木糖葡萄球菌a2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途
【專利摘要】木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途，屬于食品科學(xué)/肉品科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及木糖葡萄球菌A2的用途。微生物發(fā)酵法替代肉制品中的亞硝酸鹽是一個全新的研究領(lǐng)域，本發(fā)明提供一株可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的木糖葡萄球菌A2，它可以在MSA培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白，即腌肉紅色素，從而為發(fā)酵法替代肉制品中亞硝酸鹽提供一條可能的解決途徑。本發(fā)明的木糖葡萄球菌A2具備轉(zhuǎn)化生成亞硝基肌紅蛋白，即腌肉紅色素的能力。從而，利用木糖葡萄球菌A2發(fā)酵，可以替代肉制品中亞硝酸鹽的呈色作用，減少其使用量，降低產(chǎn)品可能的致癌性。
【專利說明】木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品科學(xué)/肉品科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及木糖葡萄球菌A2的用途，尤其涉及木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]顏色是衡量肉和肉制品質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。肉的顏色主要取決于其中肌紅蛋白的含量以及其所處的狀態(tài)?；鶓B(tài)肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)(卟啉環(huán)中為Fe2+)并不結(jié)合任何亞基，而會與水分子結(jié)合。在氧氣存在的條件下，肌紅蛋白可以與I分子的氧分子結(jié)合，形成氧合肌紅蛋白(Oxymyoglobin, MbO2),從而變成亮紅色。此時,鐵仍以二價鐵離子(Fe2+)存在。但氧氣和其他氧化劑，會將二。價鐵氧化為三價鐵，最終形成高鐵肌紅蛋白(Metmyoglobin, Met-Mb),為棕色。基態(tài)肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白在肉中一般同時存在。長時間放置的肉中高鐵肌紅蛋白含量較高，呈現(xiàn)為棕黃色。
[0003]肉類腌制中添加亞硝酸鹽可有助于其形成穩(wěn)定的紅色澤。亞硝酸鹽之所以能在腌肉中起呈色作用，是因為它們能在酸性條件下形成亞硝酸。亞硝酸不穩(wěn)定，在還原性物質(zhì)存在時，發(fā)生歧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化生成一氧化氮(NO)。一氧化氮和肌紅蛋白反應(yīng)，最終生成亞硝基肌紅蛋白(Nitrosylmyoglobin, NO-Mb)。
[0004]亞硝酸鈉是目前肉品腌制的關(guān)鍵組分，其在肉制品中的作用主要有:抑制腐敗微生物生長，延緩食品腐敗，抗氧化，產(chǎn)生腌肉的特征風(fēng)味，以及與肉中色素成分——肌紅蛋白作用，產(chǎn)生亞硝基肌紅蛋白，形成穩(wěn)定的腌肉紅色澤。其中，亞硝酸鹽的呈色作用是其在肉制品中使用的重要原因。但由于其自身毒性和潛在致癌性，其應(yīng)用受到限制。因此，人們迫切需要一種新的方法來替代肉制品中的亞硝酸鹽的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]微生物發(fā)酵法替代肉制品中的亞硝酸鹽是一個全新的研究領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是提供一株可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的木糖葡萄球菌A2，它可以在MSA培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白，即腌肉紅色素，從而為發(fā)酵法替代肉制品中亞硝酸鹽提供一條可能的解決途徑。
[0006]本發(fā)明通過大量微生物篩選，首次發(fā)現(xiàn)了一株木糖葡萄球菌A2，它具有轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的能力，具備替代肉中亞硝酸鹽呈色作用的潛力。
[0007]所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)為從發(fā)酵風(fēng)干腸中提取并分離鑒定的菌種，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCCN0.5049,保藏日期為2011年7月8日，菌種的分類命名為木糖葡糖球菌(Staphylococcusxylosus)。
[0008]本發(fā)明中的木糖葡萄球菌A2具有以下生物學(xué)特性:[0009]形態(tài)特征:木糖葡萄球菌A2革蘭氏染色結(jié)果為陽性，呈不規(guī)則葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，無鞭毛。
[0010]菌落特征:此菌營養(yǎng)要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好。在MSA瓊脂平板上，經(jīng)32°C、48h培養(yǎng)，形成直徑約I?2mm，圓形，凸起，白色菌落。在液體培養(yǎng)基中均勻混濁生長。
[0011]本發(fā)明的木糖葡萄球菌A2具備轉(zhuǎn)化生成亞硝基肌紅蛋白，即腌肉紅色素的能力。從而，利用木糖葡萄球菌A2發(fā)酵，可以替代肉制品中亞硝酸鹽的呈色作用，減少其使用量，降低產(chǎn)品可能的致癌性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為接種木糖葡萄球菌A2對高鐵肌紅蛋白-MSA體系顏色變化的影響；
[0013]圖2為接種木糖葡萄球菌A2對高鐵肌紅蛋白-MSA體系350?450nm處光譜圖的影響；
[0014]圖3為接種木糖葡萄球菌A2對高鐵肌紅蛋白-MSA體系450?700nm處光譜圖的影響；
[0015]圖4為兩組高鐵肌紅蛋白-MSA體系的電子自旋共振光譜圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0017]一、試驗設(shè)計.
