專利名稱：強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程和基因工程領(lǐng)域，涉及一類強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的分泌系統(tǒng)不僅是蛋白質(zhì)分選、定位和實(shí)現(xiàn)生理功能的前提，更是基因工程及蛋白質(zhì)工程技術(shù)開發(fā)的重要手段。人們已經(jīng)研究出多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)用以生產(chǎn)重組蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其遺傳背景清楚、操作簡單、能在廉價(jià)培養(yǎng)基中迅速生長及易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注；目前大腸桿菌體系已用于制備多種酶制劑，甚至一些藥用蛋白質(zhì)，如干擾素、胰島素和人血清蛋白等，在生物技術(shù)領(lǐng)域取得了令人矚目的成果O在大腸桿菌中，重組蛋白在原則上可以被以下幾種方式生產(chǎn):1、可溶性蛋白胞內(nèi)生產(chǎn)；2、包涵體胞內(nèi)生產(chǎn)；3、分泌至周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基中。大腸桿菌體系適合于生產(chǎn)翻譯后無需修飾加工的蛋白質(zhì)，且由于大腸桿菌缺乏蛋白折疊過程中需要的輔助因子，往往使中間體大量積聚，易形成包涵體沉淀，還須經(jīng)過復(fù)性等繁瑣過程；而周質(zhì)氧化型的氧化還原環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的折疊。如果蛋白質(zhì)跨過細(xì)胞的內(nèi)膜定位于周質(zhì)空間，甚至穿過細(xì)胞外膜直接分泌至胞外培養(yǎng)基中，可以極大簡化下游復(fù)性及分離純化工藝，減少表達(dá)蛋白對(duì)宿主菌的毒性和代謝負(fù)擔(dān)，顯著提高表達(dá)量?，F(xiàn)有的分泌表達(dá)體系大多數(shù)是分泌到周質(zhì)空間，獲取重組蛋白仍然需要細(xì)胞破碎和純化。少數(shù)分泌到胞外的則由于大腸桿菌本身的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)不夠完善，或人類對(duì)其分泌系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的局限性，導(dǎo)致了分泌效率極低及融合蛋白的后加工問題。信號(hào)肽是一類10-60個(gè)氨基酸左右的多肽，一般位于分泌蛋白的N端。利用信號(hào)肽分泌表達(dá)蛋白，一般操作方法是將目的蛋白的編碼基因克隆到信號(hào)肽序列后端，在宿主中實(shí)現(xiàn)目的基因和信號(hào)肽序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的融合，依靠蛋白質(zhì)前體N端信號(hào)肽引導(dǎo)整個(gè)多肽鏈與胞內(nèi)分子伴侶或分泌信號(hào)識(shí)別顆粒的結(jié)合、膜定位或分泌出胞外。盡管胞外分泌表達(dá)策略相比其他表達(dá)方式有著顯著的優(yōu)勢(shì)，但是目前在大腸桿菌體系中廣泛運(yùn)用此種策略仍有諸多限制。因此，擁有能夠攜帶目的蛋白分泌出胞外的信號(hào)肽是先決條件，并且即使信號(hào)肽具有介導(dǎo)蛋白胞外分泌的能力，也并不表明特定的信號(hào)肽對(duì)所有的重組蛋白具有這種介導(dǎo)能力或者具有同樣水平的介導(dǎo)能力。每個(gè)重組蛋白具有自己特定的編碼基因，信號(hào)肽和重組蛋白的過渡點(diǎn)序列不同，而且重組蛋白自身的結(jié)構(gòu)也有差異，因而重組蛋白的分泌水平取決于其信號(hào)肽的最優(yōu)化水平、目標(biāo)蛋白有利的跨膜結(jié)構(gòu)以及它們之間的匹配度水平。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，分泌蛋白穿越質(zhì)膜的基本分泌途徑以Sec或Tat這兩種系統(tǒng)為主，例如外膜 蛋白(OmpA)信號(hào)肽、果膠酸脂裂解酶(PelB)信號(hào)肽通過Sec途徑，三甲胺N氧化物還原酶(TorA)信號(hào)肽通過Tat途徑，這兩種類型的信號(hào)肽都有成功運(yùn)用于分泌表達(dá)外源蛋白的案例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種具有增強(qiáng)信號(hào)肽分泌效率的功能的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，使得通過在諸如ompA信號(hào)肽或pelB信號(hào)肽前端融合添加本發(fā)明的小肽模序，可以實(shí)現(xiàn)上述信號(hào)肽在大腸桿菌體系中的分泌表達(dá)外源蛋白的能力。本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)目的在于提供上述具有增強(qiáng)信號(hào)肽分泌效率的功能的強(qiáng)分泌信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的應(yīng)用，即將此小肽模序用于構(gòu)建一種增強(qiáng)普通信號(hào)肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達(dá)外源蛋白的方法。