一種熒光定量pcr技術(shù)篩選耐漬澇花生品種或植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種巧光定量PCR技術(shù)篩選耐潰潰花生 品種或植株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水分是植物生長發(fā)育過程中重要的生態(tài)因子之一，影響植物的生長、發(fā)育、代謝和 生態(tài)地理分布。由水分造成的脅迫一般分為兩種，干旱脅迫和潰潰缺氧脅迫，兩者對植物生 理生態(tài)造成的危害非常大。花生是我國主要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物?；ㄉ?在生長發(fā)育過程中，會受到潰潰缺氧脅迫的危害，從而影響花生的產(chǎn)量與品質(zhì)。
[0003] 篩選耐潰潰花生品種是提高潰潰地區(qū)花生產(chǎn)量的重要途徑之一。研究表明，在潰 潰缺氧脅迫下花生的農(nóng)藝性狀會受到影響，花生品種的株高、單株分枝數(shù)、單株總果數(shù)、單 株飽果數(shù)等參數(shù)都會受到影響而降低；花生在開花期至結(jié)芙期受到脅迫時，會導(dǎo)致花生徒 長；在生育早期受到水分脅迫時，花生植株的生長發(fā)育會受到影響，出現(xiàn)發(fā)育遲緩和植株矮 小的狀況。雖然常規(guī)的篩選方法有通過農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，測定不同花生品種在潰潰 低氧脅迫條件下的生理生化差異來進(jìn)行篩選，但存在品種繁多，生長周期長，操作繁瑣，成 本高，分析處理難等問題。
[0004]非共生血紅蛋白基因（ns化)AhGLB能在低氧脅迫時，結(jié)合NO作用生成N03，提升N03在植物體中的濃度，滿足植物在潰潰缺氧脅迫下對N03-的需求，同時降低NO對植物造 成的傷害，從而減輕潰潰低氧脅迫對植物體的傷害。CN103255147A公開了花生耐潰潰的非 共生血紅蛋白基因AhGLB及其應(yīng)用，并公開了不同基因型花生受到不同脅迫處理時該基因 特異表達(dá)情況，W及篩選出的耐潰潰花生受到潰潰缺氧脅迫處理時該基因的表達(dá)情況，但 并未公開具體如何使用巧光定量PCR技術(shù)篩選耐潰潰花生品種或植株的方法。 陽0化]因此，亟需提供一種周期短、操作簡便、成本低、分析處理簡便的篩選耐潰潰花生 品種或植株的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種周期短、操作簡便、成本低、分析處理簡便的篩選耐潰潰花生品種 或植株的方法。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所提供的的技術(shù)方案是：
[0008] 一種巧光定量PCR技術(shù)篩選耐潰潰花生品種或植株的方法，包括如下步驟：
[0009] 1)培養(yǎng)花生幼苗：選取生長力旺盛的花生種子，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65% -85%的乙醇 消毒1-3分鐘后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的化C12溶液消毒5-15分鐘，再用無菌地2〇沖洗3-4次， 置于帶有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿加地2〇20-50血，花生種子5-15粒，25°C人工氣 候箱中暗培養(yǎng)20-3化后，設(shè)置光照強(qiáng)度1000-2000LX，每天光照培養(yǎng)12-1化，培養(yǎng)72h ;
[0010] 2)脅迫處理與樣品采集：花生幼苗培養(yǎng)10-20天后分為兩組，其中一組進(jìn)行通氣 處理的為對照組，另一組進(jìn)行低氧脅迫處理20-3化，分別提取對照組與低氧脅迫處理組花 生幼苗根的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80--70°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 3)花生AhGLB序列的應(yīng)用：對基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，W恒定表達(dá)基因Actin作為內(nèi) 參基因?qū)ν粯悠穋DNA模板利用巧光定量PCR儀進(jìn)行定量分析，引物設(shè)計(jì)如下：
[0012] AhGLB-F:5' -TGGAGGCAACAGCATTCACT-3' ；
[0013]AhGLB-R:5'-ATGCTTCCTTCATGGCTGGT-3';
[0014]Actin-F:5' -GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3,；
[0015]Actin-R:5,-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3,；
[0016] 使用巧光定量PCR儀進(jìn)行檢測，結(jié)束后利巧光定量PCR儀自帶的SDS 2. 0版軟件 進(jìn)行結(jié)果分析；
[0017] 4)篩選分析。
[0018]進(jìn)一步地，步驟（1)中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，乙醇消毒時間為1分鐘，化C12溶液 消毒時間為8分鐘。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟（1)中人工氣候箱中暗培養(yǎng)時間為2地。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟（2)中花生幼苗培養(yǎng)時間為14天，低氧脅迫處理時間為2地。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟（2)中cDNA置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 進(jìn)一步地，步驟（3)中使用巧光定量PCR儀進(jìn)行檢測的具體操作為：第一步預(yù)變 性：95°C變性2分鐘；第二步巧光收集：95°C15秒，58°C15秒，72°C20秒，本步結(jié)束時進(jìn)行 巧光信號收集40個循環(huán)；第Ξ步融解曲線分析：65°C30秒逐步升至95°C，每隔0. 2°C收集 一次巧光。
