一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過檢測(cè)人CR2基因5’UTR區(qū)rs3813946和第10外顯子上rs17615和rs104897三個(gè)SNP位點(diǎn)突變SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒可以應(yīng)用在對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的早期診斷中，從分子水平上通過對(duì)患者基因型組合的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SLE的提早判別。本發(fā)明所提供的方法為測(cè)序基因分型法，準(zhǔn)確率高達(dá)99.9%，易于廣泛使用和推廣。
【專利說明】一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，累及全身多系統(tǒng)、多器官、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病。本病多發(fā)于生育年齡女性，我國(guó)約有一百萬(wàn)患者，并有逐年增加趨勢(shì)，平均患病率更是高居全球第二位。
[0003]然而，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床誤診率相當(dāng)高，這主要因?yàn)橄到y(tǒng)性紅斑狼瘡是由于遺傳、感染、性激素及環(huán)境等多因素相互作用引起機(jī)體免疫紊亂所致，病因則迄今未明。雖然美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ARA)在1997年頒布了 11項(xiàng)分類標(biāo)準(zhǔn)，這也是目前臨床診斷最常用的手段；免疫膠體金檢測(cè)抗雙鏈DNA法在一定程度上也能有效的幫助確診SLE。但這類診斷方法多適用于典型或活動(dòng)期的系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷，對(duì)早期、不典型或非活動(dòng)期的患者則不適用，因?yàn)樵缙诨颊吲R床表現(xiàn)通常不典型，癥狀也無(wú)特異性，尤其是單系統(tǒng)受累患者更加難以診斷。這也是造成誤診和漏診的一個(gè)主要原因。
[0004]誤診除了會(huì)給患者造成健康和經(jīng)濟(jì)上的雙重負(fù)擔(dān)，最主要的是會(huì)延誤病情，增加死亡的危險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在SLE患者中，首發(fā)癥狀以關(guān)節(jié)疼痛維多，約占40%，而近1/4的誤診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，臨床上平均35%的患者會(huì)并發(fā)腫瘤。然而，早期就接受正規(guī)系統(tǒng)治療的患者10年以上的存活率卻可達(dá)75%。由此可見，早期診斷，早期治療對(duì)SLE患者的康復(fù)尤為重要。
[0005]建立一種簡(jiǎn)單快捷準(zhǔn)確的早期檢測(cè)方法，有助于幫組醫(yī)生及時(shí)篩查出系統(tǒng)性紅斑狼瘡，避免因?yàn)檎`診導(dǎo)致病人的病情惡化。
[0006]SNP (single nucleotide polymorphism),單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，也被稱為第三代遺傳標(biāo)記。在位于基因5’端非翻譯區(qū)和基因編碼區(qū)(外顯子)內(nèi)的SNP，往往會(huì)引起蛋白質(zhì)含量變化及功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致生物體性狀變異，在遺傳研究和疾病分子機(jī)制研究中具有重要意義，也越來越多的被作為各種疾病的分子診斷標(biāo)記。
[0007]近年來，研究人員通過比較SLE患者和健康人群的基因組，發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了 CR2基因功能異常與SLE的發(fā)生機(jī)制顯著相關(guān)。含有特異CR2突變位點(diǎn)的人群發(fā)生SLE的幾率更是顯著升高160%。
[0008]CR2基因是Complement receptor 2的簡(jiǎn)寫，中文名稱前列腺干細(xì)胞抗原。該基因位于人第I號(hào)常染色體第32帶區(qū)。由19個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)B細(xì)胞表面的糖蛋白，是人體自身免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子。大量的研究證明，SLE病者體內(nèi)都伴隨著CR2蛋白水平的顯著下降。2007年，Wuet.al.首次在來自258個(gè)高加索家庭和142個(gè)中國(guó)家庭的1416名SLE患者中發(fā)現(xiàn)了位于CR2基因5’ UTR上的rs3813946突變可改變CR2基因的轉(zhuǎn)錄水平，而位于第10外顯子上的rsl7615和rsl048971則通過改變蛋白序列影響CR2的特異結(jié)合功能。這個(gè)發(fā)現(xiàn)分別在2009和2012年在2084例歐洲和美洲的SLE患者中得到驗(yàn)證。CR2基因上的rsl7615, rsl048971和rs3813946三個(gè)SNP位點(diǎn)可以作為SLE的早期檢測(cè)指標(biāo)。
[0009]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]CR2基因上的rsl7615, rsl048971和rs3813946三個(gè)SNP位點(diǎn)的組合可以用來作為SLE早期診斷的輔助手段，降低誤診率。
