專利名稱:一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于合成生物學(xué)領(lǐng)域,涉及一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
番茄紅素是一種重要的抗氧化劑,具有抗衰老,抗腫瘤和降低中風(fēng)、心腦血管等疾病風(fēng)險的功效,因此其可作為天然保健食品或藥物。番茄紅素在食品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要用途,具有廣闊的市場價值。目前世界上番茄紅素的開發(fā)生產(chǎn)主要有天然提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵等方法。天然提取主要是通過大量種植西紅柿,果實成熟后通過萃取純化獲得。這種植物源的天然產(chǎn)物已廣受消費者接受,然而此種生產(chǎn)方式有眾多劣勢。首先基于植物源材料的工業(yè)生產(chǎn)嚴(yán)重依賴其產(chǎn)量,受天氣等不可控因素影響,具有不穩(wěn)定性;大面積種植成本居高不下;具有明顯的季節(jié)性;在植物果實中含量很低,而且天然萃取產(chǎn)率低。而利用微生物生產(chǎn)能很好的克服這些問題。微生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素具有周期短,成本低、環(huán)保、安全性高、原料易獲取,產(chǎn)物易純化等特點。微生物發(fā)酵最大的瓶頸在于如何實現(xiàn)工業(yè)化,而工業(yè)化的必要條件是其產(chǎn)量需要滿足可以工業(yè)化的水平。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足,提供一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述生產(chǎn)番茄紅素的菌株的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用上述菌株生產(chǎn)番爺紅素的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種提高原核生物生產(chǎn)番茄紅素能力的方法。一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株,含有甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的番茄紅素合成的相關(guān)基因;所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因包括(I)將乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A的基因atoB、(2)將乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合為HMG-CoA的基因ergl3、(3)將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的基因thmgl、(4)將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因ergl2、(5)將甲羥戊酸_5_磷酸磷酸化為甲羥戊酸_5_焦磷酸的基因erg8、(6)將甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的基因mvdl和(7)將異戊烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi ;所述的番茄紅素合成的相關(guān)基因包括(I)將異戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸縮合為櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸的基因crtE、(2)將兩個櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸縮合為八氫番茄紅素的基因crtB和(3)將八氫番茄紅素脫氫生成番爺紅素的基因crtl。所述的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因優(yōu)選為來源于大腸桿菌BL21 (DE3)的atoB(CP001509.3:2216470-2217654)、idi (CP001509.3:2863926-2864474)和來源于釀酒酵母 INVSCl 的 ergl3 (329138949:19060-20535)、 thmgl (329138949:115734-117239)、ergl2 (329138949:684467-685798)、erg8 (329138949:712316-713671)、mvdl(329138953:701895-703085)。所述的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的crtE、crtB和crtl基因優(yōu)選為以來源于菠蘿泛菌Pantoea ananatis 的 crtE (D90087.2:225-1133)、crtB (D90087.2:5057-5986)和 crtl(D90087.2:3582-5060)基因為基礎(chǔ)進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到,經(jīng)過密碼子優(yōu)化的crtE、crtB和crtl基因的序列優(yōu)選為如SEQID N0.1 3所示的序列。優(yōu)選的,所述的生產(chǎn)番茄紅素的菌株為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒pFZllO的大腸桿菌;所述的質(zhì)粒PMHl以pBBRlMCS為骨架載體、啟動子為Iac啟動子,復(fù)制子替換為pl5A復(fù)制子,包含atoB、ergl3和thmgl基因,pMHl的序列(不含骨架載體序列)如SEQID N0.4所示;所述的質(zhì)粒pFZ81以pBBRlMCS-2為骨架載體、啟動子為Iac啟動子、復(fù)制子為質(zhì)粒自帶的pBBRlMCS復(fù)制子,包含ergl2、erg8、mvdl和idi基因,pFZ81的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0 .5所示;所述的質(zhì)粒pFZllO以pET28a(+)為骨架載體、啟動子為T7強(qiáng)啟動子、復(fù)制子為質(zhì)粒自帶的高拷貝的PBBR322復(fù)制子,包含crtE、crtB和crtl基因,pFZllO的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.6所示。