本發(fā)明中的術(shù)語“分泌”，是指蛋白質(zhì)或肽的分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞的外部，而且它也包括這樣的情況:其中蛋白質(zhì)或肽分子最終以完全游離的形式置于培養(yǎng)基中，以及其中部分蛋白質(zhì)處在細(xì)菌外部或部分蛋白質(zhì)存在于細(xì)菌的周質(zhì)空間。本發(fā)明中使用的下列術(shù)語除非特別說明具有如下的含義:蛋白質(zhì)氨基酸或多核苷酸的“變體”是指具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述“改變”可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可以具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸?！叭笔А笔侵赴被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械囊粋€(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失?！安迦搿被颉疤砑印笔侵赴被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄械母淖儗?dǎo)致與原先分子相比，一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的增加?！疤鎿Q”是指由不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一、強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列:Μ( α X β Y Y /α Υβ X Y )η,其中X代表酸性氨基酸；Y代表堿性氨基酸；α為0-2個(gè)中性氨基酸；β代表0-2個(gè)中性氨基酸；y代表1-10個(gè)中性氨基酸；η 為 1-3。其中，通式中的“ / ”為“或者”之意。進(jìn)一步的，X代表的酸性氨基酸優(yōu)選為Glu或Asp。進(jìn)一步的，Y代表的堿性氨基酸優(yōu)選為Arg或Lys。進(jìn)一步的，中性氨基酸優(yōu)選為Ala、Cys、Leu、Val、He或者Phe。進(jìn)一步的，當(dāng)n=l時(shí)，本發(fā)明的小肽膜序的增強(qiáng)分泌效果較佳。進(jìn)一步的，作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施例，當(dāng)α為I個(gè)中性氨基酸，β為O個(gè)中性氨基酸，Y為2-5個(gè)中性氨基酸，X為Glu，Y為Arg時(shí)，該小肽膜序的增強(qiáng)分泌效果最佳。

因此，根據(jù)上述通式得出的本發(fā)明所保護(hù)的小肽模序，其例如原始小肽模序?yàn)?MERACVAV ;則其衍生的類似物可以如下變化:MREACVAVMAERACVAV ；MEARACVAV ；MDKACVAV ；MERLIVFAV;...。或小肽模序的疊加如MERACVA+VEARLIVFAV等，更多衍化類型詳見本發(fā)明具體實(shí)施方式
。二、本發(fā)明還要求保護(hù)本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的變體，其具有對(duì)本發(fā)明的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的其中I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或性質(zhì)相似的氨基酸取代I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)可知，這種變體仍具有信號(hào)肽的特性或增強(qiáng)分泌的功能，因此，其也應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明要求保護(hù)的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的范圍。三、編碼具有本發(fā)明所示的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的多肽、類似物或衍生物的多核苷酸。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)可知，這種類似物或衍生物的多核苷酸仍具有信號(hào)肽的特性或增強(qiáng)分泌的功能，因此，其也應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明要求保護(hù)的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的范圍。四、一種含有外 源多核苷酸的重組載體，其是由本發(fā)明第三點(diǎn)所述的多核苷酸與質(zhì)粒載體構(gòu)建而成的重組載體。五、一種含有外源多核苷酸的遺傳宿主細(xì)胞，它是由第四點(diǎn)所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。六、本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的應(yīng)用，即將本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序用于構(gòu)建一種增強(qiáng)普通信號(hào)肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達(dá)外源蛋白的方法。