專利名稱：一種用于檢測彎曲菌的熒光定量pcr方法及其專用引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測彎曲菌的熒光定量PCR引物和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物和探針進行彎曲菌熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
彎曲菌是全球范圍內(nèi)引發(fā)胃腸炎的主要食源性病原菌，能引起散發(fā)性和地方流行性胃腸炎的爆發(fā)，是全球公共衛(wèi)生關(guān)注的重點。特別是在缺陷性的個體，如癌癥病人、艾滋病人、糖尿病人、小孩和老人等，5歲以下兒童的發(fā)病率最高，另外，特定血清型空腸彎曲菌感染后能誘發(fā)格林巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)。近些年來,彎曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趨勢，據(jù)美國國家食品網(wǎng)的監(jiān)測，彎曲菌是發(fā)病率最高的病原菌，其病例數(shù)已超過李斯特菌病、沙門菌病和志賀氏菌病。彎曲菌作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品安全、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均是檢測的項目，有重要的社會、經(jīng)濟意義。長期以來人們對彎曲菌的檢測主要是依靠分離培養(yǎng)法。彎曲菌是兼性微需氧菌，培養(yǎng)條件苛刻，對氧氣比較敏感，只能在低氧環(huán)境中生長，培養(yǎng)周期較長等特點，采用不同的檢驗程序、方法，報告結(jié)果差異較大，確診檢驗結(jié)果至少需10-20天，檢驗方法存在繁瑣、費時費力、特異性低等缺陷。熒光定量PCR Taqman探針法具有快速、高度特異性、重復性好、靈敏度高等特點，能大大提高檢測的靈敏度、特異度，同時根據(jù)標準曲線能夠確診彎曲菌的感染以及確定樣品中污染數(shù)量。因此，基于分子生物學技術(shù)的熒光定量PCR方法，能夠快速特異、敏感、高效的對樣品進行檢測，對快速檢測樣品中的彎曲菌具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于檢測彎曲菌的特異性引物和探針；本發(fā)明的另一個目的在于提供檢測彎曲菌的熒光定量PCR方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先對NCBI已公布的彎曲菌，用BLAST對腸道病原菌的16srRNA基因的DNA序列進行比對，在其可變區(qū)設計了特異性序列的引物，以及與所述引物配合使用的熒光探針。其中探針的5’標記熒光基團FAM，3’標記淬滅基團Eclipse。在本發(fā)明的一個實施方式中，優(yōu)先的引物序列為:上游引物:GATTATCAAGTCTCTTGTGA(SEQ ID N0.1),下游引物:ATGGGTATTCTTGGTGATA(SEQ ID N0.2)。探針序列為:
FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。本發(fā)明提供一種彎曲菌的實時熒光定量PCR檢測方法，包括以樣品總DNA為模板，利用本發(fā)明提供的引物和探針進行熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據(jù)熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)判定結(jié)果。
本發(fā)明的實時熒光定量PCR擴增反應體系，當為20μ I反應體系時，其擴增體系為:
權(quán)利要求
1.一種用于彎曲菌熒光定量PCR檢驗方法的特異性引物，其核苷酸序列為: 上游引物:GATTATCAAGTCTCTTGTGA， 下游引物:ATGGGTATTCTTGGTGATA。
2.一種用于彎曲菌的熒光定量PCR檢驗方法的熒光探針，其核苷酸序列為:FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。
3.一種彎曲菌的熒光定量PCR檢驗方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物和權(quán)利要求2所述熒光探針進行熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據(jù)熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值判定結(jié)果。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，熒光定量PCR反應總體系為20μ1，體系組成為Ex Taq ,2XDRR039A 為 10 μ I ；ROX Reference Dye II, 50X 為 0.4 μ 1，上、下游濃度均為0.2 μ Μ，探針濃度為0.25 μ Μ，彎曲菌基因組DNA為2 μ I，剩余用滅菌ddH20補足；PCR反應程序為:95°C變性30s，以95°C 5s 60°C 34s擴增40個循環(huán)，并收集熒光信號。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，判定標準為: Ct值< 35.0時樣品結(jié)果為陽性； Ct值≥40.0時樣品結(jié)果為陰性； Ct值在35.0-40.0之間時，樣品需要重復，重復試驗如Ct值依然低于40判定為陽性擴增，超過40判定為陰性擴增。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測彎曲菌的熒光定量PCR方法及其專用引物和探針，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。探針序列為FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。所述彎曲菌的熒光定量PCR檢驗方法，以樣品總DNA為模板，利用上述的引物和探針進行熒光定量PCR，同時設立無模板對照和陽性對照，根據(jù)熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct值判定結(jié)果。本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強、重復性好的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK103160610SQ20131012493
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者焦新安, 黃金林, 朱佳琪, 耿士忠, 孫林 申請人:揚州大學