專利名稱：一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備β-環(huán)糊精的方法
—種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備P-環(huán)糊精的方法技術(shù)領(lǐng)域
一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備￠-環(huán)糊精的方法，屬于￠-環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)糊精(cyclodextrin,⑶)稱作環(huán)聚葡萄糖又名環(huán)鏈淀粉，Viller在1891年通過(guò)軟化芽孢桿菌作用于淀粉，經(jīng)酶降解所得產(chǎn)物而發(fā)現(xiàn)了環(huán)糊精。由于環(huán)糊精具有內(nèi)疏水外親水的筒狀結(jié)構(gòu)，使其具有很多特別的性能，能與范圍極其廣泛的各類客體，比如有機(jī)分子、無(wú)機(jī)離子、配合物甚至惰性氣體，通過(guò)分子間相互作用形成主客體包合物，從而對(duì)客體具有屏蔽、控制釋放、活性保護(hù)等功能，因而廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。P -環(huán)糊精制備工藝簡(jiǎn)單，成本較低，是目前國(guó)內(nèi)唯一工業(yè)化生產(chǎn)的環(huán)糊精。酶法制備￠-環(huán)糊精，安全污染小，是國(guó)外內(nèi)制備環(huán)糊精的主要方法。但是，酶法制備P _環(huán)糊精過(guò)程中，由于影響菌種生長(zhǎng)因素較多，造成菌種生長(zhǎng)速度很不穩(wěn)定，使得整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程周期難以估算控制，造成嚴(yán)重的原料浪費(fèi)和能源浪費(fèi)，增加了生產(chǎn)成本。固定化細(xì)胞的方法，可以增加菌種的生長(zhǎng)穩(wěn)定性，縮短種子液生長(zhǎng)周期，并且能夠反復(fù)多次使用菌種，從而使得環(huán)糊精的生產(chǎn)具有持續(xù)性，降低成本。國(guó)外已有固定化細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，報(bào)道結(jié)論證實(shí)了固定化細(xì)胞對(duì)于維持環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的連續(xù)活性具有重要作用。國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明首次采用棕繩這一天然易得材料作為固定化基質(zhì)，用于固定化CGTase產(chǎn)生菌，利用細(xì)菌對(duì)于棕繩的天然附著力實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固定化，固定化過(guò)程簡(jiǎn)單，連續(xù)化生產(chǎn)效果顯著，為工業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)CGTase以及P -環(huán)糊精提供依據(jù)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備P -環(huán)糊精的方法，增加環(huán)糊精生產(chǎn)周期的可控性，降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案:一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備￠-環(huán)糊精的方法，以棕繩固定化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶CGTase連續(xù)培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)P -環(huán)糊精的連續(xù)化制備，步驟為: (1)制備固定化基 質(zhì)棕簾:棕繩編織成簾，棕簾需要先用0.3%-0.5%Na0H溶液浸泡24h，再經(jīng)煮沸4-6h，121°C 20min滅菌，待用； (2)種子培養(yǎng):采用菌株ATCC21783為CGTase產(chǎn)生菌，投放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為:可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，其余為凈水，調(diào)整pH8.5 ；200rpm搖床培養(yǎng)3天，待光密度達(dá)到0.8，作為種子液； (3)棕繩固定化培養(yǎng):培養(yǎng)基中接種1%_3%的光密度為0.8的種子液，投放棕簾，棕簾比表面積與培養(yǎng)基體積的比為1:3-2:3 (cm2:mL)，pH8.5，29°C，200rpm搖床培養(yǎng)；培養(yǎng)2_3天后，至光密度達(dá)到1.0 ； (4)CGTase連續(xù)培養(yǎng):無(wú)菌條件下將棕簾取出，首次培養(yǎng)發(fā)酵液離心除菌后用以制備β -環(huán)糊精；取出的棕簾用滅過(guò)菌的0.9%的生理鹽水沖洗，投入新鮮配制、121 °C 20min滅菌的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在與步驟(3)相同的條件下培養(yǎng)24-48h，得CGTase酶液；
