一種毒三素鏈霉菌及其在制備利普司他汀中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種毒三素鏈霉菌(Streptomyces?toxytricini?ST-5423)及其應(yīng)用，該菌株由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為：CCTCC?M2013312，保藏日期為：2013年07月04日。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用此菌株發(fā)酵制備奧利司他中間體的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過(guò)10噸和30噸發(fā)酵罐的生產(chǎn)實(shí)踐，證明其生產(chǎn)能力穩(wěn)定，發(fā)酵單位高且發(fā)酵副產(chǎn)物相對(duì)較少，大大地降低了后提取的難度，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)且獲得的奧利司他產(chǎn)品質(zhì)量高。
【專利說(shuō)明】—種毒三素鏈霉菌及其在制備利普司他汀中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途和應(yīng)用，尤其涉及一種毒三素鏈霉菌及其在制備利普司他汀中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]利普司他汀為發(fā)酵產(chǎn)物,通過(guò)毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)發(fā)酵液培養(yǎng)，得到發(fā)酵濾液，再通過(guò)提取、濃縮得到利普司他汀濃縮液，經(jīng)一系列純化工藝如氫化、結(jié)晶、離心等可最終獲得奧利司他成品。而奧利司他是一種長(zhǎng)效和強(qiáng)效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過(guò)與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價(jià)鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而達(dá)到減少熱量攝入，控制體重的目的。服用奧利司他可以降低與肥胖相關(guān)的危險(xiǎn)因素和與肥胖相關(guān)的其它疾病的發(fā)病率，包括高膽固醇血癥、2型糖尿病等。
[0003]一般的利普司他汀產(chǎn)生菌，生產(chǎn)能力不穩(wěn)定，產(chǎn)量較低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，雜質(zhì)較多，導(dǎo)致后期提取、氫化、純化成奧利司他的工藝較為復(fù)雜，大大地增加了后序的提純難度，難以獲得高純度的最終產(chǎn)物，從而無(wú)法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種發(fā)酵單位高、能穩(wěn)定生產(chǎn)、產(chǎn)量高且副產(chǎn)物少的利普司他汀產(chǎn)生菌。
[0005]一種毒三素鏈霉菌ST-5423，分類命名為毒三素鏈霉菌ST-5423 (Streptomycestoxytricini ST-5423)，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為:CCTCC M2013312，保藏日期為:2013年07月04日。
[0006]毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株的菌落特征:基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無(wú)色，菌絲細(xì)長(zhǎng)分枝，直徑為0.8~0.9 μ m ;氣生菌絲生長(zhǎng)豐茂、粉狀，孢子絲著生在氣生菌絲體上，孢子絲直、柔曲,孢子呈橢圓形至柱形,表面光滑,直徑為0.65~1.0X 1.0~2.0 μ m,成熟孢子鏈孢子個(gè)數(shù)在10個(gè)以上。酵母浸出物淀粉瓊脂:氣絲白色至肉桂粉色。
[0007]根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國(guó)外相關(guān)資料的描述，結(jié)合毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，該毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株應(yīng)屬于毒三素鏈霉菌屬，定名為 Streptomyces toxytricini ST-5423。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該菌株在制備利普司他汀中的應(yīng)用。
[0009]毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株可應(yīng)用于發(fā)酵制備利普司他汀。 該制備方法包括下列步驟:
[0010]a.發(fā)酵菌株米用毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株；
[0011]b.菌株培養(yǎng):按常規(guī)方法制備的斜面，挖取斜面菌苔塊，接入搖瓶進(jìn)行種子培養(yǎng)得搖瓶種子液；將搖瓶種子液接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中或種子罐中培養(yǎng)；將種子罐培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集發(fā)酵液；優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需進(jìn)行補(bǔ)料，待種子罐菌絲生長(zhǎng)良好接入發(fā)酵罐后，根據(jù)發(fā)酵液實(shí)際情況從pH、菌濃、攪拌轉(zhuǎn)速、溶氧及菌絲鏡檢情況等方面來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程即可。
[0012]c.發(fā)酵產(chǎn)物提取:提取、濃縮、氫化、結(jié)晶、制備柱、結(jié)晶和干燥。
[0013]其中所述的步驟b為:按常規(guī)方法制備的斜面，挖取斜面菌苔塊接入搖瓶種子培養(yǎng)基，150~250rpm，培養(yǎng)24~48小時(shí)，得搖瓶種子液；將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1~2%的接種量接種于種子罐。攪拌速度80~120rpm，培養(yǎng)24~48h ;將種子罐培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5~15%的量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，攪拌速度120~200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)130~240小時(shí)，收集發(fā)酵液；其中培養(yǎng)溫度均為26~28°C。
[0014]本發(fā)明還公開(kāi)了培養(yǎng)基:按重量體積比計(jì)，搖瓶、種子罐培養(yǎng)過(guò)程中的碳源為
