Capri細(xì)胞及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及CAPRI細(xì)胞及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的生物治療現(xiàn)已被廣泛作為除手術(shù)、放療及化療之外的第四種療法。目前比 較常見(jiàn)的療法有樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)療法、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)療法等。
[0003] DC療法的方案是從患者的外周血淋巴細(xì)胞中分離出DC細(xì)胞前體即單核細(xì)胞，經(jīng) IL-4、GMCSF及TNF等細(xì)胞因子激活，獲得有抗原呈遞功能的DC，在DC成熟的過(guò)程中可加入患 者腫瘤溶解物或合成腫瘤多肽或腫瘤細(xì)胞系溶解物或腫瘤抗原mRNA等腫瘤信息分子，終產(chǎn) 品DC為攜帶腫瘤信息的抗原呈遞細(xì)胞。在臨床應(yīng)用時(shí)，可將DC作為疫苗接種給患者，誘導(dǎo)患 者的免疫防御，從而達(dá)到在體內(nèi)活化激活腫瘤特異性殺傷細(xì)胞的作用。
[0004] CIK療法的方案是從患者外周血PBMC中分離出以T細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞，通過(guò)液相 中的小鼠抗人CD3抗體激活T淋巴細(xì)胞，并使用IL-2等能夠維持T細(xì)胞高速大量增殖的細(xì)胞 因子獲得大量以⑶56+/⑶3+表型的NKT細(xì)胞，通常以50ml外周血中的淋巴細(xì)胞作為起始，經(jīng) 過(guò)14-20天的培養(yǎng)，獲得十億以上的細(xì)胞，這些細(xì)胞通過(guò)靜脈回輸給腫瘤患者，以提高腫瘤 患者免疫功能，通過(guò)以非特異性殺傷為主的殺傷作用抑制腫瘤及微小轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)在也有將DC 技術(shù)結(jié)合CIK技術(shù)的報(bào)道，方案為在DC培養(yǎng)成熟后(7-10天)加入單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞再次培 養(yǎng)(7-10天），培養(yǎng)后的DC及CIK混合物再回輸患者。
[0005] 然而，腫瘤的以下特性會(huì)為腫瘤的細(xì)胞治療方案造成困難:1、腫瘤的多樣性造成 各瘤種的特異性抗原不同，從而對(duì)依賴(lài)于特異性抗原的細(xì)胞培養(yǎng)方法造成影響。2、腫瘤在 其形成、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，細(xì)胞表面所表達(dá)的腫瘤抗原會(huì)產(chǎn)生突變。3、腫瘤本身具有異 質(zhì)性。4、腫瘤在體內(nèi)能夠分泌諸如IL-6、IL-4、IL-10等能夠誘導(dǎo)免疫抑制或Th2、Thl7等不 利于細(xì)胞免疫的細(xì)胞因子，造成腫瘤殺傷免疫應(yīng)答的不足。
[0006] 以上幾個(gè)腫瘤特性均對(duì)DC療法的方案造成了不利的影響，首先，由于腫瘤的多樣 性及腫瘤抗原的突變?cè)斐蒁C療法中選取普適的腫瘤抗原成為不可能完成的任務(wù)，其次，隨 著腫瘤惡性程度的發(fā)展及從原發(fā)腫瘤到轉(zhuǎn)移腫瘤的病情發(fā)展過(guò)程，腫瘤的抗原在不斷改 變，使得在DC制備過(guò)程中加入的原發(fā)腫瘤抗原、細(xì)胞系抗原、合成多肽等失去其作用，因?yàn)?載有以上抗原的DC誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的攻擊對(duì)象在患者體內(nèi)不復(fù)存在，而大量不表達(dá)以上抗 原的變異轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞又不能被識(shí)別殺傷。此外，DC方案依賴(lài)于患者本身的免疫應(yīng)答，而患 者往往由于腫瘤所分泌的細(xì)胞因子及腫瘤術(shù)后的放化療，處于免疫抑制狀態(tài)。