[0011]本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)CR2基因上的rsl7615，rsl048971和rs3813946三個(gè)SNP突變位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，包括:
(1)檢測(cè)CR2基因上rsl7615和rsl048971突變位點(diǎn)的特異性引物；
(2)檢測(cè)CR2基因上rs3813946突變位點(diǎn)的特異性引物；
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑(包括Taq酶，dNTP混合液，反應(yīng)緩沖液，無(wú)菌去離子水)；
(4)DNA測(cè)序反應(yīng)試劑(包括BigDye mix, EDTA溶液，100%乙醇，70%乙醇，HIDI溶液，無(wú)菌去離子水)；
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
(1)PCR反應(yīng)體系:10mM 的 dNTP 混合液 2μ I ；5U/y I 的 Taq DNA 聚合酶 1μ I ；TaqBuffer 10 μ I,特異引物各I μ I ；25mM的MgCl2 10 μ I ;無(wú)菌去離子水73 μ I ;
(2)測(cè)序反應(yīng)體系:25%的BigDyemix I μ I ；DNA測(cè)序引物I μ I ；125mM的EDTA溶液I μ I ；100%乙醇溶液15 μ I ；70%乙醇溶液30 μ I ；HIDI溶液10 μ I;無(wú)菌去離子水10 μ I ;
(3)本試劑盒可用于一個(gè)樣本的檢測(cè)，試劑盒的保存溫度為-20°C。
[0012](4)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定樣品中是否存rsl7615，rsl048971和rs3813946三個(gè)SNP位點(diǎn)的突變，根據(jù)組合結(jié)果給出臨床指導(dǎo)意見。
[0013]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1: rsl048971位點(diǎn)測(cè)序圖譜，測(cè)序結(jié)果為:CCTGCTCCCCT【G/A】TGTAAACTT,圖中106號(hào)位為基因型的判斷區(qū)。
[0015]圖2: rsl7615位點(diǎn)測(cè)序圖譜，測(cè)序結(jié)果為:AAGGGCA【G/A】TAGTCAGA,圖中246號(hào)位為基因型的判斷區(qū)。
[0016]圖3: rs3813946位點(diǎn)測(cè)序圖譜，測(cè)序結(jié)果為:TGGGAGGGCA【G/A】GGCTGGAGCA,圖中79號(hào)位為基因型的判斷區(qū)。
[0017]

【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】?jī)H對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說明，并不對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用范圍進(jìn)行限制。實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019]實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用 1.提取樣品DNA
清潔口腔，使用消毒刮片刮取受檢測(cè)者口腔粘膜，以采集上皮細(xì)胞，用酚氯法提取基因組 DNA。
[0020]2.PCR擴(kuò)展反應(yīng)
使用試劑盒中的PCR反應(yīng)試劑，其中含有下列引物對(duì):
(1)CR2 (rsl7615)正向引物:SEQ NOl CR2 (rsl7615)反向引物:SEQ N02
(2)CR2 (rs3813946)正向引物:SEQ N03 CR2 (rs3813946)反向引物:SEQ N04
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR反應(yīng)緩沖液10 μ I ；10mM的dNTP混合液2 μ I ；5U/ μ I的Taq DNA聚合酶I μ I ;特異引物各I μ I ;無(wú)菌去離子水73 μ I
PCR反應(yīng)程序:95攝氏度3分鐘預(yù)變性，94攝氏度30秒變性，降溫至55攝氏度35秒退火，再升溫至72攝氏度40秒進(jìn)行延伸，保持72攝氏度5分鐘進(jìn)行延伸修復(fù)；以上循環(huán)35次。4攝氏度保溫。
[0021]3.PCR產(chǎn)物純化
使用生工SK1141PCR純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。
[0022]4.DNA測(cè)序反應(yīng)
使用試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)試劑，包含下列測(cè)序引物:
(1)CR2 (rsl7615)測(cè)序引物:SEQ N05
(2)CR2 (rs3813946)測(cè)序引物:SEQ N06
反應(yīng)總體積20 μ I,包含PCR純化產(chǎn)物I μ I (純度0D260/0D280在1.6至2.0之間)，25%的BigDye mix 8 μ I; 3.2uM DNA測(cè)序引物I μ I;無(wú)菌去離子水10 μ I。
[0023]在ΑΒΙ2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為96攝氏度I分鐘后進(jìn)行25次下列條件循環(huán):
96攝氏度10秒，降溫至55攝氏度5秒，升溫至60度4分鐘。
[0024]反應(yīng)結(jié)束后加入125mMde EDTA溶液2 μ I ；2μ I的3Μ NaAc, 100%乙醇溶液50 μ I ；震蕩4次,在室溫下沉淀15分鐘。然后在4攝氏度下使用臺(tái)式離心機(jī)12000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，馬上用槍吸盡上清液。再加入70 μ L 70%酒精，4攝氏度12000rpm/min離心15 min，馬上用槍吸盡上清液。此步可以重復(fù)I次。讓酒精在室溫?fù)]發(fā)干凈，加入10 μ IH1-Di Formamide 溶解 DNA。
