一種熒光定量pcr鑒定菊花內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)的引物對(duì)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種熒光定量PCR鑒定菊花內(nèi)、外源基因拷貝數(shù) 的引物對(duì)及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊花(Chrysanthemummorifolium)原產(chǎn)我國(guó),是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切 花之一,具有觀賞、食用和藥用價(jià)值,距今已有1600多年的栽培歷史,由毛華菊、野菊和紫 花野菊等天然雜交并經(jīng)人工長(zhǎng)期選育而成。菊花花型、花色、株型等極其豐富,是盆栽、切花 和園林地被應(yīng)用的重要花卉種類,具有很高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值,在花卉生產(chǎn)中占有十分重 要的地位。
[0003] 菊科是被子植物第一大科,也是雙子葉植物中最進(jìn)化的類群,約有1100個(gè)屬, 30000余種。最近研究表明,至少70 %的被子植物是多倍體,經(jīng)歷過兩次或者兩次以上的 雜交多倍體化過程。菊科植物普遍經(jīng)歷過三次多倍體化事件,而多倍體物種在菊屬及其近 緣種屬內(nèi)更加普遍。而菊花作為菊科植物的代表,是典型的異源六倍體及其非整倍體。然 而,因?yàn)槠浠蚪M經(jīng)過多次加倍,伴隨著基因數(shù)目的改變而使基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜,與原基 因組相比基因表達(dá)水平以及基因組構(gòu)成發(fā)生了顯著的改變,如染色體重組、親本序列的消 除、基因沉默、同源異型轉(zhuǎn)換等,產(chǎn)生大量的同源基因以及基因拷貝數(shù)增加,導(dǎo)致基因冗余、 原有基因亞功能化甚至沉默,大大增加了篩選低拷貝或單拷貝目的基因以及克隆基因的難 度。
[0004] 低拷貝基因是分析植物異源多倍體系統(tǒng)發(fā)生的一種有效手段。它不僅可用于探討 不同倍性水平(或是同一倍性水平不同物種)間的系統(tǒng)演化關(guān)系、群落的遺傳結(jié)構(gòu)和植物 譜系地理學(xué)等,還可以用于研究不同基因的起源和進(jìn)化歷史。因此,單拷貝或低拷貝的基因 對(duì)于系統(tǒng)進(jìn)化等方面研究是十分必要的。此外,轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)是影響目的基因 表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性的重要因素,因此,轉(zhuǎn)基因研究中關(guān)鍵的一步就是檢測(cè)內(nèi)源、外源基 因的拷貝數(shù),以篩選出拷貝數(shù)少或單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株供進(jìn)一步的研究或育種利用。
[0005] 傳統(tǒng)的拷貝數(shù)檢測(cè)主要是Southern雜交法,但該方法工作量大,需要的DNA材料 較多,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,并且經(jīng)常要用到放射性同位素等具有潛在危險(xiǎn)的藥品。因此如何快速、準(zhǔn) 確、高效的鑒定菊花內(nèi)源基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因菊花轉(zhuǎn)內(nèi)源、外源基因拷貝數(shù),成為了菊花基 因拷貝數(shù)鑒定的關(guān)鍵問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中,多倍體植物菊花基因拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)基因菊花內(nèi)、 外源基因拷貝數(shù)鑒定方法復(fù)雜,工作量大,所需DNA材料較多的問題,提供一種基于熒光定 量PCR鑒定菊花內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)的引物、方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]PGK基因在熒光定量PCR鑒定菊花內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用,PGK基因作為內(nèi) 參基因。所述的PGK基因在genbank中的登錄號(hào)為KJ524576。
[0009] 所述的菊花包括轉(zhuǎn)基因菊花或非轉(zhuǎn)基因菊花。
[0010] -種應(yīng)用于熒光定量PCR鑒定菊花內(nèi)、外源基因拷貝數(shù)的內(nèi)源基因擴(kuò)增引物 對(duì),采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因PGK的熒光定量引物,引物長(zhǎng)度一般在 17-25bp之間,上下游引物不能相差太大,熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好,最長(zhǎng)是300bp; Tm值在55-65°C之間,其中前后引物Tm值相差4°C;產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0011] 所述的引物對(duì)優(yōu)選:引物長(zhǎng)度各為24bp,引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為225,Tm值為58°C
[0012] 所述的引物對(duì)進(jìn)一步優(yōu)選:正向引物序列如SEQIDNO. 1所示,反向引物序列如 SEQIDN0. 2 所示。
[0013] -種熒光定量PCR鑒定非轉(zhuǎn)基因菊花內(nèi)源基因拷貝數(shù)的方法,包括以下步驟:
[0014] (1)提取菊花DNA;
