專利名稱：一種高通量微生物鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物鑒定方法，尤其涉及基于PCR、蛋白純化和高分辨串聯(lián) 質(zhì)譜技術的高通量具有DNA、 RNA或蛋白質(zhì)等遺傳物質(zhì)的微生物鑒定方法。
背景技術：
微生物傳統(tǒng)的鑒定方法是建立在微生物的形態(tài)學、生態(tài)學、細胞生理和
生化以及基因的基礎上的，主要包括以下幾類生化方法、免疫學技術、分 子生物學及分子遺傳學方法、生物傳感器、色譜技術。
上述方法都有速度慢、不適于大規(guī)模篩查鑒定的特點。它們僅僅能夠鑒 定事先假定存在于樣品中的病原微生物。
目前，沒有一種方法在不經(jīng)過培養(yǎng)或利用特異生物體檢測的前提下，就 能夠高通量的鑒定在一個樣品中可能包含的1000多種病原體；也沒有任何系 統(tǒng)有能力對一個單個樣品中的全部細菌和病毒基因組作平行分、定量和鑒 定。
目前，有美國皿S公司的"Triangulation Identification for the Genetic Evaluation of Risks (TIGER)"系統(tǒng)，可以對遺傳物質(zhì)為DNA和RNA 的病原體做高通量鑒定，而對以蛋白質(zhì)為遺傳物質(zhì)的微生物則無能為力。國 內(nèi)也尚無成熟技術和裝置的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明提出了一種高通量微生物鑒定方 法，包括以下步驟-
(1) 取樣；
(2) 遺傳物質(zhì)提??；
(3) 質(zhì)譜分析；(4)數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。 步驟(2)中所述的遺傳物質(zhì)是DNA或RNA，用核酸抽提試劑盒提取。 步驟(2)中所述的遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，提取后將蛋白質(zhì)純化。 所述的提取物是DNA或RNA，提取后還需要擴增，其擴增步驟為設計通
用引物，進行PCR擴增。
所述的提取物是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)純化后經(jīng)濃縮酶解。 所述的微生物為病原微生物，所提取遺傳物質(zhì)為DNA或RNA遺傳物質(zhì)，
包括以下步驟-
(1) 病原微生物取樣；
(2) DNA或RNA遺傳物質(zhì)提?。?br> (3) 將提取物擴增；
(4) 提取物擴增后脫鹽；
(5) 質(zhì)譜分析；
(6) 數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
所述的微生物為病原微生物，所提取遺傳物質(zhì)為蛋白遺傳物質(zhì)，包括以
下步驟
(1) 病原微生物取樣；
(2) 蛋白遺傳物質(zhì)提取；
(3) 將提取物富集；
(4) 提取物富集后酶解；
(5) 質(zhì)譜分析；
(6) 數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
本發(fā)明的有益之處在于
1、 本發(fā)明的鑒定方法可以廣泛應用，實際上能夠鑒定所有生物體；
2、 能夠同時鑒定數(shù)千種細菌、病毒、真菌和原生動物，而別的系統(tǒng)僅僅 在同一時間只能鑒定很少的傳染性病原體，其發(fā)展將受到數(shù)量限制；
3、 能夠給出一個單一樣品中多個病原體的相對量的多少，而目前大多數(shù) 系統(tǒng)還沒有這個能力；
4、 快速而不需要培養(yǎng)， 一個樣品可在少于4小時的時間內(nèi)被分析，而培
養(yǎng)則需要數(shù)周時間，當然一些樣品根本就不能夠培養(yǎng)；
5、 可分析所有媒介中的環(huán)境或臨床樣品，從空氣到大部分復雜生物樣品， 這使得其非常通用；
6、 不需要測序，對于傳染性病原體的鑒定來說是一個性價比非常好的解 決方案；
7、 質(zhì)譜技術的參與使其具有極高的靈敏度和分辨率；