具體的，是指通過在信號(hào)肽前端融合添加本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，以此構(gòu)建的分泌載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸表達(dá)宿主后誘導(dǎo)表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的增強(qiáng)分泌功能。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中,采用Arthrobacter arilaitensis來源的果糖苷酶FRU6和來源于枯草芽孢桿菌B.subtilis的葡聚糖酶BGL作為目標(biāo)蛋白，普通的信號(hào)肽選自外膜蛋白的ompA和來自果膠酸脂裂解酶的pelB信號(hào)肽。通過在ompA或pelB信號(hào)肽前端融合添加本發(fā)明的小肽模序，以此構(gòu)建的分泌載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸表達(dá)宿主后誘導(dǎo)表達(dá)，通過檢測(cè)方法驗(yàn)證本發(fā)明的小肽模序的增強(qiáng)分泌功能。本發(fā)明采用的宿主為E.coil BL21 (DE3)，以大腸桿菌pET_22b作為載體構(gòu)建的基本框架，去除原pET-22b中的peIB信號(hào)肽序列。通過重疊PCR的方法融合ompA信號(hào)肽/peIB信號(hào)肽和果糖苷酶FRU6或葡聚糖酶BGL，設(shè)計(jì)上游引物將小肽模序基因添加到信號(hào)肽基因序列前。通過酶切位點(diǎn)的酶切和連接操作，構(gòu)建成分泌增強(qiáng)型表達(dá)載體pET-EompA-FRU6和pET-EpelB-FRU6 以及 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL。將含有融合的增強(qiáng)分泌型信號(hào)肽與果糖苷酶FRU6 (或葡聚糖酶BGL)基因的重組質(zhì)粒載體 pET-EompA-FRU6 和 pET-EpelB-FRU6 (或 pET-EompA-BGL 和 pET-EpelB-BGL)轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主大腸桿菌BL21后，分別命名為BL21/pET-EompA-FRU6和BL21/pET_EpelB_FRU6 (或BL21/pET-EompA-BGL 和 BL21/pET-Epe 1B-BGL )。在 LB 培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)劑為 IPTG。上述兩種目標(biāo)蛋白分泌表達(dá)后的結(jié)果通過檢測(cè)培養(yǎng)基細(xì)胞內(nèi)外的酶活以及SDS-PAGE 分析。本發(fā)明采用的分泌實(shí)例為果糖苷酶？冊(cè)6以及3-1，3-1，4葡聚糖酶86匕果糖苷酶FRU6 (分子量約為55kDa,來源于Arthrobacter arilaitensis NJEM01,菌種保藏號(hào)CCTCC M2012155)。果糖苷酶系統(tǒng)分類號(hào)為EC3.2.1.80，是一種胞外酶，特異性地催化水解由β -D-果糖組成的果聚糖分子中的非還原性末端2，l-β -糖苷鍵或2，6-β -糖苷鍵，此夕卜，還可水解菊糖、蔗糖、棉子糖等。在生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域均有著廣泛的利用價(jià)值。葡聚糖酶BGL(分子量約為28kDa，EC3.2.1.73，β -葡聚糖酶，來源于枯草芽孢桿菌B.subtilis)是一種內(nèi)切水解酶，能高效、轉(zhuǎn)移性地水解β -葡聚糖中與β -1, 3糖苷鍵毗鄰的β -1，4糖苷鍵，從而減少谷物中葡聚糖給工業(yè)生產(chǎn)帶來的負(fù)面影響，在啤酒釀造業(yè)、飼料業(yè)等領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用。除上述以外，本發(fā)明的有益效果還在于:本發(fā)明的可增強(qiáng)分泌功能的小肽模序，其對(duì)目標(biāo)蛋白的增強(qiáng)分泌效果顯著。運(yùn)用在果糖苷酶FRU6的分泌表達(dá)實(shí)例的實(shí)驗(yàn)顯示，在ompA信號(hào)肽前添加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了達(dá)5.1倍，在pelB信號(hào)肽前添加小肽模序比未添加的分泌效率最高提高了達(dá)5.4倍。運(yùn)用在葡聚糖酶BGL的分泌表達(dá)實(shí)例顯示，小肽模序?qū)mpA信號(hào)肽最高提高了 2.3倍，對(duì)PelB信號(hào)肽最高提高了 2.5倍。另夕卜，本發(fā)明所構(gòu)建的分泌表達(dá)載體可以運(yùn)用到多種重組蛋白生產(chǎn)上。


