專利名稱：一種優(yōu)秀冰雪運動員eb病毒轉(zhuǎn)化b淋巴細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種優(yōu)秀冰雪運動員永生細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，即通過EB病毒轉(zhuǎn)化優(yōu)秀冰雪運動員B淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞株的方法，屬于體育科學(xué)、人類資源學(xué)和人類細(xì)胞生物學(xué)交叉學(xué)科和領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類遺傳資源包括人類基因組DNA，它是重要的遺傳物質(zhì)。用EB病毒(Epstein-Barr Virus)轉(zhuǎn)化人外周血B淋巴細(xì)胞,使其成為一種能連續(xù)分裂、永久生存的類淋巴母細(xì)胞株。細(xì)胞株(Cell strain)是指通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物。而永生化(immorlization)目前尚無公認(rèn)的明確概念，一般認(rèn)為是體外培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或外界因素的影響而從增殖危機中逃逸，從而具有無限增殖能力的過程。自發(fā)性永生化的機率非常小，嚙齒類動物細(xì)胞為10_5 10_6，而人類細(xì)胞則更罕見，小于10_12。因此，學(xué)者們通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因轉(zhuǎn)人目的細(xì)胞內(nèi)，以增加永生化的發(fā)生率，進(jìn)而建立永生化細(xì)胞株。這樣建立的永久性類淋巴母細(xì)胞株,即永生細(xì)胞株。每一永生細(xì)胞株保存了原來提供血樣的個體的完整的基因組。作為人類遺傳資源的一部分，運動基因遺傳資源是人類寶貴的財富，但是由于運動基因遺傳資源僅存在于運動員個體的局限性，如果對優(yōu)秀的運動員不采取保護性的基因保存工作，任其退役后運動 能力逐漸消退直至死亡，無疑是我國體育事業(yè)的巨大損失。因此，在人類還沒有更合理科學(xué)的開發(fā)利用運動基因遺傳資源之前，有效地保存并對其進(jìn)行必要的研究就顯得尤其重要。運動基因遺傳資源，與運動能力的開發(fā)有著密切的聯(lián)系，隨著人類基因組計劃的完善，越來越多的運動基因被發(fā)現(xiàn)，對其功能的研究也將更加深入。鑒于此，就需要一種便捷，高效，穩(wěn)定的方法對運動基因遺傳資源進(jìn)行保存。由于我國對外周血及細(xì)胞樣本的保存缺乏良好的方法，無法做進(jìn)一步研究，造成我國重大優(yōu)秀運動基因資源的浪費。近年來，應(yīng)用病毒基因的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞永生化(immortalization)是建立連續(xù)傳代、性狀穩(wěn)定的細(xì)胞株的較好方法，可以無限提供細(xì)胞來源，有利于運動基因機制的研究。迄今為止，最能代表世界頂尖運動員身體素質(zhì)基因的極少數(shù)群體，才有可能成為世界冠軍。人類遺傳資源是人類進(jìn)行自身探索與研究不可替代的重要資源，而優(yōu)秀冰雪運動員永生細(xì)胞庫的建立就是為了可以永久的保存全人類中最杰出運動員與身體素質(zhì)相關(guān)的基因資源。同時也為解決以往實驗研究的接力式進(jìn)行與標(biāo)本的暫時性采集中存在的矛盾，以便有效的對同一研究對象進(jìn)行持久的連續(xù)性研究。正常組織來源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可生長和分裂，但經(jīng)過有限次的細(xì)胞傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡。這就限制了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。而生殖細(xì)胞、(胚胎)干細(xì)胞、部分腫瘤細(xì)胞和外源性基因轉(zhuǎn)化而構(gòu)建的永生化細(xì)胞則具有無限分裂和增殖的能力，即為永生化細(xì)胞。因此，學(xué)者們提出建立永生化細(xì)胞株，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無限增殖能力且細(xì)胞間無差異。細(xì)胞永生化技術(shù)發(fā)展到今天已有了長足的進(jìn)步，EB病毒、SV40病毒都是永生化細(xì)胞常用的轉(zhuǎn)化病毒，而如乳頭瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV)雖不是使細(xì)胞永生的常用病毒，但它們可以使一些特殊細(xì)胞的增殖能力加強。在眾多轉(zhuǎn)化體外細(xì)胞使其永生化的方法技術(shù)中，常以采集樣本方便，病毒轉(zhuǎn)化永生化細(xì)胞率高，操作周期短的EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞系，為保存優(yōu)秀運動員基因，研究影響運動能力基因的最合適方法。適合于體外大規(guī)模化細(xì)胞的培養(yǎng)。因此建立永生化細(xì)胞株以采用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞為佳。