)生嚴重的可以導致全部棗果受到危害，從而嚴重影響到紅棗的產(chǎn)品質(zhì)量及其整體的商品價值。隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，無論是國內(nèi)地區(qū)間還是國際間的商業(yè)貿(mào)易與人員往來都日漸頻繁，實蠅的擴散幾率也越來越高。棗實蠅的入侵可能對我國棗產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成毀滅性危害，棗實蠅目前主要分布在意大利、高加索、毛里求斯、巴基斯坦、泰國、阿富汗等國家，在中國僅分布在新疆的吐魯番地區(qū)，且疫情有向其它地區(qū)擴散的趨勢?？梢?，當前最大的問題如何實現(xiàn)棗實蠅的快速檢測鑒定。迄今為止，實蠅類害蟲的種的鑒定主要依據(jù)成蟲的形態(tài)特征，而卵、幼蟲、蛹由于其特征差異小，且有些特征在其不同的發(fā)育時期不夠穩(wěn)定，因此依據(jù)形態(tài)學鑒定方法很難保證鑒定的準確度。即使棗實蠅的幼蟲能依據(jù)形態(tài)學進行鑒定，但很大程度上依賴鑒定人員豐富的鑒定經(jīng)驗，這就制約了不同地區(qū)相關工作的進一步開展。在口岸檢疫工作中，通常要將幼蟲培養(yǎng)到成蟲再進行鑒定，整個檢疫鑒定過程時間長達數(shù)周，無法適應實際工作需要。顯然，僅僅依靠形態(tài)學分析進行實蠅的系統(tǒng)發(fā)育關系與種類鑒定的研究，不能與日益增長的水果蔬菜貿(mào)易發(fā)展相協(xié)調(diào)，也不利于建立一個高效快速的檢`疫性實蠅的檢測技術體系。從而造成檢疫和防控工作具有相當大的困難。因此，非常有必要研究棗實蠅快速鑒定的新方法，特別是棗實蠅幼蟲、蛹等未成熟蟲態(tài)的快速鑒定方法。目前，檢驗檢疫部門對棗實蠅的鑒定主要以成蟲的外部形態(tài)特征作為依據(jù)。但是，截獲的往往是卵、幼蟲或蛹等蟲態(tài)，傳統(tǒng)方法是對其進行室內(nèi)飼養(yǎng)，待成蟲羽化后再進行鑒定，這需要5d-15d的檢測周期，無法適應檢驗檢疫的快速驗放要求。在檢疫截獲未成熟蟲態(tài)(幼蟲或蛹)的幾率較大，一般情況下室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲大約需5d-15d左右的時間，檢測周期較長，不能滿足貿(mào)易性果蔬現(xiàn)場檢疫快速通關的需求，因此利用分子生物學技術快速檢疫鑒定害蟲種類已成為趨勢
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中未見報道專門針對檢疫性害蟲棗實蠅的檢測的技術現(xiàn)狀。本發(fā)明為了提供了一種針對棗實蠅的快速鑒定方法，能夠準確及時對截獲的疑似棗實蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及殘體等進行鑒定。本發(fā)明的技術方案:本發(fā)明首次應用分子生物學方法對吐魯番棗實蠅幼蟲、蛹、成蟲等mtDNA COI基因序列進行DNA檢測分析，采用形態(tài)學觀察與PCR技術相結(jié)合的方法對新疆吐魯番地區(qū)的率實蠅Carpomya vesuviana Costa幼蟲、蛹、成蟲等進行快速鑒定；最終首次測出棗實蠅mtDNA COI基因序列，并且設計出一對棗實蠅COI特異性引物，同時通過形態(tài)學鑒定確認的七種實蠅標本進行驗證，證實本發(fā)明提供的棗實蠅快速鑒定的方法具有普遍性，為檢驗檢疫部門提供非常快捷實用的方法。本發(fā)明具體提供了一種針對棗實蠅快速鑒定的方法，其具體步驟如下:
(I)棗實蠅形態(tài)鑒定:對棗實蠅幼蟲和蛹進行形態(tài)學觀察，解剖鏡下觀察幼蟲的頭部特征、氣門形狀、尾部特征，蛹的氣門特征等，并進行拍照，同時對多余的幼蟲和蛹進行室內(nèi)培養(yǎng)；棗實蠅標本的鑒定根據(jù)棗實蠅的形態(tài)學特征，用體式顯微鏡觀察各鑒定部位包括頭部、復眼、喙、中胸背板、翅脈、臀條、腹部、雌雄蟲生殖器、根據(jù)外部形態(tài)進行鑒定，從而確定所用的材料均為棗實蠅。(2)選用棗實蠅的標本，采用試劑盒推薦的方法來提取基因組DNA和測序:取四頭率實蠅的蛹放入冰浴預冷的收集管(collection Tube)中,用研磨棒快速研磨成糊狀,加入350 ii I的SolutionA和0.9 y I的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成勻衆(zhòng)，再加入350 ii I的Solution A將研磨棒上的勻衆(zhòng)沖入collection Tube中，充分振蕩混勻后65°C保溫5min后，加入4iU的試劑B，經(jīng)充分混勻后，加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，充分混合后12000rpm離心3min,除去上面一層清液，再加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，震蕩混合后12000rpm離心2min ;除去上面一層帶有藍色有機相清液，然后將無色下層的水相溶液轉(zhuǎn)置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm離心lmin,除去Filter cup,在濾液中加入DB buffer400 y I并充分混勻，將試劑盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將500 u I的RinseA加入至Spin column中12000rpm離心30sec,除去過濾后剩余的液體；在Spin column中加入700 ii I的RinseB進行離心12000rpm30sec,除去過濾后剩余的液體；試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將Spin column安置于1.5ml的離心管上，靜置幾分鐘，等酒精揮發(fā)完后，將60-100 ii I的滅菌蒸懼水或Elution Buffer在Spin column膜的中央處加入,在室溫條件下放置lmin，經(jīng)12000rpm離心lmin，洗脫DNA。(3) PCR擴增:目標片段PCR擴增的引物分別為Uea7和UealO ;PCR反應體系:PCR擴增在定量梯度PCR儀上進行，反應體系:10mmol/L10XBuffer，0.25mmol/LMg2+,
0.25mmol/LdNTP,上下游引物各 0.2 y mol/L, IUTaq 酶(Takara)，模板 DNAl u L，加水至總體積 25ii L，反應條件為 94°C /5min,95°C /40s, 55°C /30s,72°C /lmin, 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸7min。PCR反映結(jié)束后，分別提取PCR產(chǎn)物5 y L在含溴化已錠的1.5%瓊脂凝膠多功能電泳儀上電泳30min(90V)，數(shù)字圖像分析儀上檢測結(jié)果，觀察擴增帶的大小和寬度。(4)采用試劑盒的方法快速提取實蠅基因組DNA，經(jīng)PCR擴增并測序，利用引物Uea7/Ueal0分別測定了吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市棗實蠅的線粒體DNA細胞色素氧化酶I (COI)從M7至COOH之間約700bp片段序列，共獲得COI基因序列4條片段長度為666bp的序列；將PCR產(chǎn)物基因序列進行比較，即將棗實蠅mtDNACOI基因序列比較分析，將測得的基因序列選用Clustal X多序列對位排列程序進行多序列對位排列可知序列完全相同，并且進行人工校對，將棗實蠅mtDNACOI基因序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210 ;經(jīng)測序比較發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物目的基因序列完全相同，將試驗所得序列與本發(fā)明測出的棗實蠅模式標本基因序列比較分析確定為棗實蠅。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果。(I)本發(fā)明首次應用分子生物學方法對吐魯番棗實蠅幼蟲、蛹、成蟲等mtDNA COI基因序列進行DNA檢測分析，最終首次測出棗實蠅mtDNA COI基因序列，通過對棗實蠅幼蟲、蛹、成蟲等進行形態(tài)鑒定的同時進行了 PCR檢測，6h內(nèi)可對疑似棗實蠅完成檢疫鑒定，不僅適用于棗實蠅成蟲的比較鑒定而且能快速比對鑒定幼蟲、蛹和卵等蟲態(tài)，而且首次將棗實蠅序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210，驗證了分子檢測方法的準確性和可靠性，能夠準確及時對截獲的實蠅幼蟲進行鑒定，供檢驗檢疫部門參考應用。(2)本發(fā)明打破了現(xiàn)有技術常規(guī)僅僅依靠形態(tài)學鑒定棗實蠅的方法，而是建立了從分子方面快速檢測棗實蠅的技術，為檢疫性害蟲棗實蠅的檢疫提供了一種新的方法；本發(fā)明提供建立的分子生物學方法不僅能鑒定實蠅的完整的、活的卵、幼蟲、蛹、成蟲而且能快速鑒定幼蟲、蛹和卵等蟲態(tài)死亡、不完整的各蟲態(tài)蟲體，使實蠅的鑒定從局限的完整成蟲蟲體到不限蟲態(tài)、完整度，大幅度減少檢疫難度，同時鑒定周期從傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定所需時間縮短到5-15d(天)以內(nèi)。


圖1所示為采用引物Uea7和UealO的PCR模板DNA質(zhì)量電泳圖。圖中，M為DL2000DNA Marker ;I為吐魯番市率實妮幼蟲Carpomya vesuviana Costa ;2為吐魯番市率實妮蛹Carpomya vesuviana Costa ;3為鄭善縣率實妮蛹Carpomya vesuviana Costa ;4為托克遜縣率實蜆蛹Carpomya vesuviana Costa ;5為陰性對照。