[0023] 進(jìn)一步地，步驟（3)中使用的巧光定量PCR儀為Appliedbiosystems7500巧光 定量PCR儀。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟（4)中篩選分析的具體方法為：將花生的AhGLB基因與內(nèi)參基因 actin進(jìn)行對比，低氧脅迫處理組的AhGLB基因的表達(dá)量明顯大于對照組的為耐潰潰品種 或植株，表達(dá)量與對照組的差異不明顯的為不耐潰潰品種或植株。
[00巧]本發(fā)明的有益效果：
[00%] 本發(fā)明方法操作簡便，不需要模擬自然潰潰條件和各種農(nóng)藝性狀及生理生化指標(biāo) 的檢測，周期短，成本低，科學(xué)準(zhǔn)確，通用性好。
【附圖說明】
[0027]圖1為潰潰低氧脅迫2地，AhGLB基因的表達(dá)量； 陽0測圖1中CK為對照例，由圖1可知本發(fā)明的特異性引物，與對照例的引物相比檢ii效果更好，能夠有效檢測出同一品種在脅迫24h時比未脅迫條件下AhGLB表達(dá)量差異大。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本研究通過測定低氧脅迫條件下不同花生品種或植株的根部的AhGLB基因表達(dá) 量，來篩選耐潰潰花生品種或植株，旨在為耐潰潰花生品種的篩選提供高效準(zhǔn)確的方法。
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非W任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。 陽〇3U 實(shí)施例1 :
[0032] AhGLB基因的全序列如CN103255147A中記載。
[0033] 從NCBI的0RFFinder發(fā)現(xiàn)在AhGLB序列位于1-613存在一個長45化P的開放讀 碼框，共編碼150個氨基酸，起始密碼子為ATG。通過Blast進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)從花生中克隆 的AhGLB基因與其他幾種植物中的非共生血紅蛋白基因相似度很高，而非共生血紅蛋白基 因主要在植物潰潰中起作用，由此推斷說明AhGLB是耐潰潰基因。
[0034] 實(shí)施例2 :
[0035] 一種巧光定量PCR技術(shù)篩選耐潰潰花生品種或植株的方法，包括如下步驟：
[0036] 1)培養(yǎng)花生幼苗
[0037] 選取生長力旺盛的花生種子，用75%乙醇消毒lmin，0. 1%的化化消毒8min，無 菌地2〇沖洗4次，置于帶有雙層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑11cm)中，每個培養(yǎng)皿加地2〇 30mL， 花生種子10粒。25°C人工氣候箱暗培養(yǎng)24h后，設(shè)置光照強(qiáng)度1000-2000LX，每天光照培養(yǎng) 12h，培養(yǎng) 72h。
[0038] 選用長30cm，寬15cm，高10cm的塑料盒作為培養(yǎng)盒，內(nèi)高7. 5cm處支撐一個打孔 面板，行列均勻30孔，孔徑1cm。每盒加地2〇 2以水面與打孔面板平齊，將萌發(fā)整齊一致 的種子擺放在培養(yǎng)盒支撐面板的孔中，胚根向下，每盒30粒。
[0039] 2)脅迫處理與樣品采集
[0040] 待花生幼苗正常培養(yǎng)14天后，生長狀況基本一致，分為兩組，其中一組進(jìn)行通氣 處理組的為對照組，對另一組花生幼苗進(jìn)行不通氣處理24h后，分別提取對照與處理組花 生幼苗根的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為巧光定量PCR分析的模板，于-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 3)花生AhGLB序列的應(yīng)用
[0042] 花生AhGLB基因表達(dá)差異檢測與分析方法：依據(jù)巧光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則對基 因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，隊(duì)直定表達(dá)基因Actin作為內(nèi)參基因?qū)ν粯悠穋DNA模板利用巧光定量 PCR儀進(jìn)行定量分析。引物設(shè)計(jì)如下：
[0043] AhGLB-F :5' -TGGAGGCAACAGCATTCACT-3'
[0044] AhGLB-R :5' -ATGCTTCCTTCATGGCTGGT-3'
[0045] Actin-F :5, -GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3，
[0046] Actin-R :5, -GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3'
[0047]Appliedbiosystems7500巧光定量PCR儀檢測程序如下：第一步預(yù)變性：95°C變 性2分鐘；第二步巧光收集：95°C15秒-58°C15秒-72°C20秒，本步結(jié)束時進(jìn)行巧光信號 收集40個循環(huán)；第Ξ步融解曲線分析：65°C30秒逐步升至95°C，每隔0. 2°C收集一次巧光。 結(jié)果分析：利用AB7500巧光定量PCR儀自帶的SDS2. 0版軟件進(jìn)行分析。 W48] 4)篩選依據(jù)
[0049] 花生幼苗的耐潰潰能力與根中AhGLB基因的表達(dá)量相關(guān)；不同條件下，表達(dá)量的 高低是篩選耐潰潰花生品種或植株的主要依據(jù)。不同花生品種在對照（通氣處理）條件下， 該基因與內(nèi)