ER病毒轉(zhuǎn)化優(yōu)秀運動員外周血B淋巴細(xì)胞建立的永生細(xì)胞株讓原本有一定壽命的人體細(xì)胞能夠不間斷地繁殖下去，使各個領(lǐng)域優(yōu)秀運動員的基因得以永久的保存。永生細(xì)胞株的建立不但能夠永久保存相關(guān)個體的基因，而且由于可以為研究各運動項群基因結(jié)構(gòu)差別、探討各運動項群的共同點及之間差別、探索重要抑制運動能力基因在各運動項群中分布特征及遺傳學(xué)意義、建立一系列與耐力、力量、速度性相關(guān)的項群體系細(xì)胞庫、以及基因探針、基因興奮劑等諸多體育科研領(lǐng)域提供源源不斷的細(xì)胞和DNA，所以在體育科學(xué)研究中建立優(yōu)秀運動員的永生細(xì)胞庫必將得到越來越多的重視。對于優(yōu)秀運動員細(xì)胞保藏而言，細(xì)胞生殖及活性均有較高的要求，目前，由于是將外源性病毒、原癌基因等導(dǎo)人目的細(xì)胞，其基因整合是隨機性的，其表達(dá)產(chǎn)物可干擾細(xì)胞內(nèi)生理途徑，發(fā)生非預(yù)期的改變，如失去分化特征和細(xì)胞周期檢查點的控制。同時，通過病毒、原癌基因等轉(zhuǎn)染獲得的是轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非正常細(xì)胞，其表型、核型等可發(fā)生改變，如血清依賴性降低，接觸抑制喪失等。而且，目前所建立的永生化細(xì)胞株，并非全部是“無限增殖”，有的僅渡過了 Ml期而延長了細(xì)胞壽命等。因此，現(xiàn)在急需對其方法改進(jìn)使優(yōu)秀運動員細(xì)胞達(dá)到高細(xì)胞轉(zhuǎn)化率永生化的標(biāo)準(zhǔn)已得到很好的保藏并延續(xù)下去。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供高細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、高細(xì)胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株。本發(fā)明的另一目的在于提供上述永生化細(xì)胞株的培養(yǎng)方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:該優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株具有以下特征:B958細(xì)胞在培養(yǎng)5天左右，細(xì)胞聚集成葡萄球狀的細(xì)胞團，倒置顯微鏡下觀看時細(xì)胞團體積較大，折光性好，培養(yǎng)基的顏色也由原先的淺紅色變?yōu)辄S色，細(xì)胞已經(jīng)鋪滿培養(yǎng)瓶底面時便可等量分瓶傳代繼續(xù)培養(yǎng)，分瓶后的細(xì)胞密度降低，細(xì)胞呈較小的細(xì)胞團或者單個細(xì)胞，形態(tài)依舊圓而飽滿。一種高轉(zhuǎn)化率、無限增殖優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟:IEBV 的制備1.1B958 細(xì)胞復(fù)蘇(I)在40°C水浴鍋中解凍凍存的B958細(xì)胞；(2)將解凍的B958細(xì)胞移至裝有6ml RPMI1640全培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37.5°C>5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2B958 細(xì)胞培養(yǎng)
待培養(yǎng)基顏色變成褐黃色時，補充等量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。1.3B958 細(xì)胞傳代當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約3X IO5/瓶時，即可進(jìn)行傳代。將細(xì)胞充分搖勻后，等量分裝于2個25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，并向瓶內(nèi)添加適量新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。1.4B958 細(xì)胞凍存(I)凍存細(xì)胞前l(fā)d，向培養(yǎng)瓶中加入適量的新鮮培養(yǎng)基；(2)收集B958細(xì)胞于15ml離心管內(nèi)，常溫下1500rpm離心15min，去上清；(3)用凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO6 3X IO6細(xì)胞/ml，將細(xì)胞懸液以Iml/管分裝于凍存管中；(4)先將凍存管 置于4°C冰箱半小時，然后放入裝有異丙醇的程序降溫盒中于-80°C冰箱過夜，投入液氮罐內(nèi)長期保存。1.5EBV 提取(I)將EBV溶液置于_80°C冰箱lOmin，然后37°C水浴凍融。如此反復(fù)操作3次。(2) 1800rpm離心15min, 0.22 μ m濾膜過濾,分裝后于_80°C保存?zhèn)溆谩?應(yīng)用EBV轉(zhuǎn)化運動員B淋巴細(xì)胞2.1血樣采集(I)記錄采血運動員個人資料，與抽血管上的編號相對應(yīng)；(2)使用帶有肝素鈉的一次性抽血管，抽取運動員靜脈血4ml/人；(3)血樣常溫靜止放置I 2d ;注:如果全血當(dāng)時不能馬上轉(zhuǎn)化，必須做如下處理:將血樣在常溫下2500rpm，離心15min，離心后用巴氏管將白膜層轉(zhuǎn)入含有3ml 1640全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，然后將離心管放入37.5°C培養(yǎng)箱,橫臥于方盤上。