8、 由于本發(fā)明能夠在不培養(yǎng)病原體的條件下，廣泛、快速的鑒定復雜混 合物中的病原微生物，因此在疾病預防控制中心(CDC)的流行病學調(diào)查，生 物制藥企業(yè)的污染性微生物檢測，醫(yī)院的院內(nèi)感染監(jiān)測和傳染病診斷領域， 以及生物反恐等諸多領域都能發(fā)揮巨大作用。
具體實施例方式
下面結合實施例詳細說明本發(fā)明的技術方案，應理解的是，本發(fā)明不限 于這些實施例。
1、 一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于包括以下步驟
(1) 取樣；
(2) 遺傳物質(zhì)提??；
(3) 質(zhì)譜分析；
(4) 數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
(一) 取樣
流行病學樣品以及直接來源于人類咽拭子、血液、尿液、膿液、土壤和 食物樣品中的微生物。而且，這些樣品絕大多數(shù)是多種微生物的混合物，不 需要純培養(yǎng)。
優(yōu)點節(jié)省時間， 一般微生物得到純培養(yǎng)至少需要過夜，而很多的微生 物比如病毒的培養(yǎng)是一個更加長的周期；還有的根本就是培養(yǎng)不出來的。
(二) 遺傳物質(zhì)提取 1、 DNA或RNA提取
這是一個成熟的技術，借助于一些常見的核酸抽提試劑盒就能輕松完成; 一般推薦用FISHER、 Ambion或是QIAGEN的試劑盒。 核酸PCR擴增(1) 原理
對于目前已經(jīng)有認識的l， 400多種致病病原菌，其核酸序列基本都已經(jīng)知 道；根據(jù)其中的保守序列(比如16sRNA)設計通用引物，通用引物只能與特 異基因兩翼相結合，不可能在全基因組范圍有結合點，而這些保守序列之間 的核酸序列在不同的種之間是有變異的，微生物就是根據(jù)可變序列來區(qū)分的。
通用引物 一般是指某基因外圍保守序列。雖然這個基因可能是序列多 變的，但兩側翼序列則是保守的。利用兩側翼保守序列設計出來的引物，稱 為通用弓l物，文獻上叫Broad-range primer。
PCR反應同時會加入校準物，校準物是已經(jīng)知道序列和分子量的序列，根 據(jù)校準物定量各個病原體的相對含量。
(2) 引物的設計
根據(jù)NCBI基因庫里的信息，可以開發(fā)了很多的檢測試劑盒(assay kits)。 一個檢測試劑盒包括推薦的通用引物組、脫鹽用的磁珠。 2、蛋白提取
提取純化方法很多， 一般推薦GE Healthcare的解決方法。 蛋白濃縮酶解
具有病原微生物特征的蛋白經(jīng)純化后，為提高檢測的靈敏度， 一般應用 離心濃縮、冷凍干燥等方法將蛋白富集。由于蛋白數(shù)據(jù)庫多為串聯(lián)質(zhì)譜檢測 其特征肽段的譜庫，因此需要酶解蛋白。 (三)質(zhì)譜分析
質(zhì)譜分析得到的原始數(shù)據(jù)是擴增產(chǎn)物或酶解肽段的準確分子量，要求誤 差不大于25ppm，由準確的分子量就能夠計算出該擴增產(chǎn)物的堿基組成，就是 A、 T、 G、 C的個數(shù)或蛋白質(zhì)的種類。在數(shù)據(jù)庫里，將有1400多種微生物 的堿基、蛋白序列的原始數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫是以美國國家生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)開發(fā)的核酸序 列數(shù)據(jù)庫(GenBank)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Nr)為基礎的。
(四)數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定
通過數(shù)據(jù)的分析，系統(tǒng)能告訴研究者如下的信息 1 、你所分析的樣品里有哪些微生物種類---鑒定微生物;
2、某一種微生物的其他詳細信息---藥物抗性或室毒力因子；