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圖2為PCR產(chǎn)物目的基因的序列比較圖。圖中，”代表相同的堿基；1為吐魯番市率實妮幼蟲Carpomya vesuviana Costa ;2為吐魯番市率實妮蛹Carpomya vesuvianaCosta ；3為鄭善縣率實妮蛹Carpomya vesuviana Costa ；4為托克遜縣率實妮蛹Carpomyavesuviana Costa。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中設備和材料有:棗實蠅標本分別采自吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市不同地區(qū)地點，試驗的標本用100%酒精浸泡并保存于4°C冰箱。采用棗實蠅對照標準標本采用中國科學院動物所提供。采用的酶及其他試劑:采用的Solution A、SolutionC、RnaseA1、試劑 B、Filtercup、DB buffer、Spin column、RinseA、RinseB 均包含 Takara 試劑盒其中，都購自寶生物工程(大連)有限公司，Taq酶、PCR反應體系試劑(dNTP、10 Xbuffer和Mg2+)、瓊脂糖、EB、2000bp Ladder Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。主要儀器:定量梯度PCR儀(Biometra)、高速冷凍離心機(CF16RX II型)、多功能電泳儀、數(shù)字圖像分析儀(Alphal220V型)、核酸蛋白檢測儀、全自動高壓滅菌儀、全溫水浴鍋、超低溫冰箱等。本發(fā)明中選用的所有試劑、儀器及原輔材料都為本領域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一:新疆吐魯番地區(qū)棗實蠅的快速鑒定新疆吐魯番地區(qū)棗實蠅快速鑒定方法的具體步驟如下:(I)棗實蠅形態(tài)鑒定:對棗實蠅幼蟲和蛹進行形態(tài)學觀察，解剖鏡下觀察幼蟲的頭部特征、氣門形狀、尾部特征，蛹的氣門特征等，并進行拍照，同時對多余的幼蟲和蛹進行室內(nèi)培養(yǎng)；棗實蠅標本的鑒定根據(jù)棗實蠅的形態(tài)學特征，用體式顯微鏡觀察各鑒定部位包括頭部、復眼、喙、中胸背板、翅脈、臀條、腹部、雌雄蟲生殖器、根據(jù)外部形態(tài)進行鑒定，從而確定所用的材料均為棗實蠅。(2)選用棗實蠅的標本，采用試劑盒推薦的方法來提取基因組DNA和測序:取四頭率實蠅的蛹放入冰浴預冷的收集管(collection Tube)中,用研磨棒快速研磨成糊狀,加入350 ii I的Solution A和0.9 y I的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成勻衆(zhòng),再加入350 ii I的Solution A將研磨棒上的勻衆(zhòng)沖入collection Tube中，充分振蕩混勻后65°C保溫5min后，加入4iU的試劑B，經(jīng)充分混勻后，加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，充分混合后12000rpm離心3min,除去上面一層清液,再加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，震蕩混合后12000rpm離心2min ;除去上面一層帶有藍色有機相清液，然后將無色下層的水相溶液轉(zhuǎn)置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm離心lmin,除去Filter cup,在濾液中加入DB buffer400 y I并充分混勻，將試劑盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將500 u I的RinseA加入至S pin column中12000rpm離心30sec,除去過濾后剩余的液體；在Spin column中加入700 ii I的RinseB進行離心12000rpm30sec,除去過濾后剩余的液體；試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將Spin column安置于1.5ml的離心管上，靜置幾分鐘，等酒精揮發(fā)完后，將60-100 ii I的滅菌蒸懼水或Elution Buffer在Spin column膜的中央處加入,在室溫條件下放置lmin，經(jīng)12000rpm離心lmin，洗脫DNA。(3) PCR擴增:目標片段PCR擴增的引物分別為Uea7和UealO ;PCR反應體系:PCR擴增在定量梯度PCR儀上進行，反應體系:10mmol/L10XBuffer，0.25mmol/LMg2+,