更優(yōu)選的,所述的生產(chǎn)番茄紅素的菌株為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒PFZlll的大腸桿菌;所述的質(zhì)粒pFZlll以pET28a(+)為骨架載體、啟動子為T7強(qiáng)啟動子、復(fù)制子為質(zhì)粒自帶的高拷貝的pBBR322復(fù)制子,包含crtE、crtB、crtl和idi基因,pFZlll的序列(不含骨架載體序列)如SEQ ID N0.7所示。上述生產(chǎn)番茄紅素的菌株在生產(chǎn)番茄紅素中的應(yīng)用。利用上述生產(chǎn)番茄紅素的菌株生產(chǎn)番茄紅素的方法,包含如下步驟:將上述生產(chǎn)番茄紅素的菌株種子液接入含碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行原核表達(dá)得到番茄紅素。所述的碳源優(yōu)選為甘油、單糖(木糖,葡萄糖等)或多糖(纖維素等),更優(yōu)選的,所述的碳源為五碳糖(木糖)。所述的培養(yǎng)基優(yōu)選為2 X TY培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基。所述的原核表達(dá)的誘導(dǎo)時間優(yōu)選為菌液的0D_為20 40。所述的原核表達(dá)優(yōu)選為在發(fā)酵罐中進(jìn)行;在發(fā)酵罐中用M9培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)時,最佳誘導(dǎo)時間為菌液的0D_為40。原核表達(dá)時MVA途徑各蛋白比例優(yōu)選為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi=l-55: 2-15: 2-30: 1-5: 1-5: 2-20: 4-600 ;更優(yōu)選的,AtoB: ERG13: tHMGl:ERGI2: ERG8: MVDl: Idi=1: 10: 2: 5: 5: 2: 5。一種提高原核生物生產(chǎn)番茄紅素能力的方法,通過對番茄紅素合成的相關(guān)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化;或使MVA途徑各蛋白更加接近AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl:Idi=I: 10: 2: 5: 5: 2: 5 的進(jìn)一步改造;或過表達(dá) Id1、ERG8、MVDl、ERG13、ERG12 和tHMGl中的任一或多個基因可以實現(xiàn)。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果:代謝通路中各個蛋白并不是按照等摩爾情況才是最高效的,而是應(yīng)該按照一定比例來最大化反應(yīng)速率,本發(fā)明利用體外重建體系研究確定了MVA途徑各個蛋白的最佳比例為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi=I: 10: 2: 5: 5: 2: 5,然后通過更加理性的合成生物學(xué)手段改造通過MVA途徑生產(chǎn)番茄紅素的各蛋白的比例,通過控制這些蛋白的比例,在最短時間內(nèi)能快速的提高番茄紅素的產(chǎn)量,該方法比傳統(tǒng)基因工程利用隨機(jī)改變代謝通路上的蛋白表達(dá)量更具有目標(biāo)性,因而實驗更加理性、快速、有效。同時本發(fā)明通過密碼子優(yōu)化合成番茄紅素合成相關(guān)基因,使得這些基因能夠更容易在異源宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。再者,在后續(xù)的發(fā)酵過程中,我們將發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化。通過這些技術(shù)使番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到lg/L以上,且發(fā)酵周期縮短50%以上,具有很好的工業(yè)運用前景。
圖1是甲羥戊酸途徑示意圖。圖2是番茄紅素合成途徑示意圖。圖3是Idi利于萜類化合物生產(chǎn)示意圖。圖4是MVA途徑各蛋白優(yōu)化比例對反應(yīng)速率的影響圖。圖5是質(zhì)粒pMHl示意圖。圖6是質(zhì)粒pFZ81示意圖。圖7是質(zhì)粒pFZllO示意圖。圖8是質(zhì)粒pFZlll示意圖。圖9是本發(fā)明番茄紅素生產(chǎn)菌株(L1、L2和L3)示意圖。圖10是L1、L2和L3菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素結(jié)果圖,LI通過MEP途徑生產(chǎn)番茄紅素,L2和L3通過MEP和MVA途徑生產(chǎn)番茄紅素。圖11是L3菌株用2XTY培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵罐不同誘導(dǎo)時間發(fā)酵結(jié)果圖。圖12是L3菌株用M9進(jìn)行發(fā)酵罐不同誘導(dǎo)時間發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素結(jié)果圖。
具體實施例方式以下實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明,但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明,實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。通過體外重建實驗表明增加ERG13,ERG8和Idi對重建體系中萜類化合物生產(chǎn)有促進(jìn)作用,特別是增加Idi的效果更加明顯,體外重建實驗獲得的甲羥戊酸途徑各個蛋白的優(yōu)化比例為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi=l: 10: 2: 5: 5: 2: 5。隨后從大腸桿菌和釀酒酵母基因組DNA中擴(kuò)增相應(yīng)基因構(gòu)建了用于大腸桿菌表達(dá)的甲羥戊酸途徑。隨后經(jīng)密碼子優(yōu)化和基因合成構(gòu)建了從甲羥戊酸產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)生產(chǎn)番茄紅素的通路,并實現(xiàn)了重組大腸桿菌高效生產(chǎn)番茄紅素。相關(guān)反應(yīng)途徑見圖1和圖2。經(jīng)蛋白定量實驗發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的菌株與體外實驗獲得的優(yōu)化比例還有一定差距,還有較大的提升潛能有待挖掘,可以朝著蛋白優(yōu)化比例進(jìn)行進(jìn)一步改造。