3 、建立自己研究范圍內(nèi)的微生物數(shù)據(jù)庫----方便以后檢測和使用的方便。
實施例1:提取物為DNA或RNA的高通量微生物鑒定方法 (l)取樣
從培養(yǎng)的細菌中提取DNA，在培養(yǎng)物的0D值達到0. 2左右時，約50微升 的培養(yǎng)物被轉移到300微升的ATL緩沖液中(Qiagen公司)進行預處理。 (2)遺傳物質(zhì)提取
用Qiagen公司的DNeasy Tissue試劑盒進行基因提取，按操作說明操作 即可。
(3)擴增
細菌檢測過程中的PCR條件為50微升反應體積，于96孔PCR反應板中 進行。PCR反應組成為4 ul， IXbuffer II (Applied Biosystems， Foster City, CA)， 1.5mM氯化鎂，0. 4M三甲銨乙內(nèi)酯，800uM dNTP混和物及每種 引物250nM?；旌臀镉?5。C下IO分鐘，循環(huán)反應條件為95°C， 30分鐘，48 °C, 30分鐘，72°C， 30分鐘，每8個循環(huán)后，退火溫度提高0.9t:。然后進 行37個附加循環(huán)，95°C， 15分鐘；56°C， 20分鐘；72°C， 20分鐘。
擴增引物可以選用
所有細菌5' AACTGGAGGAAGGTGGGGA 3， 5， AGGAGGTGATCCAACCGCA 3， 革蘭氏陰性細菌5' GCATCAGGTCAAGTCATC 3，
5， CCCGGCTTCGTATTCACC 3， 革蘭氏陽性細菌5， GCATCAGGTCAAGTCATC 3，
5， GGCTTCTGCTGTTACAAA 3， 還可以是其它引物。
在所有的PCR反應中可以通過加入內(nèi)標來進行定量分析。加入的內(nèi)標質(zhì) 粒的序列與所需測的關鍵微生物相近，但內(nèi)標序列內(nèi)部的堿基被部分剔除， 使得內(nèi)標的分子量與數(shù)據(jù)庫中所有微生物目標片段的分子量有所區(qū)別。 (4) 脫鹽
PCR擴增之后的產(chǎn)物采用陽離子交換的方法進行脫鹽，擴增物被吸附于陽 離子交換樹脂上，用含有可揮發(fā)鹽類(40 mM碳酸氫銨)和有機溶劑(20% 甲醇)清洗樹脂，以除去可能在隨后的質(zhì)譜分析中引起干擾的未消耗的dNTP， 鹽類及其它小分子物質(zhì)。
(5) 質(zhì)譜檢測、分析
用自動進樣器從96孔板上經(jīng)定量環(huán)直接吸取樣品10微升。樣品以100 微升/小時的流速進入ESI源。在ESI源中，樣品溶液經(jīng)由電場形成帶電霧滴， 在電場作用下運動，并在脫溶劑氣的共同作用在去溶劑，形成帶點離子。離 子進入飛行管道，經(jīng)微通道板(MCP)信號放大后，在工作站上得到檢測結果。 為了提高信噪比和分析的速度(<1分鐘/質(zhì)譜樣)，需優(yōu)化檢測過程中的諸多 質(zhì)譜參數(shù)。
在進樣前，用高流速的緩沖液沖洗傳輸線路和噴霧針頭，以免樣品的交 叉污染。清洗完以后，自動進樣器進樣，并切換到低流速。在短暫的平衡延 時以后，開始進行數(shù)據(jù)采集。在譜圖進行采集時，自動進樣器繼續(xù)傳輸線路 和對進樣口進行沖洗。 一般地，兩次對進樣針的清洗和一次對進樣口的清洗 就可以使樣品交叉達到最小化。在一些操作流程中，可以達到每100秒進一 個樣品。而在采用了快速清洗步驟較短的采集時間后，質(zhì)譜可以在不到一分 鐘內(nèi)檢測完一個樣品。
(6) 數(shù)據(jù)分析
在細菌檢測中，應用通用引物擴增出不同的基因片段，通過質(zhì)譜測得其 分子量相近的正鏈和負鏈DNA片段，平均測量誤差在2ppm。
應用計算機對堿基組成進行擬合，將雙鏈組成進行配對分析以后，即使 在測量誤達到20ppm的情況下，能夠完全匹配的組成卻是唯一的。因此，在 誤差小于20ppm時，完全能夠通過核酸的分子量來分析確定其組成。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)的獲得及譜圖數(shù)據(jù)的保存可以應用儀器廠商提供的數(shù)據(jù)采集和 存儲軟件來實現(xiàn)。