DC在進(jìn)入患 者體內(nèi)后，往往不能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0007] 對(duì)于非特異性殺傷的治療方案，例如CIK療法，其不足在于，以NK及NKT為主的殺傷 會(huì)受到自體MHC-C分子的抑制。在自體系統(tǒng)內(nèi)，NK及NKT細(xì)胞不能殺傷表達(dá)MHC分子的腫瘤細(xì) 胞，大量的臨床試驗(yàn)表明，超過(guò)80 %的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)MHC分子，少量晚期腫瘤細(xì)胞由于 染色體丟失、甲基化或其他分子生物學(xué)改變才會(huì)有MHC-C分子不表達(dá)的情況，在對(duì)60例自體 腫瘤的CIK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)平均殺傷率為7.35± 1.66%，僅2例殺傷率超過(guò)30%。而在 MHC不配型的異體系統(tǒng)的殺傷率則可高達(dá)85%。因此在CIK療法中MHC-C對(duì)非特異性殺傷的 抑制作用是其主要缺陷。此外在CIK療法中細(xì)胞是從新鮮培養(yǎng)物中獲取直接回輸患者，造成 制備安全性及臨床配合度方面的困擾。而且，傳統(tǒng)療法均需長(zhǎng)期(一般超過(guò)14天）的細(xì)胞培 養(yǎng)，不僅增加了工作量，設(shè)備占用率高，提高了細(xì)胞培養(yǎng)成本，而且細(xì)胞培養(yǎng)物的污染幾率 倍增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種耗時(shí)短、方便簡(jiǎn)潔并且不需要另外加入抗原成分的體外 激活和誘導(dǎo)方法，從而獲得級(jí)聯(lián)式細(xì)胞因子誘導(dǎo)激活的腫瘤特異性殺傷T淋巴細(xì)胞(CAPRI 細(xì)胞）。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的CAPRI細(xì)胞的制備方法，該方法包括外周血單 核細(xì)胞體外激活以及CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增的步驟；
[0010]所述外周血單核細(xì)胞體外激活是將外周血單核細(xì)胞用0KT3抗體(抗CD3抗體)進(jìn)行 初級(jí)刺激后，在存在細(xì)胞因子組合I的情況下進(jìn)行體外激活培養(yǎng);細(xì)胞因子組合I包括rhlL-2(重組人白細(xì)胞介素-2)和rhIFN-γ (重組人干擾素 -γ )，以及rhIL-4(重組人白細(xì)胞介素-4)、rhGM_CSF(重組人粒細(xì)胞集落刺激生物因子）、rhTNF_a(重組人腫瘤壞死因子-a)、PGE_2 (前列腺素 E2)中的至少一種；
[00?1 ] 所述CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增是將未經(jīng)上述體外激活處理的外周血單核細(xì)胞與經(jīng)過(guò)上述體 外激活處理的外周血單核細(xì)胞混合孵育，在存在細(xì)胞因子組合II的情況下進(jìn)行CAPRI細(xì)胞 擴(kuò)增培養(yǎng);細(xì)胞因子組合11包括也11^-2和^1正1丫，以及也11^-7(重組人白細(xì)胞介素-7)和/ 或IL-15(白細(xì)胞介素-15)。
[0012]本發(fā)明所述CAPRI細(xì)胞由自體同源的或同種異體的細(xì)胞構(gòu)成。
[0013]前述的方法，未經(jīng)體外激活處理的外周血單核細(xì)胞與經(jīng)過(guò)體外激活處理的外周血 單核細(xì)胞按1:10-1 〇: 1的比例混合，優(yōu)選按1:1的比例混合。
[0014] 前述的方法，在進(jìn)行初級(jí)刺激之前，先從患者外周血中分離、純化單核細(xì)胞，具體 方法為：抽取患者外周血，加肝素抗凝處理，然后分裝至離心管中1500g離心20分鐘，棄上 清，向離心管中加入RPMI1640培養(yǎng)基100-200ml，制成淋巴細(xì)胞懸液，然后加入到預(yù)置有淋 巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心后將淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加 RPMI 1640培養(yǎng) 基重懸，750g離心5-12分鐘，棄上清，重復(fù)以上重懸、離心操作1次，向獲得的單核細(xì)胞中加 完全培養(yǎng)液，制成淋巴細(xì)胞懸液;或者，采用白細(xì)胞分離技術(shù)從患者外周血中獲得單核細(xì) 胞，向獲得的單核細(xì)胞中加完全培養(yǎng)液，制成淋巴細(xì)胞懸液。