[0025]最后在PCR儀上變性:95攝氏度4 min，4攝氏度4 min。上機(jī)電泳。
[0026]5.結(jié)果分析
將測(cè)序結(jié)果序列與CR2基因5’ UTR部分標(biāo)準(zhǔn)序列SEQ N07進(jìn)行比較，確定CR2基因rs3813946位點(diǎn)的基因型。
[0027]其中R是檢測(cè)突變位點(diǎn)，R代表該位點(diǎn)可能出現(xiàn)的堿基為G或者A。
[0028]將測(cè)序結(jié)果序列與CR2基因和第10外顯子的部分標(biāo)準(zhǔn)序列SEQ N08進(jìn)行比較，確定CR2基因rsl7615和rsl048971位點(diǎn)的基因型。
[0029]其中R是檢測(cè)突變位點(diǎn)，R代表該位點(diǎn)可能出現(xiàn)的堿基為G或者A。
[0030]實(shí)施例2.為患者提供系統(tǒng)性紅斑狼瘡分子診斷服務(wù) 1.采樣及提取基因組
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)生使用人唾液提取試劑盒從受檢者的口腔中提取上皮細(xì)胞樣本，并提取 DNA。
[0031]2.基因型檢測(cè)
通過實(shí)施例1中所述的使用方法使用本發(fā)明提供的試劑盒，得到受檢者CR2基因中含有rsl7615、rsl048971和rs3813946位點(diǎn)的DNA序列，確定位點(diǎn)的基因型。
[0032]3.判斷患者是否患有或后期發(fā)展成系統(tǒng)性紅斑狼瘡的可能性
通過受檢者的基因型，出具受檢者患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷報(bào)告。報(bào)告中詳細(xì)說明受檢者CR2基因上rsl7615、rsl048971和rs3813946位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果和突變類型，并根據(jù)已知臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算并出具評(píng)估結(jié)果。
[0033]患者突變型為G/G (圖1)，表明rsl048971位點(diǎn)無(wú)基因座特異突變；
患者突變型為G/G (圖2)，表明rsl7615位點(diǎn)無(wú)基因座特異突變；
患者突變型為A/A (圖3)，表明rs3813946位點(diǎn)無(wú)基因座特異突變；
綜合上述結(jié)果確定患者已經(jīng)患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的可能性極低。
【權(quán)利要求】
1.一種用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測(cè)試劑盒，其特征在于:同時(shí)檢測(cè)人CR2基因5，UTR區(qū)rs3813946和第10外顯子上rsl7615和rsl04897三個(gè)SNP位點(diǎn)。
2.包含如下引物: 擴(kuò)展引物: rsl7615-F 正向引物:5’ TGGAACCACGGTCACTTACA 3’ rsl7615-R 反向引物:5’ TGGGTGGGAGATAATAAACAAG 3’ rs3813946-F 正向引物:5’ GAGCCAAGAAAACCCCGAG 3’ rs3813946-R 反向引物:5’ TGTAGTGGGTTGCGTGGTCA 3’ 測(cè)序引物: rsl7615-F 正向引物:5’ TGGAACCACGGTCACTTACA 3’ rs3813946-F 反向引物:5’ GAGCCAAGAAAACCCCGAG 3’ 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)人CR2基因5’ UTR區(qū)和第10外顯子突變的方法，包括如下步驟: (1)樣本DNA提取； (2)使用權(quán)力要求I所示試劑盒中的擴(kuò)增引物(SEQNOl, SEQ N02, SEQ N03, SEQ N04)對(duì)目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)對(duì)步驟(2)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理； (4)將步驟(3)所得的純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序； (5)結(jié)果分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)人CR2基因5’UTR區(qū)和第10外顯子突變的方法，其特征在 于，PCR反應(yīng)體系:10mM的dNTP混合液2μ I ；5U/y I的Taq DNA聚合酶I μ I ；TaqBuffer 10 μ I,特異引物各I μ I ；25mM的MgCl2 10 μ I ;無(wú)菌去離子水73 μ I ; 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)人CR2基因5’ UTR區(qū)和第10外顯子突變的方法，其特征在于， 所述的PCR擴(kuò)增條件為94?96°C 3分鐘預(yù)變性；92?94°C 30秒變性、55?600C 35秒退火，72°C40秒延伸，72°C5分鐘延伸修復(fù)；重復(fù)30?35個(gè)循環(huán)；最后37°C保溫。
4.檢測(cè)人CR2基因5’UTR區(qū)和第10外顯子突變的試劑盒在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104293901SQ201310305641
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】劉驍 申請(qǐng)人:金弗康生物科技(上海)有限公司