2.2細(xì)胞永生化(I)用加1%的雙抗的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將采集的運動員血液稀釋，輕輕吹勻。(2)淋巴細(xì)胞分離液置于37.5°C水浴鍋中預(yù)熱，使用時將其溶液搖勻。(3)往裝有運動員血樣的15ml離心管中慢慢倒入4ml淋巴細(xì)胞分離液，使二者界面清晰，3000rpm離心IOmin,使血液分層；(4)離心后離心管中分為四層，將血清下層、紅細(xì)胞上層的成楊絮狀的白膜層，用巴氏管移入裝有6ml RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，IOOOrpm離心IOmin ；(5)離心后將上清液棄掉,再加入IOml RPMI1640培養(yǎng)基，IOOOrpm離心IOmin,棄
上清液。重復(fù)一次后，棄去上清液，將細(xì)胞敲勻待用；(6)將2ml含PHA的全培養(yǎng)基、1.4ml EB病毒、0.4ml CyA以及收集到的白細(xì)胞做成混合液,共約4ml ；(7)將混合液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔Iml ；(8)將24孔培養(yǎng)板置于37.5V,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3運動員永生化細(xì)胞系的培養(yǎng)及凍存3.1細(xì)胞的傳代(I)永生化細(xì)胞從24孔板轉(zhuǎn)移到25m2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；
(2) 3 4d進(jìn)行一次半量換液,每次半量換液即為一次細(xì)胞傳代。3.2細(xì)胞的凍存(I)收集細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心lOmin，棄上6清；(2)向離心管中加入預(yù)定量的凍存液，將細(xì)胞輕輕打勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1X10/ml 3X 106/ml，將凍存液分裝到凍存管中，每管Iml ；(3)預(yù)凍:將凍存管裝入降溫盒中，放于4V 20 30min，然后置于_70°C預(yù)凍4h以上，提出凍存管放入(4)凍存:提出凍存管放入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。上述高轉(zhuǎn)染率、、無線增殖優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，其中，根據(jù)實際需要可以將步驟(4)凍存的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，具體步驟為:將凍存管從液氮中取出置入42°C水浴中，連續(xù)晃動Imin后，將細(xì)胞移入加有培養(yǎng)液(RPMI1640+10%胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置含37.50C 5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點與效益:容易取材(幾毫升外周血)，轉(zhuǎn)化建株簡單易行、連續(xù)培養(yǎng)傳代中染色體穩(wěn)定、對培養(yǎng)基要求不高，省時省錢、可同步得到染色體標(biāo)本，可用于細(xì)胞雜交等實驗、可以得到取之不盡，用之不竭的DNA材料，可持續(xù)用于各項研究。
具體實施例方式實施例中所用的主要儀 器及試劑來源:(一)主要的儀器及設(shè)備DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺:中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司37.50C 5% C02 培養(yǎng)箱:德國 Heraeus 公司TDL-40B水平離心機:中國上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司AR1530/C電子天平:美國OHAUS公司IX-71倒置相差顯微鏡:日本Olympus公司電熱恒溫水浴鍋,血球計數(shù)板,液氮貯存器:中國北京六一廠Pall超純水儀:德國Pall公司電動移液器:德國Eppendorff公司超低溫冰箱:中國海爾公司培養(yǎng)板:美國Corning公司梯度PCR 儀:美國 Applied Biosystems超純水儀Mi 11 ipore美國凝膠成像系統(tǒng):美國AlpHa Innotech紫外分光光度計:美國UltrospecllOOpro GE紫外分光光度計:美國ND-1OOONanodrop臺式高速低溫離心機:德國Eppendorf流式細(xì)胞儀:美國Backman( 二 )主要試劑及配制方法優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株培養(yǎng)所用試劑(I) IN NaOH