由于質(zhì)譜檢測的是產(chǎn)物序列的質(zhì)量信息，它與已有病原微生物特征序列 數(shù)據(jù)庫進行比對需要一個橋梁。DNA雙鏈存在互補配對的原則，由準確的分子
量就能夠計算出該擴增產(chǎn)物的堿基組成(就是A、 T、 G、 C的個數(shù))，單個 A、 T、 G、 C的質(zhì)量是已知的。檢測出來的順義鏈和反義鏈質(zhì)量數(shù)，在誤 差一定的情況下，經(jīng)過軟件運算，可以得到A、 T、 G、 C四種堿基各自的 系數(shù)w、 x、 y、 z。 Aw、 Tx、 Gy和Cz相加的結果與數(shù)據(jù)庫中保存的該物 種特異序列質(zhì)量數(shù)信息比對在誤差范圍內(nèi)，即可證明物種的存在。
由于以上核酸提取儀、PCR儀、自動化脫鹽儀、質(zhì)譜儀等實驗設備均為成 熟儀器，能夠整合在如Beckman BRT等自動化工作平臺上，實現(xiàn)實驗室全程 的自動化操作。所有設備都有其標準操作規(guī)程(S0P)，并能在自動化平臺上 協(xié)同工作。在半自動操作時，核酸提取耗時約60分鐘、PCR過程需120分鐘、 脫鹽程序需20分鐘、質(zhì)譜檢測每個樣品小于1分鐘、數(shù)據(jù)分析5分鐘，在加 上過程中對儀器的調(diào)試時間，每次樣品分析全過程小于4小時。因此在全自 動化工作平臺上，所有實驗室條件均已優(yōu)化的前提下，實驗耗時將會更少。
實施例2:提取物為蛋白的高通量微生物鑒定方法
(1) 取樣
樣品可來源于咽拭子、血液、尿液、膿液、土壤和食物等各種媒介，經(jīng) 保護液融解或稀釋后，根據(jù)吸附柱柱容量的大小和溶液的粘稠度決定上樣的 大小。
(2) 遺傳物質(zhì)提取、純化
由于應用親和層析的原理，進行樣品的采集。在吸附柱中含有能夠吸附 病原體蛋白質(zhì)的特異性抗體，抗體的種類是可以根據(jù)目標物的多少而改變。 吸附樣品后的層析柱，經(jīng)過洗滌液沖洗去除殘留的雜質(zhì)。
(3) 富集
再由洗脫液將特異性蛋白質(zhì)從吸附柱上洗脫，收集后為提高檢測的靈敏 度， 一般應用離心濃縮、冷凍干燥等方法將蛋白富集。
(4) 酶解
由于蛋白數(shù)據(jù)庫多為串聯(lián)質(zhì)譜檢測其特征肽段的譜庫，因此需要酶解蛋 白。酶解的方法有多種，人工的方法時間較慢，自動酶解時間較快。該步驟 為蛋白技術路線的瓶頸，在自動化酶解的前提下一個樣品可在4小時內(nèi)完成分析。
(5) 質(zhì)譜檢測
優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)后(調(diào)節(jié)脫溶劑氣流量，毛細管電壓和錐孔電壓的大小)， 樣品可以直接進樣。
(6) 數(shù)據(jù)分析
根據(jù)質(zhì)譜信息，設定相關條件后比對數(shù)據(jù)庫(Nr)數(shù)據(jù)，得到最終結果。
在公共突發(fā)衛(wèi)生事件或遭遇生物攻擊之后，早一分鐘得到確切結果，就 可能挽救眾多的生命。目前，國際上微生物來源追蹤依然依賴于生物基礎數(shù) 據(jù)庫的建立，數(shù)據(jù)庫中的信息是來源歸因的重要依據(jù)，有可能區(qū)分基因工程 菌株和自然發(fā)生的菌株。該技術能夠于生理生化表形分析，序列分析，微陣 列技術等方法共同采用，以避免實驗誤差、重組突變等引起的錯誤鑒定。
實施過程中，根據(jù)病原體的特征，在Genbank中査得其看家基因序列， 人工合成該序列，并經(jīng)過儀器檢測，完成理論數(shù)據(jù)庫。再由實際樣品，應用 通用引物擴增該種病原體的特征序列，經(jīng)儀器測定后與理論數(shù)據(jù)庫比對數(shù)據(jù) 的一致性，結果驗證無誤后得到實際數(shù)據(jù)庫。該實際數(shù)據(jù)庫在應用過程中， 與樣品吻合度達97%，能夠滿足鑒定的要求。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能 從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保 護范圍。
序列表
SE0 ID NO 1:
