一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成γ-氨基丁酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸生成γ-氨基丁酸的制備方法。其所述的制備方法是（1）用活化為2~5mm的米曲霉菌球與谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液混合，發(fā)酵得到γ-氨基丁酸，（2）將含有γ-氨基丁酸的混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱，用酸性陽離子交換樹脂，除去反應(yīng)液中的陽離子，用強(qiáng)極性洗脫劑氨水將樹脂上的γ-氨基丁酸交換下來，形成含有γ-氨基丁酸的洗脫液；（3）將含有γ-氨基丁酸的洗脫液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮，在濃縮的γ-氨基丁酸洗脫液中加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀結(jié)晶，離心分離。該工藝產(chǎn)率高、純度好、周期短、能耗低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種Y-氨基丁酸的制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說，本發(fā)明涉及一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸生成Y-氨基丁酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Y-氨基丁酸,英文名:Y —aminobutyric acid (GABA),化學(xué)名稱:4_氨基丁酸，別名:Y -氨基丁酸，氨酪酸，哌唳酸。分子式:C4H9N02。分子量:103.1。廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)。植物如豆屬、參屬、中草藥等的種子、根莖和組織液中都含有GABA。在動(dòng)物體內(nèi)，GABA幾乎只存在于神經(jīng)組織中，其中腦組織中的含量大約為0.1-0.6mg/克組織，免疫學(xué)研究表明，其濃度最高的區(qū)域?yàn)榇竽X中黑質(zhì)。GABA是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性。
[0003]味精(MSG)又稱味素L-谷氨酸一鈉鹽，帶有一分子的結(jié)晶水，具有強(qiáng)烈的鮮味，是世界上用量最大的調(diào)味品。
[0004]目前，GABA的制備，一般分為化學(xué)合成，植物富集提取和生物合成三大類。其中化學(xué)合成GABA的方法很多，但成本較高，反應(yīng)條件不易控制，安全性較差。植物富集提取方法生產(chǎn)GABA是以植物為原料，經(jīng)過富集、提取、分離、提純制得，雖然比化學(xué)方法易操作，但由于植物GABA含量較低，成本仍然較高。而生物合成方法具有操作條件溫和、成本低的特點(diǎn)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中，與化學(xué)合成法和分離提取法相比具有很大的優(yōu)勢。生物合成法是以谷氨酸或其鹽[谷氨酸鈉(MSG)]或富含谷氨酸的物質(zhì)等為原料來生產(chǎn)GABA。微生物具有合成GABA的能力，是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi) 谷氨酸脫羧酶(簡稱GAD)，是一種能專一催化L-谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)镚ABA的酶。
[0005]目前發(fā)現(xiàn)，具有谷氨酸脫羧酶(GAD)活性的微生物菌種主要有，大腸桿菌、乳酸菌以及曲霉菌等。大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶活性最高，對(duì)其GAD進(jìn)行固定化生產(chǎn)GABA，具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、工藝簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，但直接用大腸桿菌用于綠色食品開發(fā)是不允許的，生產(chǎn)安全性隱患問題很大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于為解決上述技術(shù)問題，提供一種安全的、連續(xù)的、易于控制的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸轉(zhuǎn)化Y-氨基丁酸的制備方法。
[0007]為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的采用的技術(shù)方案如下:
一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其包括如下步驟:
(1)將米曲霉從保存培養(yǎng)基菌種中接種于平面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，形成直徑2~5mm的菌球；
(2)將米曲霉菌球與谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液混合，發(fā)酵得到Y(jié)-氨基丁酸混合液；
(3)混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱，用酸性陽離子交換樹脂，除去反應(yīng)液中的陽離子，用 強(qiáng)極性洗脫劑氨水將樹脂上的氨基丁酸交換下來，形成含有氨基丁酸的洗脫液；
(4)將含有、-氨基丁酸的洗脫液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮；