[0015] (2)測(cè)定試樣DNA質(zhì)量和濃度,統(tǒng)一稀釋成同一濃度50ng/ul,根據(jù)待測(cè)菊花內(nèi)源 基因的DNA片段設(shè)計(jì)并合成引物,引物設(shè)計(jì)參數(shù)為引物長(zhǎng)度18-25bp,Tm55-65 °C,其中前后 引物Tm值相差4°C,產(chǎn)物大小為100_300bp;
[0016] (3)在MastercyclerepRealplex型號(hào)焚光定量?jī)x上進(jìn)行焚光定量PCR反應(yīng),每 份樣品進(jìn)行內(nèi)參基因PGK和待測(cè)基因的PCR反應(yīng),其中內(nèi)參基因PGK熒光定量PCR反應(yīng)使 用SEQIDNO. 1/SEQIDN0. 2所示的引物對(duì);
[0017] (4)溶解曲線分析確定其唯一性,溶解曲線分析可以看出基因溶解曲線是否是單 峰型,若為單峰,則說明在PCR擴(kuò)增過程中沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,由此推斷定量PCR擴(kuò)增 所獲得的數(shù)據(jù)是可靠的;
[0018] (5)分析熒光定量數(shù)據(jù),確定基因拷貝數(shù):根據(jù)待測(cè)菊花內(nèi)源基因和內(nèi)參基因PGK 的CT值比較分析,CT值是每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 起始拷貝數(shù)越多,CT值越小。PGK為單拷貝基因,待測(cè)基因每比PGK少一個(gè)CT值,則代表待 測(cè)基因拷貝數(shù)為PGK拷貝數(shù)的2倍,若待測(cè)基因的CT平均值比PGK少n個(gè),則可以確定菊 花待測(cè)內(nèi)源基因的拷貝數(shù)為2n。
[0019] 所述的方法優(yōu)選,每試樣平行3個(gè),PCR檢測(cè)重復(fù)3次,CT值取三次測(cè)定的平均值。
[0020] -種基于熒光定量PCR鑒定轉(zhuǎn)基因菊花轉(zhuǎn)內(nèi)源、轉(zhuǎn)外源基因拷貝數(shù)的方法,包括 以下步驟:
[0021] (1)分別提取野生型菊花和轉(zhuǎn)基因菊花DNA;
[0022] (2)測(cè)定試樣DNA質(zhì)量和濃度,統(tǒng)一稀釋成同一濃度50ng/ul,根據(jù)轉(zhuǎn)內(nèi)、外源基 因或含有該轉(zhuǎn)內(nèi)、外源基因的載體片段設(shè)計(jì)引物,引物設(shè)計(jì)參數(shù)為引物長(zhǎng)度18_25bp,Tm 55-65°C,其中前后引物Tm值相差4°C,產(chǎn)物大小為100_300bp;
[0023] (3)在MastercyclerepRealplex型號(hào)焚光定量?jī)x上進(jìn)行焚光定量PCR反應(yīng),每 份樣品進(jìn)行內(nèi)參基因PGK和待測(cè)基因或載體片段的PCR反應(yīng)(若為轉(zhuǎn)內(nèi)源基因則需要加測(cè) 定一野生型的待測(cè)基因),其中內(nèi)參基因PGK熒光定量PCR反應(yīng)使用SEQIDNO. 1/SEQID NO. 2所示的所述的引物對(duì);
[0024] (4)溶解曲線分析確定其唯一性,溶解曲線分析可以看出基因溶解曲線是否是單 峰型,若為單峰,則說明在PCR擴(kuò)增過程中沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,由此推斷定量PCR擴(kuò)增 所獲得的數(shù)據(jù)是可靠的;
[0025] (5)分析熒光定量數(shù)據(jù),確定基因拷貝數(shù):
[0026] (A)當(dāng)針對(duì)含有該轉(zhuǎn)內(nèi)、外源基因的載體片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR時(shí),分別 獲取內(nèi)參基因PGK和根據(jù)載體片段設(shè)計(jì)引物的待測(cè)基因的CT值進(jìn)而比較分析,起始拷貝數(shù) 越多,CT值越小。PGK為單拷貝基因,待測(cè)基因每少一個(gè)CT值代表待測(cè)基因拷貝數(shù)為PGK 拷貝數(shù)的2倍,若根據(jù)待測(cè)基因載體設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量的CT值與PGK基因的CT值相 同,則待測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花轉(zhuǎn)內(nèi)源基因或外源基因?yàn)閱慰截惢?;若待測(cè)基因的CT值比PGK的 CT值少n個(gè),則可以確定待測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花轉(zhuǎn)內(nèi)源基因或外源基因拷貝數(shù)為2n;
[0027] ⑶當(dāng)針對(duì)外源基因本身設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR時(shí),分別獲取內(nèi)參基因PGK和 外源基因的CT值,之后外源基因的CT值與參照基因PGK的CT值比較分析,PGK為單拷貝基 因,待測(cè)基因每少一個(gè)CT值代表待測(cè)基因?yàn)镻GK拷貝數(shù)的2倍,若根據(jù)待測(cè)基因本身設(shè)計(jì) 引物進(jìn)行熒光定量的CT值與PGK的數(shù)值相同,則待測(cè)外源基因?yàn)閱慰截惢颍舯萈GK少 n個(gè),則可以確定菊花待測(cè)基因的拷貝數(shù)為2n;
[0028] (C)當(dāng)針對(duì)內(nèi)源基因本身設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熒光定量PCR時(shí),分別獲取轉(zhuǎn)基因菊花和 野生型菊花中內(nèi)參基因PGK和待測(cè)內(nèi)源基因的CT值,若待測(cè)轉(zhuǎn)內(nèi)源基因的01\平均值比PGK 少叫個(gè),則可以確定轉(zhuǎn)基因菊花中該內(nèi)源基因總的拷貝數(shù)為2nl;野生型該基因的CT2值與 參照基因PGK的CT值比較分析,若比PGK少叫個(gè),則該菊花野生型的內(nèi)源基因拷貝數(shù)為2n2, 那么所轉(zhuǎn)入的內(nèi)源基因拷貝數(shù)為2nl-2n2。
[0029] 所述的方