0.25mmol/LdNTP,上下游引物各 0.2 y mol/L, IUTaq 酶(Takara)，模板 DNAl u L，加水至總體積 25ii L，反應條件為 94°C /5min,95°C /40s, 55°C /30s,72°C /lmin, 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸7min。PCR反映結(jié)束后，分別提取PCR產(chǎn)物5 y L在含溴化已錠的1.5%瓊脂凝膠多功能電泳儀上電泳30min(90V)，數(shù)字圖像分析儀上檢測結(jié)果，觀察擴增帶的大小和寬度。(4)采用試劑盒的方法快速提取實蠅基因組DNA，經(jīng)PCR擴增并測序，利用引物Uea7/Ueal0分別測定了吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市棗實蠅的線粒體DNA細胞色素氧化酶I (COI)從M7至C00H之間約700bp片段序列，共獲得COI基因序列4條片段長度為666bp的序列；將PCR產(chǎn)物基因序列進行比較，即將棗實蠅mtDNACOI基因序列比較分析，將測得的基因序列選用Clustal X多序列對位排列程序進行多序列對位排列可知序列完全相同，并且進行人工校對，將棗實蠅mtDNACOI基因序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210 ;經(jīng)測序比較發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物目的基因序列完全相同，將試驗所得序列與本發(fā)明測出的棗實蠅模式標本基因序列比較分析確定為棗實蠅。通過上述提供的分子生物學方法對吐魯番棗實蠅幼蟲mtDNACOI基因序列進行DNA檢測分析，最終首次測出棗實蠅mtDNA COI基因序列，通過對棗實蠅幼蟲、蛹進行形態(tài)鑒定的同時進行了 PCR檢測，6h內(nèi)可完成檢疫鑒定，不僅適用于棗實蠅成蟲的比較鑒定而且能快速比對鑒定幼蟲、蛹和卵等蟲態(tài)，而且首次將棗實蠅序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210，驗證了分子檢測方法的準確性和可靠性，能夠準確及時對截獲的實蠅幼蟲進行鑒定，供檢驗檢疫部門參考應用。上述提供的新疆吐魯番地區(qū)棗實蠅快速鑒定方法，不僅能鑒定實蠅的成蟲而且能快速鑒定幼蟲、蛹和卵等蟲態(tài)，使實蠅的鑒定周期從傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定所需20天時間縮短到一天以內(nèi)，這也是首次從分角度鑒定棗實蠅，在植物檢疫檢疫性實蠅的日常鑒定中有極大的優(yōu)勢。實施例二:棗實蠅的形態(tài)鑒定對棗實蠅幼蟲和蛹進行形態(tài)學觀察，解剖鏡下觀察幼蟲的頭部特征、氣門形狀、尾部特征，蛹的氣門特征等，并進行拍照，同時對多余的幼蟲和蛹進行室內(nèi)培養(yǎng)。棗實蠅標本的鑒定根據(jù)棗實蠅的形態(tài)學特征，用體式顯微鏡觀察各鑒定部位包括頭部、復眼、喙、中胸背板、翅脈、臀條、腹部、雌雄蟲生殖器、根據(jù)《實蠅類重要害蟲鑒定圖冊》外部形態(tài)進行鑒定，從而確定本發(fā)明所用的材料均為棗實蠅。實施例三:采用實蠅模式標本試劑盒的方法來提取棗實蠅基因組DNA取四頭率實蜆的蛹放入冰浴預冷的收集管(collection Tube)中，用研磨棒快速研磨成糊狀，加入350 ii I的Solution A和0.9 y I的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成勻衆(zhòng)，再加入350ii I的Solution A將研磨棒上的勻衆(zhòng)沖入collection Tube中，充分振蕩混勻后65°C保溫5min后，加入4 U I的試劑B，經(jīng)充分混勻后，加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC,充分混合后12000rpm離心3min,除去上面一層清液,再加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC,震蕩混合后12000rpm離心2min ;除去上面一層帶有藍色有機相清液，然后將無色下層的水相溶液轉(zhuǎn)置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm離心lmin,除去Filter cup，在濾液中加入DB buffer400 u I并充分混勻,將試劑盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將500 ii I的RinseA加入至Spin column中12000rpm離心30sec,除去過濾后剩余的液體；在Spin column中加入700 ii I的RinseB進行離心12000rpm30sec,除去過濾后剩余的液體；試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將Spin column安置于1.5ml的離心管上，靜置幾分鐘，等酒精揮發(fā)完后，將60-100 ii I的滅菌蒸懼水或Elution Buffer在Spin column膜的中央處加入，在室溫條件下放置lmin,經(jīng)12000rpm離心lmin,洗脫DNA。