圖1重組載體pET-EompA_FRU6的圖譜；其中，ompA SP:外膜蛋白A信號(hào)肽編碼序列；FRU6:果糖苷酶FRU6編碼序列；Ampsequence:氨節(jié)霉素抗性基因編碼序列`；T7promoter:T7啟動(dòng)子。圖2小肽模序增強(qiáng)分泌效率與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系。圖3LB 培養(yǎng)基中 BL21/pET-EompA-FRU6 和 BL21/pET_EpelB_FRU6 與陰性對(duì)照發(fā)酵上清液酶活力比較。圖4LB培養(yǎng)基中BL21/pET-EompA-FRU6發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜；其中，M:蛋白質(zhì)Marker ; I和2:陰性對(duì)照，果糖苷酶FRU6前不含信號(hào)肽序列的BL21菌株發(fā)酵上清液和菌體破碎上清；3和4:BL21/pET-ompA-FRU6菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。5和6:BL21/pET-EompA-FRU6菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。(pET-EompA-FRU6質(zhì)粒中，ompA信號(hào)肽前添加的小肽模序序列為MERACALA)。箭頭方向?yàn)楣擒彰窮RU6成熟肽分子量大小位置。圖5LB培養(yǎng)基中BL21/pET-EpelB-FRU6發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜；其中，M:蛋白質(zhì)Marker ;1和2:陰性對(duì)照，果糖苷酶FRU6前不含信號(hào)肽序列的BL21菌株發(fā)酵上清液和菌體破碎上清；3和4:BL21/pET-pelB-FRU6菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。5和6:BL21/pET-EpelB-FRU6菌株發(fā)酵上清和菌體破碎上清。(pET-EpelB-FRU6質(zhì)粒中，pelB信號(hào)肽前添加的小肽模序序列為MERACALA)。箭頭方向?yàn)楣擒彰窮RU6成熟肽分子量大小位置。
圖6LB培養(yǎng)基中BL21/pET-EompA-BGL發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜；其中，M:蛋白質(zhì)Marker ;1和2:陰性對(duì)照，葡聚糖酶BGL前不含信號(hào)肽序列的BL21菌株發(fā)酵上清液和菌體破碎上清；3和4:BL21/pET-ompA-BGL菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。5和6:BL21/pET-EompA-BGL菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。(pET-EompA-BGL質(zhì)粒中，ompA信號(hào)肽前添加的小肽模序序列為MERACALA)。箭頭方向?yàn)槠暇厶敲窧GL成熟肽分子量大小位置。圖7LB培養(yǎng)基中BL21/pET-EpelB-BGL發(fā)酵液的SDS-PAGE電泳圖譜；其中，M為蛋白質(zhì)Marker ；1和2:陰性對(duì)照，葡聚糖酶BGL前不含信號(hào)肽序列的BL21菌株發(fā)酵上清液和菌體破碎上清；3和4:BL21/pET-pelB-BGL菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清；5和6:BL21/pET-EpelB-BGL菌株發(fā)酵液上清和菌體破碎上清。(pET-EpelB-BGL質(zhì)粒中，peIB信號(hào)肽前添加的小肽模序序列為MERACALA)。箭頭方向?yàn)槠暇厶敲窧GL成熟肽分子量大小位置。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用涉及質(zhì)粒、試劑等材料均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1.小肽增強(qiáng)模序在果糖苷酶分泌表達(dá)上的應(yīng)用首先,本實(shí)施例所述的果糖苷酶Fru6基因的來源是:Arthrobacter arilaitensisNJEMOl菌，為本發(fā)明人的在先中國專利申請(qǐng)CN102732456A，該菌株的保藏編號(hào)為=CCTCCNO:M2012155o 本實(shí)施例所涉及的所有引物均由英駿公司合成，見表I。以下引物編號(hào)統(tǒng)一用“P”加序號(hào)來表示，例如，表2中的第45號(hào)引物，其代碼即P45，其在序列表的編號(hào)為SEQ ID NO:45。表I實(shí)施例1所需的引物和合成序列的核苷酸序列
SEQiDNO引物核苷酸序列(S’-3’)^
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_10_CCGGAATTCTTACTTTCCTACTCCTTTGCC_注:表中下劃線部分所示為限制性酶切位點(diǎn)。(I)果糖苷酶FRU6基因獲取:以 Arthrobacter arilaitensis NJEMOl 菌的基因組為模板，采用引物Pl和P2進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出果糖苷酶FRU6的基因片段(不含該酶自身信號(hào)肽序列)?？寺〉娇寺≥d體PMD18-T載體中，得到PMD-T-FRU6，轉(zhuǎn)化進(jìn)克隆宿主DH5 α中，DNA序列測(cè)定以驗(yàn)證其正確性。(2)信號(hào)肽與果糖苷酶基因的融合:人工合成ompA和pelB信號(hào)肽基因序列(即引物Pll和引物P12)，提取第(I)步中的質(zhì)粒PMD-T-FRU6。通過設(shè)計(jì)重疊PCR引物P3-P6或P7-P10,分別將果糖苷酶FRU6和信號(hào)肽ompA或pelB融合，其中P6和PlO均帶有EcoR I酶切位點(diǎn)。(3)增強(qiáng)分泌型載體的設(shè)計(jì):以小肽模序氨基酸序列為MERACALA，更多小肽模序見表2和表3。以第二步中的融合基因?yàn)槟０澹ㄟ^設(shè)計(jì)上游引物P45與P46，P45與P46分別均帶有Nde I酶切位點(diǎn)。