(5)在濃縮的氨基丁酸洗脫液中加入95%酒精，析出氨基丁酸白色沉淀結(jié)晶， 離心分離。
[0008]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的步驟（1)中，米曲霉在溫度為28?32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，之后，再接種于 200 mL培養(yǎng)基，于28°C、160 r/min搖床中培養(yǎng)2天形成菌球，其中米曲霉的比重為106? 101(1 孢子 /ml。
[0009]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的米曲霉的比重為108孢子/ml。（見說明書附圖1)
上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其所述 的步驟（2)中，米曲霉菌球與谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液結(jié)合的比例為：1 g米曲霉菌 球加入到50 mL含1%的醋酸-醋酸鹽緩沖液；發(fā)酵時(shí)間為12h?48 h，發(fā)酵溫度為30飛0 °C，發(fā)酵混合液的pH值為4. 4^4. 8 (見說明書附圖3、附圖4)，發(fā)酵混合液在恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn) 速為 110 ?150 r/min o
[0010]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的發(fā)酵時(shí)間為48h (見說明書附圖2)，發(fā)酵溫度為40°C (見說明書附圖5、附圖6)，發(fā) 酵混合液在恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為140 r/min。
[0011]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的步驟（3)中，樹脂制備中選用H型樹脂；混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的流速范圍是2 mL/min?3 mL/min,混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的過柱液為每20 mL樹脂允許150 mL過 柱液通過；洗脫液氨水濃度為2. 0 mol/L，氨水的流速為1 mL/min。
[0012]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的流速為3 mL/min。
[0013]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的步驟（4)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空度0. 085 mpa、溫度55?65 °C，濃縮至體積為原來體 積的1/10。
[0014]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的步驟（5)中，氨基丁酸濃度范圍為5(T100%，加入乙醇的體積范圍為2飛倍。
[0015]上述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成氨基丁酸的制備方法，其 所述的氨基丁酸濃度為100%，加入乙醇的體積為3倍。
[0016]有益效果：
本發(fā)明涉及的用米曲霉從谷氨酸鈉（MSG)轉(zhuǎn)化氨基丁酸（GABA)的方法，與現(xiàn)有工 藝技術(shù)相比，米曲霉固定化材料成本低，固定化酶可重復(fù)多次使用；采用偶聯(lián)分離工藝，反 應(yīng)時(shí)間可縮短1/3，反應(yīng)速率大大提高，尤其是通過偶聯(lián)技術(shù)，產(chǎn)品得率高達(dá)90. 5%，產(chǎn)品純 度達(dá)96. 3%?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0017]圖1是發(fā)酵液中米曲霉菌球照片；圖2是不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)谷氨酸脫羧酶酶活和米曲霉菌球量影響趨勢圖；圖3是發(fā)酵混合液的PH值對(duì)谷氨酸脫羧酶酶活的影響趨勢圖；圖4是米曲霉菌球在發(fā)酵混合液的PH值穩(wěn)定性趨勢圖；圖5是發(fā)酵溫度對(duì)谷氨酸脫羧酶酶活的影響趨勢圖；圖6是米曲霉菌球在發(fā)酵混合液中發(fā)酵溫度的穩(wěn)定性趨勢圖；圖7是反應(yīng)與分離裝置的分離指示圖；圖8是蒸餾燒瓶和培養(yǎng)皿中的GABA結(jié)晶；圖9是純化后的GABA晶體。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0019]實(shí)施例:
取5g米曲霉，米曲霉的比重為IO6~101°孢子/ml，在溫度為28~32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，之后，再接種于200 mL培養(yǎng)基，于28°C、160 r/min搖床中培養(yǎng)2天形成3mm的米曲霉菌球。
[0020]稱IOg谷氨酸鈉(MSG)加入1000ml用醋酸和醋酸鈉配置成0.2 mol/L醋酸-醋酸鹽緩沖液，將緩存液的PH調(diào)為pH=4.6 ；
向醋酸-醋酸鹽緩沖液中加入20g米曲霉菌球，將加入米曲霉菌球的混合液放入溫度設(shè)置為40°C的恒溫?fù)u床，同時(shí)設(shè)置搖床的轉(zhuǎn)速以140 r/min,搖床搖動(dòng)發(fā)酵時(shí)間控制在48h，發(fā)酵結(jié)束后混合液中生成Y-氨基丁酸(GABA);