0.2~5.0%，優(yōu)選0.5~4.5%，最優(yōu)選為0.5~3.0% ;氮源為0.2~4.0%，優(yōu)選0.5~
3.5%，最優(yōu)選為0.5~3.0% ;無(wú)機(jī)鹽為0.02~2.0%，優(yōu)選0.02~1.5%，最優(yōu)選0.02~
1.3% ;其余為水；
[0015]其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片的一種或幾種；優(yōu)選麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；最優(yōu)選麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾種。
[0016]其中氮源選自黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物一種或幾種；優(yōu)選黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母浸出物、酵母抽提物中的一種或幾種；更優(yōu)選生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黃豆餅粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一種或幾種。
[0017]其中無(wú)機(jī)鹽選自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4 中的一種或幾種；優(yōu)選 K2HPO4, ZnSO4^MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一種或幾種；最優(yōu)選 ZnSO4,MgSO4, FeSO4, KH2PO4中的一種或幾種。
[0018]其中，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，按重量體積比計(jì)，碳源為1.5~15%，優(yōu)選2.5~13%，最優(yōu)選5~11%;氮源為0.5~7.0%，優(yōu)選0.7~5%，最優(yōu)選I~3%;無(wú)機(jī)鹽為0.02~2.0%，優(yōu)選0.02~1.6%，最優(yōu)選0.04~1.0% ;其余為水；
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)基物料選擇如下:
[0020]碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優(yōu)選麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種，最優(yōu)選淀粉、可溶性淀粉、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖中的一種或幾種。
[0021]氮源選自黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一種或幾種；優(yōu)選黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中一種或幾種；更優(yōu)選為生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黃豆餅粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中一種或幾種。
[0022]無(wú)機(jī)鹽選自K2HPO4、NaCl、NaNO3、ZnSO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4 中的一種或幾種；優(yōu)選K2HPO4,ZnSO4,MgSO4,FeSO4,KH2PO4 中的一種或幾種；最優(yōu)選 ZnSO4,MgSO4,FeSO4,KH2PO4 中的一種或幾種。
[0023]經(jīng)發(fā)酵完成放罐后，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取，通過(guò)氫化、結(jié)晶，再進(jìn)行制備柱純化后可以獲得純度達(dá)98%以上的奧利司他。
[0024]本發(fā)明所公開(kāi)的毒三素鏈霉菌ST-5423是目前用于生產(chǎn)的一種高單位的利普司他汀產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，可用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵過(guò)程是利普司他汀(奧利司他)生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)。本發(fā)明提供的發(fā)酵工藝經(jīng)過(guò)搖瓶、小試、中試及10噸、30噸生產(chǎn)發(fā)酵罐進(jìn)行試驗(yàn)及生產(chǎn)，其生產(chǎn)能力穩(wěn)定。經(jīng)檢測(cè)，用本發(fā)明提供的菌株及發(fā)酵培養(yǎng)方法制備的利普司他汀單位可高達(dá)900(^g/ml或以上，從而為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)本發(fā)明的發(fā)酵副產(chǎn)物相對(duì)較少，并降低了后提取的難度，提取和純化的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，大大提高了收率和純度，在工業(yè)化生產(chǎn)上更具優(yōu)勢(shì)。
[0025]菌株保藏情況:保藏于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC M2013312，分類命名為毒三素鏈霉菌 ST-5423 (Streptomyces toxytriciniST-5423)，保藏H期為2013年07月04日。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0027]實(shí)施例1:毒三素鏈霉菌ST-5423的培養(yǎng)特征
[0028]將毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株接種于甘油天冬酰氨瓊脂、酵母膏麥芽浸出液瓊脂等用于觀察形態(tài)特征的培養(yǎng)基。28°C培養(yǎng)一定的時(shí)間5、8、10天，觀察并進(jìn)行描述，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0029]表1、毒三素鏈霉菌ST-5423的菌株在各種培養(yǎng)基上的菌落特征
[0030]
培養(yǎng)基I生長(zhǎng)情況I氣生菌絲I可溶性色素
酵母膏麥芽浸出液瓊脂~S白至肉桂粉色 ImE
無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂S白至肉桂粉色 ?Ε
燕麥粉瓊脂S白至肉桂粉色 ?Ε
甘油天門冬素瓊脂白至肉桂粉色 ImE
蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基 tl?Κ
酪氨酸瓊脂中度白色無(wú)色
高氏一號(hào)瓊脂S白至粉紅色?Ε
葡萄糖天門冬素瓊脂 tS白至粉紅色淺黃色
蔗糖察式瓊脂￥1?Κ
【權(quán)利要求】
1.一種菌株，分類命名為毒三素鏈霉菌ST-5423 (Streptomyces toxytriciniST-5423)，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M2013312，保藏日期為:2013年07月04日。