上述步驟中，因為上層(有機相)帶有藍色，必須除盡。為了防止DNA結(jié)合到DNA制備膜上，不必考慮相間沉淀，在過濾時將會被去除。上述步驟中，請確認是否已將指定體積的無水乙醇加入RinseB中。加入時應沿著Spin column管壁四周，這樣可以完全將粘附在管壁上的鹽分沖洗干凈。上述步驟中，應將Elution Buffer或者滅菌后的蒸懼水加熱至65°C,這樣使用時有利于提聞洗脫效率。實施例四:PCR擴增、產(chǎn)物純化對模式標本基因組DNA進行PCR擴增，其擴增引物和測序引物:目標片段PCR擴增的引物分別為Uea7和UealO。PCR反應體系:PCR擴增在定量梯度PCR儀上進行，反應體系:IOmmol/LlO X Buffer，0.25mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，上下游引物各 0.2 y mol/L, IUTaq 酶(Takara)，模板DNAl u L，加水至總體積25 y L，反應條件為94 °C /5min, 95 V /40s,55°C /30s，72。。/lmin，30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR反映結(jié)束后，分別提取PCR產(chǎn)物5 ii L在含溴化已錠的1.5 %瓊脂凝膠多功能電泳儀上電泳30min (90V)，數(shù)字圖像分析儀上檢測結(jié)果，觀察擴增帶的大小和寬度，確切的DNA濃度通過核酸蛋白檢測儀測定。PCR擴增結(jié)果:PCR反應結(jié)束后，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，棗實蠅模板DNA擴增結(jié)果中可以看出500-750bp之間大約700bp目標片段的位置有一條擴增帶，亮度差異表示模板濃度的差異，DNA確切濃度和純度通過核酸蛋白檢測儀來測定，參見附圖1。將50 ii L的DNA樣品用含溴化已錠的1.5%瓊脂凝膠上電泳30min(90V)電泳分離，電泳緩沖體系為TBE，回收700bp片段DNA。實施例五:測序及分子鑒定COI基因組成:分別對已測定的4條序列的COI基因蛋白編碼區(qū)第I位-666位點666bp進行排列，3個不同地方的棗實蠅COI基因序列堿基T、C、A、G的含量均為38.6%，14.6%, 32.6%, 14.3%, A+T 含量為 71.2% 0序列比較:利用引物Uea7/Ueal0分別測定了吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市棗實蠅的線粒體DNA細胞色素氧化酶I (COI)從M7至COOH之間約700bp片段序列，共獲得COI基因序列4條片段長度為666bp的序列；將PCR產(chǎn)物基因序列進行比較，即將棗實蠅mtDNACOI基因序列比較分析，將測得的基因序列選用Clustal X多序列對位排列程序進行多序列對位排列，參見附圖2可知四者的序列完全相同，并且進行人工校對，將棗實蠅mtDNACOI基因序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210。具體引用的序列引物和序列可參見附后提供的SEQUENCE LISTING (序列表)。引物采用2對引物分別為UEA7/UEA10和UEA7/UEA10，其中can_F和can_R用于質(zhì)量檢測，UEA7和UEAlO用于目標片段擴增，見表I。表1:PCR引物(從5’到3’端)
引物名稱 I引物序列
can-FAAGAGCGACGGGCGATG
can-RCTAGGATTAGATACCCTATT
UEA7TACAGTTGGAATAGACGTTGATAC
LJEAlOTCCAATGCACTAATCTGCCATATTA
由表I可知四者的序列完全相同，證明了本發(fā)明提供的棗實蠅快速鑒定的方法不受蟲態(tài)和地理來源的限 制，具有普遍性的實用性。
權(quán)利要求