[0015] 所述完全培養(yǎng)液的制備方法為:全血于1500g離心20分鐘，棄上清，4°C靜置過(guò)夜， 再于1500g離心15分鐘，取上清作為培養(yǎng)基中添加的血漿;向RPMI 1640培養(yǎng)基中加入血漿， 并按100U/ml濃度加入慶大霉素，制成含ΙΟv/v%自身血漿的完全培養(yǎng)液。
[0016] 所述外周血單核細(xì)胞體外激活的具體方法為：
[0017] 1)細(xì)胞培養(yǎng)瓶處理：用PH8.6的PBS緩沖液配制濃度為2μg/ml的0KT3抗體包被液， 向75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入12ml包被液，4°C過(guò)夜處理，使用前去掉包被液，用生理鹽水洗1-2次，然后每瓶加入18ml完全培養(yǎng)液；
[0018] 2)體外激活：向上述培養(yǎng)瓶中加入含6 X107個(gè)單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液12ml，于 38°C，6%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，進(jìn)行初級(jí)刺激;3小時(shí)后加入激活培養(yǎng)基I 0.5ml，繼續(xù)培 養(yǎng)3小時(shí)，獲得體外激活的外周血單核細(xì)胞。
[0019] 其中，所述激活培養(yǎng)基I中含rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-y 10-2000IU/ml、 rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-a200-500IU/ml及PGE-2 l-5μg/ml， 以水配制。
[0020] 所述CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增的具體方法為：向體外激活的外周血單核細(xì)胞中加入含3 X 107-6X107個(gè)單核細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液12ml，于38°C，6%C02培養(yǎng)箱中孵育16小時(shí)，然后于 750g離心8分鐘，棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，800g離心5分鐘后，棄上清，用RPMI 1640培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1 X 106-5 X 106個(gè)/ml，加入激活培養(yǎng)基 II，于38°C，6%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增。
[0021] 其中，所述激活培養(yǎng)基II中含rhIL-2 100-2000IU/ml、rhIFN-y 100-2000IU/ml、 rhIL-7 10-200IU/ml及IL-15 10-300IU/ml，以水配制。
[0022] 前述的方法，還包括CAPRI細(xì)胞收獲、凍存及復(fù)蘇的步驟，具體如下：
[0023] CAPRI細(xì)胞收獲的方法為:將CAPRI細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)物800g離心10分鐘，棄上清，用生 理鹽水重懸細(xì)胞，同時(shí)取樣送質(zhì)量控制檢測(cè)；
[0024]凍存的方法為:將生理鹽水重懸的細(xì)胞800g離心10分鐘，棄上清，并用4ml冷凍液A 重懸，置于冰上，加入4ml預(yù)冷的冷凍液B，分裝后保存于液氮或-80°C冰箱中；
[0025]復(fù)蘇的方法為:將待復(fù)蘇的細(xì)胞于37°C水浴中解凍，并轉(zhuǎn)移到預(yù)置有10ml細(xì)胞復(fù) 蘇液的離心管中，750g離心5分鐘，然后用生理鹽水重懸細(xì)胞，再750g離心5分鐘，重復(fù)以上 重懸、離心操作步驟3次;最后用2ml細(xì)胞復(fù)蘇液重懸，準(zhǔn)備回