通過普通PCR反應(yīng)，引物P45與P6聯(lián)用可以使得小肽模序基因添加到ompA信號(hào)肽基因前；引物P46和PlO聯(lián)用可以使得小肽模序基因(如小肽模序氨基酸序列為MERACALA)添加到pelB信號(hào)肽基因前。經(jīng)Nde I和EcoR I雙酶切獲得黏性末端的目的片段。將pET_22b載體(英駿公司購得)也用限制酶Nde I和EcoR I進(jìn)行酶切降解，回收去除pelB信號(hào)肽序列的質(zhì)粒大片段。然后將回收的質(zhì)粒大片段和增強(qiáng)分泌型信號(hào)肽與果糖苷酶融合基因的酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶連接后得到pET-EompA-FRU6 (質(zhì)粒圖譜見圖1)和pET-EpelB-FRU6(質(zhì)粒圖譜與前者類似，故略)。轉(zhuǎn)化進(jìn)克隆宿主大腸桿菌DH5 α中，DNA序列測(cè)定以驗(yàn)證其正確性。表2對(duì)應(yīng)果糖苷酶涉及的增強(qiáng)分泌的小肽模序氨基酸序列及引物和酶活
權(quán)利要求
1.強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于其具有如下通式的氨基酸序列Μ(αΧβΥγ/α ΥβΧγ)η, 其中X代表酸性氨基酸； Y代表堿性氨基酸； α為0-2個(gè)中性氨基酸； β代表0-2個(gè)中性氨基酸； Y代表ι- ο個(gè)中性氨基酸； η 為 1-3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于所述的X代表的酸性氨基酸為Glu或Asp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于所述的Y代表的堿性氨基酸為Arg或Lys。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于所述的中性氨基酸為 Ala、Cys> Leu、Val、Ile 或者 Phe。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于所述的η為I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其特征在于所述的α為I個(gè)中性氨基酸，β為O個(gè)中性氨基酸，Y為2-5個(gè)中性氨基酸，X為Glu，Y為Arg。
7.權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的變體，其具有權(quán)利要求I的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的其中I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或性質(zhì)相似的氨基酸取代I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
8.編碼具有權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的多肽、類似物或衍生物的多核苷酸。
9.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其是由權(quán)利要求8所述的多核苷酸與質(zhì)粒載體構(gòu)建而成的重組載體。
10.一種含有外源多核苷酸的遺傳宿主細(xì)胞，它是由權(quán)利要求9所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求I所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的應(yīng)用，其特征在于將強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序用于構(gòu)建一種增強(qiáng)普通信號(hào)肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達(dá)外源蛋白的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程和基因工程領(lǐng)域，涉及一類強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用。本發(fā)明的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，其具有如下通式的氨基酸序列M(αXβYγ/αYβXγ)n，其中X代表酸性氨基酸；Y代表堿性氨基酸；α為0-2個(gè)中性氨基酸；β代表0-2個(gè)中性氨基酸；γ代表1-10個(gè)中性氨基酸；n為1-3。本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的應(yīng)用，即將本發(fā)明所述的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序用于構(gòu)建一種增強(qiáng)普通信號(hào)肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達(dá)外源蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103254277SQ20131016245
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月3日
發(fā)明者何冰芳, 陳文華, 米蘭, 吳珊珊, 朱蕓, 陳珊珊 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)