[0018]將肌紅蛋白溶解在pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液中，配置成20mg/mL的溶液。加熱30min以除去殘留可能降解高鐵肌紅的酶類，4°C條件下，10，OOOg離心lmin，除去變性的蛋白質(zhì)。4°C放置7d后得到高鐵肌紅蛋白溶液。將高鐵肌紅蛋白溶液使用0.45tm濾膜過濾滅菌后，加入到MSA(Man Rogosa and Sharp)液體培養(yǎng)基中，使最終高鐵肌紅蛋白濃度為2mg/mL。將木糖葡萄球菌A2接種到該培養(yǎng)基中，使其終濃度為106CFU/mL。32°C厭氧培養(yǎng)18h后，通過離心除去菌細(xì)胞。通過色差計對其顏色變化進(jìn)行測定，并測定培養(yǎng)基體系紫外/可見(UV-Vis)吸收光譜和電子自選共振光譜(ESR)，鑒定其中肌紅蛋白存在狀態(tài)。
[0019]二、MSA (Manntilo Salt Agar)培養(yǎng)基配方
[0020]牛肉膏l(xiāng).0g，示蛋白胨10.0g, D-甘露醇l0.0g，氯化鈉75.0g，蒸餾水IOOOmL,ρΗ7.2 ?7.6。
[0021]三、色差測定
[0022]液體模擬體系顏色測定選用色差計透射模式(transmittance mode),儀器經(jīng)自檢及零點、標(biāo)準(zhǔn)(L* = 95.26, a* = -0.89,b* = 1.18)校正后,試樣裝滿2mm比色杯后置于液體載樣臺上進(jìn)行測定。
[0023]四、紫外-可見(UV-Vis)光譜掃描
[0024]不同肌紅蛋白衍生物的UV-Vis吸收光譜不同。通過光譜掃描可對肌紅蛋白的轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行鑒定和轉(zhuǎn)化過程跟蹤。利用紫外-可見分光光度計對所制得的樣品進(jìn)行光譜掃描，以培養(yǎng)基調(diào)整系統(tǒng)基線，掃描范圍為350?700nm，掃描間隔為lnm。
[0025]五、電子自旋共振(ESR)測定[0026]電子自旋共振技術(shù)(ESR)可用以孤對電子分析，而NO分子中含有孤對電子，因此，利用ESR技術(shù)，可以區(qū)分氧合肌紅蛋白(MbO2)和亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)兩種紅色肌紅蛋白衍生物。ESR測定方法如下:取大約0.3mL樣品，直接吸入到ESR毛細(xì)管中，浸入液氮中迅速冷卻。使用裝配有低溫樣品池的Bruker ECS106電子自旋共振儀進(jìn)行測定，測定參數(shù)如下:調(diào)制頻率IOOkHz ;調(diào)制幅度1.0mT ;微波功率2.0mff ;微波頻率9.44GHz ;溫度150K ;響應(yīng)時間30s。需要注意的是，進(jìn)行ESR測定時，MSA培養(yǎng)基中不可添加順磁性物質(zhì)硫酸錳。
[0027]六、結(jié)果與分析
[0028]將木糖葡萄球菌A2接種到MSA液體培養(yǎng)基中，同時做空白對照，厭氧條件下32°C培養(yǎng)18h，測定其色差值和光譜變化情況。
[0029]通過視覺，可以很清晰的觀察到，經(jīng)過18h培養(yǎng)，接種木糖葡萄球菌A2的高鐵肌紅蛋白-MSA體系呈現(xiàn)亮紅色，而對照組則呈現(xiàn)棕色澤。采用透射色差對模擬體系顏色進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖1所示，木糖葡萄球菌A2組的a*_值(紅度值)顯著高于對照組(P<0.05)，這表明該組樣品要“更紅” 一些；而其L*-值(亮度值)較另兩組較低，但差異并不顯著(P > 0.05)。各組的b*_值(黃度值)之間亦沒有顯著區(qū)別。
[0030]同時，對各處理組進(jìn)行UV-Vis光譜掃描，結(jié)果如圖2-3所示。由圖可知，空白對照組在410、505和635nm處有特征吸收峰,這是高鐵肌紅蛋白的特征；而接種木糖葡萄球菌A2組的吸收光譜曲線發(fā)生變化，在420、540和580nm處出現(xiàn)了特征吸收峰，這正是紅色肌紅蛋白衍生物的典型圖譜。紅色肌紅蛋白衍生物分為氧合肌紅蛋白(MbO2)和亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)兩種。由于二者的吸收曲線和特征峰值很接近，所以很難僅僅通過這一種指標(biāo)對其進(jìn)行區(qū)分。
[0031]由圖4可知，接種木糖葡萄球菌A2體系存在順磁性物質(zhì)的信號，而對照組體系ESR信號顯示為不存在順磁性物質(zhì)，這表明該體系中存在一氧化氮分子。研究發(fā)現(xiàn)該體系g值為1.9870，進(jìn)一步表明，檢測得到了亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)，而其恰恰是腌肉色素的主要成分。這表明該株木糖葡萄 球菌可以將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為亞硝基肌紅蛋白，這為微生物發(fā)酵法替代亞硝酸鹽提供了一條可能途徑。
【權(quán)利要求】
1.木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途，其特征在于所述木糖葡萄球菌A2在MSA培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木糖葡萄球菌A2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途，其特征在于所述MSA培養(yǎng)基配方為:牛肉膏1.0g，示蛋白胨10.0g, D-甘露醇10.0g,氯化鈉 75.0g,蒸餾水 lOOOmL，pH7.2 ?7.6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的木糖葡萄球菌Α2可轉(zhuǎn)化高鐵肌紅蛋白生成亞硝基肌紅蛋白的新用途， 其特征在于所述木糖葡萄球菌Α2，其保藏編號為=CGMCC N0.5049。
【文檔編號】C12R1/44GK103436576SQ201310282139
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月5日
【發(fā)明者】孔保華, 李沛軍, 羅慧婷, 劉騫 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)