稱取2g NaOH溶于50ml三蒸水中，0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?2) IN Hepes稱取11.925g !fepes 溶于 50ml 三蒸水中，用 IN 的 NaOH 調(diào)節(jié) ρΗ7.0 7.2，0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?3) 0.2M L-Glutamine稱取1.46g L-Glutamine溶于50ml三蒸水中，置于37 °C水浴鍋中加熱溶解，0.22 μ m濾膜過濾除菌，-20°C保存?zhèn)溆谩?4) RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基將一個包裝的RPMI1640干粉與Ig NaHCO3溶于適量三蒸水中，定容至1000ml，調(diào)pH7.0左右，0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，500ml/瓶分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?5) RPMI1640 全培養(yǎng)基:RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +10 % FBS+1 % 雙抗 +1 %L-Glutamine,用Hepes調(diào)節(jié)ρΗ7.0,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌,4°C保存?zhèn)溆谩?6)凍存液 ％ % FBS+5% DMSO(7) CyA的制備:稱取5mg CyA溶于250ml RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.22 μ m濾膜過濾除菌_20°C保存?zhèn)溆谩?8) PHA的制備:將IOmg PHA溶于5ml生理鹽水中，_20°C保存?zhèn)溆谩?9)含 PHA 的 RPMI1640 全培養(yǎng)基:RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +20% FBS+1%雙抗 +1%L-Glutamine+0.1 % PHA,用Ifepes調(diào)節(jié)PH7.0,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?10)B958原代細(xì)胞株微生物檢測所用試劑:(11)大豆胰蛋白胨:3g大豆胰蛋白胨，加IOOml三蒸水，調(diào)pH7.3，高壓滅菌15 20min,分裝到15mmX 150mm的玻璃管中。(12)麥芽汁:2g麥芽汁加IOOml三蒸水，調(diào)ρΗ3.0 4.0，高壓滅菌15 20min,分裝到15mmX 150mm的玻璃管中。(13) DAPI染液:三蒸水配制lmg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5 lmg/ml。(14)封片液:22.2ml0.1M 的檸檬酸，27.8ml0.2M 的 Na2HPO4 溶于 50ml 甘油中，NaOH調(diào)節(jié)pH5.5，貯存于4°C。(15)固定液:冰醋酸與甲醇以體積比1: 3的比例(現(xiàn)用現(xiàn)配)。染色體標(biāo)本所用試劑(16)秋水仙 素①貯存液:10mg秋水仙素溶于IOml三蒸水中。②工作液:三蒸水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100 μ g/ml。(17)低滲 KCI 溶液0.5g 的 KCI 溶于 IOOml 三蒸水。(18)固定液②冰醋酸:甲醇(v/v) =1:3的比例配制。(19) Giemsa 染色液:①原液:將Ig Giemsa染粉和20ml甘油倒入研缽,在研缽內(nèi)研磨至無顆粒為止。力口甘油補至66ml，甲醇66ml。將混合液放在56°C保溫箱2h后，置于棕色瓶中避光、4°C貯存，最少需要一周后方可使用。②工作液:用PBS將Giemsa原液稀釋(PBS =Giemsa為9:1)現(xiàn)用現(xiàn)配。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用試劑:(20)質(zhì)粒 DNA(DsRed、pEYFP-Nl 和 pEGFP_N3)，脂質(zhì)體 Lipofectamine，不含血清的MEM培養(yǎng)液，含血清的MEM培養(yǎng)液，pH7.4的PBS。同工酶分析所用試劑:(21)0.9% (質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA 溶液:分別稱取 0.9g NaCI 和 0.0223gEDTA溶于IOOml三蒸水中即可。(22)蛋白提取液:將 5ml TritonX-100 加入 75ml0.9% (質(zhì)量比)NaCl-0.06mmolEDTA溶液中即得蛋白提取液，將其貯于4°C冰箱保存。TritonX-1OO: 0.9% (質(zhì)量比)NaCl-0.06mmolEDTA 溶液=I: 15。(23)40% (質(zhì)量體積比)蔗糖溶液:將40g蔗糖溶于IOOml水中。(24)膠溶液的配制A 液:lmol/L HCI48.0ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，用濃鹽酸調(diào)至 ρΗ8.9B 液:Acr40.0g, Bis2gC液:過硫酸銨 0.14g (現(xiàn)配現(xiàn)用)D 液:lmol/L HC I48.0ml, Tris5.98g, TEMED0.46ml，用濃鹽酸調(diào)至 ρΗ6.7E 液:Acrl0.0g, Bis2.5gF 液:核黃素 4.0mgG 液:蔗糖 40.0g(25)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠與濃縮膠見表I表I
溶液成分分離膠濃縮膠