混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱，用H型樹脂作交換樹脂，(H型樹脂:取50 mL樹脂置于交換柱中，用去離子水進(jìn)行反洗，到樹脂中無可見機(jī)械雜質(zhì)并出水澄清時(shí)，用50 mLl mol/LHCl, 100 mL去離子水,50 mL I mol/L NaOH和100 mL去離子水，自上而下通過樹脂層，進(jìn)行酸堿處理，后用400 mLl mol/L HCl溶液通過樹脂層，最后用去離子水洗滌，當(dāng)甲基橙指示液檢驗(yàn)流出液呈黃色時(shí)停止洗滌，H型樹脂制備完成。)除去反應(yīng)液中的陽離子，用強(qiáng)極性洗脫劑氨水將樹脂上的Y-氨基丁酸(GABA)交換下來，形成含有Y-氨基丁酸(GABA)的洗脫液；
將洗脫液至于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮，將真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中的真空度調(diào)到0.085 mpa、溫度調(diào)到55~65 °C，真空濃縮至體積為原來體積的1/10左右(100ml)時(shí)停止;
向含有高濃度GABA的洗脫液中加入300ml95%酒精，析出氨基丁酸白色沉淀結(jié)晶，拌冷卻至室溫，抽濾，95%酒精洗滌，60°C真空干燥6小時(shí)。得9.61gY-氨基丁酸(GABA)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將米曲霉從保存培養(yǎng)基菌種中接種于平面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，形成直徑2~5mm的菌球； (2)將米曲霉菌球與谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液混合，發(fā)酵得到Y(jié)-氨基丁酸； (3)混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱，用酸性陽離子交換樹脂，除去反應(yīng)液中的陽離子，用強(qiáng)極性洗脫劑氨水將樹脂上的Y-氨基丁酸交換下來，形成含有Y-氨基丁酸的洗脫液； (4)將含有Y-氨基丁酸的洗脫液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮； (5)在濃縮的Y-氨基丁酸洗脫液中加入95%酒精，析出Y-氨基丁酸白色沉淀結(jié)晶，離心分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于: 所述的步驟(1)中，米曲霉溫度為28~32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，之后，再接種于200 mL培養(yǎng)基，于28°C、160 r/min搖床中培養(yǎng)2天形成菌球，其中米曲霉的比重為IO6~IOltl 孢子 /ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的米曲霉的比重最佳為IO8孢子/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的步驟(2)中，米曲霉菌球與谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液結(jié)合比例為:1 g米曲霉菌球加入到50 mL含1%谷氨酸鈉的醋酸-醋酸鹽緩沖液；發(fā)酵時(shí)間為12h~48 h，發(fā)酵溫度為3( T50 °C，發(fā)酵混合液的pH值為4.4~4.8，發(fā)酵混合液在恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為110~150 r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的發(fā)酵時(shí)間最佳為48h，發(fā)酵溫度為最佳40°C，發(fā)酵混合液在恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速最佳為140 r/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的步驟(3)中，樹脂制備中選用H型樹脂；混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的流速范圍是2 mL/min~3 mL/min,混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的過柱液為每20mL樹脂允許150 mL過柱液通過；洗脫液氨水濃度為2.0 mol/L，氨水的流速為I mL/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的混合發(fā)酵液經(jīng)過離子交換柱的流速最佳為3 mL/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的步驟(4)中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空度0.085 mpa、溫度55~65°C，濃縮至體積為原來體積的1/10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的步驟(5)中，Y-氨基丁酸濃度范圍為50-100%，加入乙醇的體積范圍為2飛倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的利用米曲霉偶聯(lián)分離工藝轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成Y-氨基丁酸的制備方法，其特征在于:所述的Y-氨基丁酸最佳濃度為100%，加入乙醇的體積最佳為3倍。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK103509831SQ201310233195
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】武建剛, 裴海生, 劉建成 申請(qǐng)人:烏魯木齊思科康達(dá)科技有限責(zé)任公司