19 aactggagga aggtgggga
SEQ ID NO 2:
19 aggaggtgat ccaaccgca
SEQ ID NO 3:
18 gcatcaggtc aagtcatc
SEQ ID NO 4:
18 cccggcttcg tattcacc
SEQ ID NO 5:
18 gcatcaggtc aagtcatc
SEQ ID NO 6:
18 ggcttctgct gttacaaa
權利要求
1、一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于包括以下步驟(1)取樣；(2)遺傳物質(zhì)提??；(3)質(zhì)譜分析；(4)數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于 步驟(2)中所述的遺傳物質(zhì)是DNA或RNA，用核酸抽提試劑盒提取。
3、 根據(jù)權利要求1所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于 步驟(2)中所述的遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，提取后將蛋白質(zhì)純化。
4、 根據(jù)權利要求1或2所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在 于所述的提取物是DNA或RNA，提取后還需要擴增，其擴增步驟為設 計通用引物，進行PCR擴增。
5、 根據(jù)權利要求1或3所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在 于所述的提取物是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)純化后經(jīng)濃縮酶解。
6、 根據(jù)權利要求1所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于所述的微生物為病原微生物，所提取遺傳物質(zhì)為DNA或RNA遺傳物質(zhì)，包括以下步驟(1) 病原微生物取樣；(2) DNA或RNA遺傳物質(zhì)提??；(3) 將提取物擴增；(4) 提取物擴增后脫鹽；(5) 質(zhì)譜分析；(6) 數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
7、 根據(jù)權利要求1所述的一種高通量微生物鑒定方法，其特征在于-所述的微生物為病原微生物，所提取遺傳物質(zhì)為蛋白遺傳物質(zhì)，包括以下步驟(1) 病原微生物取樣；(2) 蛋白遺傳物質(zhì)提??；(3) 將提取物富集； (4) 提取物富集后酶解；(5) 質(zhì)譜分析；(6) 數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量微生物鑒定方法，包括以下步驟取樣；遺傳物質(zhì)提?。毁|(zhì)譜分析；數(shù)據(jù)分析和微生物鑒定。本發(fā)明具有以下有益效果能夠同時鑒定數(shù)千種細菌、病毒、真菌和原生動物，而別的系統(tǒng)僅僅在同一時間只能鑒定很少的傳染性病原體，其發(fā)展將受到數(shù)量限制；能夠給出一個單一樣品中多個病原體的相對量的多少，而目前大多數(shù)系統(tǒng)還沒有這個能力；快速而不需要培養(yǎng)，一個樣品可在少于4小時的時間內(nèi)被分析，而培養(yǎng)則需要數(shù)周時間，當然一些樣品根本就不能夠培養(yǎng)；可分析所有媒介中的環(huán)境或臨床樣品，從空氣到大部分復雜生物樣品，這使得其非常通用；不需要測序，對于傳染性病原體的鑒定來說是一個性價比非常好的解決方案。
文檔編號G01N27/64GK101363056SQ200810120759
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權日2008年9月11日
發(fā)明者婷 張, 威 徐, 李蘭娟, 晴 解, 賈曉飛, 陳云波, 魯海峰 申請人:浙江大學