去離子 H2O13.35ml3.76 ml
1.5M Tris pH8.87.5ml0
0.5 M Tris pH6.805 ml
40%Acr6ml0.75 ml
2%Bis3ml0.4 ml
10%AP150 μ I120 μ I
TEMED30 μ I25 μ I(26)乳酸脫氫酶染色液與蘋果酸脫氫酶染色液見表2表權(quán)利要求
1.一種高細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、高細(xì)胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株。
2.如權(quán)利要求1所述方法是，一種高細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、高細(xì)胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟: 2.1血樣采集 (1)記錄采血運動員個人資料，與抽血管上的編號相對應(yīng)； (2)使用帶有肝素鈉的一次性抽血管，抽取運動員靜脈血4ml/人； (3)血樣常溫靜止放置I 2d; 注:如果全血當(dāng)時不能馬上轉(zhuǎn)化，必須做如下處理:將血樣在常溫下2500rpm,離心15min,離心后用巴氏管將白膜層轉(zhuǎn)入含有3ml 1640全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，然后將離心管放入37.5°C培養(yǎng)箱,置于方盤上。
2.2細(xì)胞永生化 (1)用加I%的雙抗的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將采集的運動員血液稀釋，輕輕吹勻。
(2)淋巴細(xì)胞分離液置于37.5°C水浴鍋中預(yù)熱，使用時將其溶液搖勻。
(3)往裝有運動員血樣的15ml離心管中慢慢倒入4ml淋巴細(xì)胞分離液，使二者界面清晰，3000rpm離心IOmin,使血液分層； (4)離心后離心管中分為四層，將血清下層、紅細(xì)胞上層的成楊絮狀的白膜層，用巴氏管移入裝有6ml RPMI1640培養(yǎng)基的離心管中，IOOOrpm離心IOmin ； (5)離心后將上清液棄掉,再加入IOmlRPMI1640培養(yǎng)基，IOOOrpm離心IOmin,棄上清液。重復(fù)一次后，棄去上清液，將細(xì)胞敲勻待用； (6)將2ml含PHA的全培養(yǎng)基、1.4ml EB病毒、0.4ml CyA以及收集到的白細(xì)胞做成混合液，共約4ml ； (7)將混合液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔Iml； (8)將24孔培養(yǎng)板置于37.5°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.運動員永生化細(xì)胞系的培養(yǎng)及凍存 3.1細(xì)胞的傳代 (1)永生化細(xì)胞從24孔板轉(zhuǎn)移到25m2的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)； (2)3 4d進(jìn)行一次半量換液,每次半量換液即為一次細(xì)胞傳代。
3.2細(xì)胞的凍存 (1)收集細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心lOmin，棄上清； (2)向離心管中加入預(yù)定量的凍存液，將細(xì)胞輕輕打勻，調(diào)整細(xì)胞密度為IXlO6Ail 3 X 106/ml，將凍存液分裝到凍存管中，每管Iml ； (3)預(yù)凍:將凍存管裝入降溫盒中，放于4°C20 30min，然后置于一 70°C預(yù)凍4h以上，提出凍存管放入 (4)凍存:提出凍存管放入液氮柜中，即完成細(xì)胞凍存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種優(yōu)秀冰雪運動員EB病毒轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞的方法。本發(fā)明取運動員血液中B淋巴細(xì)胞，通過EB病毒轉(zhuǎn)化，運用懸浮培養(yǎng)法，成功構(gòu)建了運動員永生細(xì)胞系，并對所建細(xì)胞系進(jìn)行了各項生物學(xué)特性檢測。建立了一套比較完善的生物學(xué)特性檢測技術(shù)體系。本發(fā)明的目的是提供高細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、高細(xì)胞無限增殖的優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株。本發(fā)明涉及的優(yōu)秀運動員永生化細(xì)胞株可以為醫(yī)學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量高品質(zhì)材料；并可以作為永久保存全人類中最杰出冰雪運動員與身體素質(zhì)相關(guān)的基因資源。同時也解決了以往實驗研究的接力式進(jìn)行與標(biāo)本的暫時性采集中存在的矛盾，以便有效地對同一研究對象進(jìn)行連續(xù)持久性研究。
文檔編號C12N5/0781GK103232971SQ20131012313
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者徐金慶, 朱紅, 費郁紅, 張文秀, 王會, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院