1.一種棗實蠅快速鑒定的方法，其特征在于，具體鑒定方法步驟如下: (1)棗實蠅形態(tài)鑒定:對棗實蠅幼蟲和蛹進行形態(tài)學觀察，解剖鏡下觀察幼蟲的頭部特征、氣門形狀、尾部特征，蛹的氣門特征等，并進行拍照，同時對多余的幼蟲和蛹進行室內(nèi)培養(yǎng)；棗實蠅標本的鑒定根據(jù)棗實蠅的形態(tài)學特征，用體式顯微鏡觀察各鑒定部位包括頭部、復眼、喙、中胸背板、翅脈、臀條、腹部、雌雄蟲生殖器、根據(jù)外部形態(tài)進行鑒定，從而確定所用的材料均為棗實蠅； (2)選用棗實蠅的標本，采用試劑盒推薦的方法來提取基因組DNA和測序:取四頭棗實蠅的蛹放入冰浴預冷的收集管(collection Tube)中，用研磨棒快速研磨成糊狀,加入·350 ii I的SolutionA和0.9 y I的RnaseAI后用研磨棒加速研磨成勻衆(zhòng)，再加入350 ii I的Solution A將研磨棒上的勻衆(zhòng)沖入collection Tube中，充分振蕩混勻后65°C保溫5min后，加入4iU的試劑B，經(jīng)充分混勻后，加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，充分混合后12000rpm離心3min,除去上面一層清液,再加入Iml事先在4°C冰箱里預冷的溶液SolutionC，震蕩混合后12000rpm離心2min ;除去上面一層帶有藍色有機相清液，然后將無色下層的水相溶液轉(zhuǎn)置于collection Tube上面的Filter cup中，12000rpm離心lmin,除去Filter cup,在濾液中加入DB buffer400 y I并充分混勻，將試劑盒中的Spin column安放于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將·500 u I的RinseA加入至Spin c·olumn中12000rpm離心30sec,除去過濾后剩余的液體；在Spin column中加入700 ii I的RinseB進行離·心12000rpm30sec,除去過濾后剩余的液體；試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上，12000rpm離心lmin,除去過濾后剩余的液體；將Spin column安置于1.5ml的離心管上，靜置幾分鐘，等酒精揮發(fā)完后，將·60-100 ii I的滅菌蒸懼水或Elution Buffer在Spin column膜的中央處加入,在室溫條件下放置lmin,經(jīng)12000rpm離心lmin，洗脫DNA ； (3)PCR擴增:目標片段PCR擴增的引物分別為Uea7和UealO ;PCR反應體系:PCR擴增在定量梯度 PCR 儀上進行，反應體系:10mmol/L10 XBuffer，0.25mmol/LMg2+, 0.25mmol/LdNTP，上下游引物各0.2u mol/L, IUTaq酶(Takara)，模板DNAl U L，加水至總體積25 U L，反應條件為 940C /5min,95°C /40s, 55°C /30s，72。。/lmin, 30 個循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。PCR反映結(jié)束后，分別提取PCR產(chǎn)物5 ii L在含溴化已錠的1.5%瓊脂凝膠多功能電泳儀上電泳30min(90V)，數(shù)字圖像分析儀上檢測結(jié)果，觀察擴增帶的大小和寬度； (4)采用試劑盒的方法快速提取實蠅基因組DNA，經(jīng)PCR擴增并測序，利用引物Uea7/UealO分別測定了吐魯番地區(qū)的鄯善縣，托克遜縣及吐魯番市棗實蠅的線粒體DNA細胞色素氧化酶I (COI)從M7至C00H之間約700bp片段序列，共獲得COI基因序列4條片段長度為666bp的序列；將PCR產(chǎn)物基因序列進行比較，即將棗實蠅mtDNACOI基因序列比較分析，將測得的基因序列選用Clustal X多序列對位排列程序進行多序列對位排列可知序列完全相同，并且進行人工校對，將棗實蠅mtDNACOI基因序列錄入GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HQ687210 ;經(jīng)測序比較發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物目的基因序列完全相同，將試驗所得序列與測出的棗實蠅模式標本基因序列比較分析確定為棗實蠅。
全文摘要
本發(fā)明公開一種棗實蠅快速鑒定的方法，通過首次應用分子生物學方法對吐魯番棗實蠅幼蟲mtDNA COI基因序列進行DNA檢測分析，采用形態(tài)學觀察與PCR技術相結(jié)合的方法對棗實蠅Carpomya vesuviana Costa幼蟲和蛹進行快速鑒定；最終首次測出棗實蠅mtDNA COI基因序列，同時證實本發(fā)明提供的棗實蠅快速鑒定的方法具有普遍性，為檢驗檢疫部門提供非?？旖輰嵱玫姆椒ǎ哂袕V泛的實用性。
文檔編號C12Q1/68GK103184292SQ20131012189
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者程曉甜, 張偉, 阿地力·沙塔爾 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學