實施例中所用到的引物如表I所示:
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株,其特征在于含有甲羥戊酸途徑和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的番爺紅素合成的相關(guān)基因;所述的甲輕戍酸途徑的相關(guān)基因包括aioAerWJ、thmgl、ergl2、erg8、mvdl和idi基因;所述的番爺紅素合成的相關(guān)基因包括crtE、crtB和cri/基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)番茄紅素的菌株,其特征在于:所述的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的crtE、crtB和crtl基因的序列如SEQ ID N0.1-3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)番茄紅素的菌株,其特征在于:生產(chǎn)番茄紅素的菌株為含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒pFZllO的大腸桿菌或含有質(zhì)粒pMHl、質(zhì)粒pFZ81和質(zhì)粒PFZlll的大腸桿菌; 所述的質(zhì)粒PMHl以pBBRlMCS為骨架載體、復(fù)制子為pl5A、啟動子為Iac啟動子、包含atoB、ergl3 和 thmgl 基因; 所述的質(zhì)粒PFZ81以pBBRlMCS-2為骨架載體、復(fù)制子為pBBRlMCS復(fù)制子、啟動子為Iac 啟動子、包含和 idi 基因; 所述的質(zhì)粒PFZllO以pET28a(+)為骨架載體、復(fù)制子為pBBR322高拷貝復(fù)制子、啟動子為T7強(qiáng)啟動子、包含crtE、crtB和crtl基因; 所述的質(zhì)粒PFZlll以pET28a(+)為骨架載體、復(fù)制子為pBBR322高拷貝復(fù)制子、啟動子為T7強(qiáng)啟動子、包含crtE、crtB、crtl和idi基因。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的菌株在生產(chǎn)番爺紅素中的應(yīng)用。
5.利用權(quán)利要求1-3任一項所述的菌株生產(chǎn)番茄紅素的方法,其特征在于包含如下步驟:將權(quán)利要求1-3任一項所述的菌株種子液接入含碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行原核表達(dá)得到番茄紅素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)番茄紅素`的方法,其特征在于:所述的碳源為甘油、單糖或多糖;所述的培養(yǎng)基為2 X TY培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基;所述的原核表達(dá)的誘導(dǎo)時間為菌液的OD600 為 20 40。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)番茄紅素的方法,其特征在于:在發(fā)酵罐中用M9培養(yǎng)基進(jìn)行原核表達(dá)時,誘導(dǎo)時間為菌液的0D_為40。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)番爺紅素的方法,其特征在于:原核表達(dá)時甲羥戊酸途徑各蛋白比例為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi=l-55: 2-15: 2-30: 1-5: 1-5: 2-20: 4-600。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)番爺紅素的方法,其特征在于:原核表達(dá)時甲羥戊酸途徑各蛋白比例為AtoB: ERG13: tHMGl: ERG12: ERG8: MVDl: Idi=l: 10: 2: 5: 5: 2: 5。
10.一種提高原核生物生產(chǎn)番爺紅素能力的方法,其特征在于包含如下方法:對番爺紅素合成的相關(guān)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化;或使甲羥戊酸途徑各蛋白更加接近AtoB: ERG13:tHMGl: ERGl2: ERG8: MVDl: Idi=I: 10: 2: 5: 5: 2: 5 的進(jìn)一步改造;或過表達(dá)ii/1、erg8、mvdl、ergl3、ergl2 和 thmgl 中的任一或多個基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)番茄紅素的菌株及其應(yīng)用,屬于合成生物學(xué)領(lǐng)域。生產(chǎn)番茄紅素的菌株含有甲羥戊酸途徑和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的番茄紅素合成的相關(guān)基因;經(jīng)密碼子優(yōu)化的番茄紅素合成基因序列如SEQIDNO.1-3所示。該菌株可用于生產(chǎn)番茄紅素,將其種子液接入含碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行原核表達(dá)得到番茄紅素。對番茄紅素合成的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化或使甲羥戊酸途徑各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5可以進(jìn)一步促進(jìn)生產(chǎn)番茄紅素。本發(fā)明使番茄紅素產(chǎn)量大幅提高達(dá)到1g/L以上,且發(fā)酵周期縮短50%以上。
文檔編號C12R1/19GK103243066SQ20131020951
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月30日
發(fā)明者劉天罡, 朱發(fā)銀, 鄧子新 申請人:武漢大學(xué)