(5)按步驟(4)中所述方法取出棕簾，投放到下個(gè)循環(huán)中繼續(xù)使用；此次及以后所得發(fā)酵液無(wú)需離心，可直接做CGTase粗酶液催化淀粉制備β -環(huán)糊精；
經(jīng)10-15個(gè)循環(huán)后，酶活仍可保持為初酶活的80%-90% ；
(6)β-環(huán)糊精的連續(xù)化制備:將所得的酶按照無(wú)溶劑法制備環(huán)糊精的方法，生產(chǎn)制備環(huán)糊精。本發(fā)明的有益效果:一是實(shí)現(xiàn)菌種的反復(fù)利用，增加了菌種的生長(zhǎng)穩(wěn)定性，縮短種子液長(zhǎng)成時(shí)間，因而使得整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程具有可控性及連續(xù)性。二是固定菌的可操作性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，基本可免去分離純化酶液的過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)過(guò)程。三是酶活力相對(duì)穩(wěn)定，在連續(xù)生產(chǎn)過(guò)程中，并沒(méi)有因?yàn)槭褂弥芷诘难娱L(zhǎng)而造成酶活力的大幅降低。這就保證了連續(xù)化生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)糊精產(chǎn)量的穩(wěn)定性。四是整個(gè)生產(chǎn)周期穩(wěn)定，利于及時(shí)合理的安排各生產(chǎn)階段工作，減少了對(duì)原材料及能源的損耗，降低了成本。


圖1連續(xù)發(fā)酵酶液催化淀粉制備β -環(huán)糊精的框圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
反應(yīng)體系中，CGTase產(chǎn)生菌采用菌株ATCC 21783 (購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心、或上海復(fù)祥生物科技有限公司)，使用堿性培養(yǎng)基(`可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，調(diào)整ρΗ8.5，200rpm搖床培養(yǎng)3天，待光密度達(dá)到0.8，接種量為1%，投放棕簾。棕簾需要先用0.3%-0.5%Na0H浸泡24h，再經(jīng)煮沸4_6h，12rC，20min，單獨(dú)滅菌。棕簾比表面積與培養(yǎng)基體積的比為l:3(cm2:mL)，pH8.5, 29°C,200rpm搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，再配制新的培養(yǎng)基和0.9%的生理鹽水，121°C，20min,滅菌。將棕簾取出，發(fā)酵液測(cè)酶活，制備環(huán)糊精。用生理鹽水沖洗棕簾，將沖洗后的棕簾再放入新的培養(yǎng)基中。同樣條件培養(yǎng)2天，再取出，同第一次操作；再同樣條件培養(yǎng)2天，此過(guò)程重復(fù)10次，發(fā)酵后均測(cè)酶活，第一次酶活為5212.64U (0D值降低1/10為一個(gè)酶活單位)，第10次酶活為4218.30U，酶活依然為首次發(fā)酵測(cè)定酶活的80.9%。實(shí)施例2
反應(yīng)體系中，CGTase產(chǎn)生菌采用菌株ATCC 21783，使用堿性培養(yǎng)基(可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，ρΗ8.5，200rpm搖床培養(yǎng)3天，待光密度達(dá)到0.8，接種量為2%，投放棕簾。棕簾需要先用0.3-0.5%Na0H浸泡24h，再經(jīng)煮沸4-6h，121 V，20min,單獨(dú)滅菌。棕簾比表面積與培養(yǎng)基體積的比為2:3 (cm2:mL)，ρΗ8.5，29°C，200rpm搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，再配制新的培養(yǎng)基和0.9%的生理鹽水，121°C，20min，滅菌。將棕簾取出，發(fā)酵液測(cè)酶活，制備環(huán)糊精。用生理鹽水沖洗棕簾，將沖洗后的棕簾再放入新的培養(yǎng)基中。同樣條件培養(yǎng)2天，再取出，同第一次操作；再同樣條件培養(yǎng)2天，此過(guò)程重復(fù)10次，發(fā)酵后均測(cè)酶活，第一次酶活為5207.98U (0D值降低1/10為一個(gè)酶活單位)，第10次酶活為4472.71U，酶活為首次發(fā)酵測(cè)定酶活的85.88%。