2.如權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCCM2013312的毒三素鏈霉菌株在發(fā)酵制備利普司他汀中的應(yīng)用。
3.應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCCM2013312的菌株發(fā)酵制備利普司他汀的方法，其特征在于包括下列步驟: a.發(fā)酵菌株采用保藏號(hào)為CCTCCM2013312的毒三素鏈霉菌株； b、菌株培養(yǎng): 按常規(guī)方法制備斜面，挖取斜面菌苔塊，接入搖瓶種子培養(yǎng)基，150~250rpm，培養(yǎng)24~48小時(shí)，得搖瓶種子液； 將搖瓶種子液按種子罐培養(yǎng)基體積0.1~2%的接種量接種于種子罐，攪拌轉(zhuǎn)速80~120rpm，培養(yǎng) 24 ~48h ； 將種子罐培養(yǎng)液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積5~15%的量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速120~200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)130~240小時(shí)，收集發(fā)酵液； 其中培養(yǎng)溫度均為26~28°C。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是按重量體積比計(jì)， 搖瓶種子、種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:碳源為0.2~5.0%，氮源為 0.2~4.0%，無(wú)機(jī)鹽為0.02~2.0%，其余為水； 其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糖蜜、糊精、甘油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；氮源選自黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽選自 K2HP04、NaCl、NaNO3> ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一種或幾種； 發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:碳源為1.5~15%，氮源為0.5~7.0%，無(wú)機(jī)鹽為0.02~2.0%，其余為水； 其中碳源選自麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、淀粉水解糖、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、大豆卵磷脂、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；所述的氮源選自黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米漿、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、肉胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽選自K2HP04、NaCl, FeS04、ZnSO4, NaN03、MgSO4, CaCO3中的一種或幾種。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是按重量體積比計(jì)，搖瓶種子、種子罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:碳源為0.5~4.5%，優(yōu)選為0.5~3.0% ;氮源為0.5~3.5%，優(yōu)選為0.5~3.0% ;無(wú)機(jī)鹽為0.02~1.5%，優(yōu)選為0.02~1.3% ;其余為水。
6.如權(quán)利要求4-5任一權(quán)利要求所述的方法，其特征是所述搖瓶種子、種子罐培養(yǎng)基中碳源為麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、土豆糊精、燕麥片中的一種或幾種；優(yōu)選為麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、土豆糊精中的一種或幾種； 氮源為黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母浸出物、酵母抽提物中一種或幾種；優(yōu)選為黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一種或幾種；無(wú)機(jī)鹽為 K2HP04、ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一種或幾種；優(yōu)選為 ZnS04、MgSO4,FeSO4, KH2PO4中的一種或幾種。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是按重量體積比計(jì)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的比例為:碳源為2.5~13%，優(yōu)選為5~11% ;氮源為0.7~5%，優(yōu)選為I~3% ;無(wú)機(jī)鹽為0.02~1.6%，優(yōu)選為0.04~1.0% ;其余為水。
8.如權(quán)利要求4、7任一權(quán)利要求所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的碳源為麥芽糊精、淀粉、可溶性淀粉、糊精、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、葡萄糖、土豆浸出粉、土豆糊精、燕麥片、大豆卵磷脂中的一種或幾種；優(yōu)選為淀粉、可溶性淀粉、甘油、菜油、大豆油、葵花籽油、葡萄糖、大豆卵磷脂中的一種或幾種。
9.如權(quán)利要求4、7任一權(quán)利要求所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的氮源為黃豆餅粉、生豆粉、豆柏粉、玉米蛋白、蛋白胨、植物性蛋白胨、酵母粉、酵母浸出物、酵母抽提物中的一種或幾種；優(yōu)選為生豆粉、豆柏粉、酵母抽提物、黃豆餅粉、植物性蛋白胨、酵母浸出物中的一種或幾種。
10.如權(quán)利要求4、7任一權(quán)利要求所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽為 K2HP04、ZnSO4, MgSO4, FeSO4, KH2PO4 中的一種或幾種，優(yōu)選為 ZnS04、MgSO4, FeSO4,KH2PO4中的一種或幾 種 。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK103468603SQ201310302148
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】李立似, 方軍, 蔣彩霞, 金利琴, 何金芳, 劉金國(guó) 申請(qǐng)人:杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)生物工程研究所有限公司, 杭州中美華東制藥有限公司