權(quán)利要求
1.一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備β-環(huán)糊精的方法，其特征在于以棕繩固定化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶CGTase連續(xù)培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)β -環(huán)糊精的連續(xù)化制備，步驟為: (1)制備固定化基質(zhì)棕簾:棕繩編織成簾，棕簾需要先用0.3%-0.5%NaOH溶液浸泡24h，再經(jīng)煮沸4-6h，121°C 20min滅菌，待用； (2)種子培養(yǎng):采用菌株ATCC21783為CGTase產(chǎn)生菌，投放入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為:可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈉1%，其余為凈水，調(diào)整pH8.5 ；200rpm搖床培養(yǎng)3天，待光密度達(dá)到0.8，作為種子液； (3)棕繩固定化培養(yǎng):培養(yǎng)基中接種1%_3%的光密度為0.8的種子液，投放棕簾，棕簾比表面積與培養(yǎng)基體積的比以cm2:mL計(jì)為1:3-2: 3，pH8.5，29°C，200rpm搖床培養(yǎng)；培養(yǎng)2_3天后，至光密度達(dá)到1.0 ； (4)CGTase連續(xù)培養(yǎng):無(wú)菌條件下將棕簾取出，首次培養(yǎng)發(fā)酵液離心除菌后用以制備β -環(huán)糊精；取出的棕簾用滅過(guò)菌的0.9%的生理鹽水沖洗，投入新鮮配制、121 °C 20min滅菌的培養(yǎng)基中，繼續(xù)在與步驟(3)相同的條件下培養(yǎng)24-48h，得CGTase酶液； (5)按步驟(4)中所述方法取出棕簾，投放到下個(gè)循環(huán)中繼續(xù)使用；此次及以后所得發(fā)酵液無(wú)需離心，可直接做CGTase粗酶液催化淀粉制備β -環(huán)糊精； 經(jīng)10-15個(gè)循環(huán)后，酶活仍可保持為初酶活的80%-90% ； (6)β -環(huán)糊精的連續(xù)化制備:將所得的CGTase酶按照無(wú)溶劑法制備β -環(huán)糊精的方法，生產(chǎn)制備環(huán)糊精。
全文摘要
一種利用棕繩固定化細(xì)胞連續(xù)制備β-環(huán)糊精的方法，屬于β-環(huán)糊精生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用棕繩編織成棕簾再經(jīng)處理過(guò)，將環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶CGTase產(chǎn)生菌ATCC21783固定在棕簾上，搖瓶生產(chǎn)CGTase，每隔2-3天將棕簾取出，用生理鹽水清洗，洗去棕簾上的衰老退化菌落，重新投放到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；發(fā)酵產(chǎn)生的CGTase按照工業(yè)化步驟用于β-環(huán)糊精生產(chǎn)。棕簾固定化細(xì)胞使CGTase連續(xù)化產(chǎn)生，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)β-環(huán)糊精的連續(xù)化生產(chǎn)，該過(guò)程可持續(xù)一個(gè)月以上。本發(fā)明首次采用棕繩這一天然易得材料作為固定化基質(zhì)，用于固定化CGTase產(chǎn)生菌，固定化過(guò)程簡(jiǎn)單，連續(xù)化生產(chǎn)效果顯著；與現(xiàn)有β-環(huán)糊精制備工藝相比，縮短菌種產(chǎn)酶周期，簡(jiǎn)化β-環(huán)糊精制備工藝，提高生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12P19/18GK103194507SQ20131013983
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者金征宇, 岳艷, 王金鵬, 周星, 焦愛(ài)權(quán), 王亞敏, 趙建偉, 徐學(xué)明, 謝正軍, 田耀旗 申請(qǐng)人:江南大學(xué)