新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白及其制備方法，該新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白穿透細(xì)胞膜的效率非常高，從而使原本不能通過細(xì)胞膜的Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞膜發(fā)揮生物學(xué)功能，大大提高了SOD催化超氧化物陰離子自由基(O2-·)發(fā)生歧化反應(yīng)的效率，使細(xì)胞免受O2-·的氧化損傷；同時PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白利用具有高穿膜作用的PTD4提高Cu，Zn-SOD穿透細(xì)胞膜的方法簡單、高效、安全，不僅不會影響Cu，Zn-SOD的生物活性，而且融合蛋白可以優(yōu)化天然蛋白結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生新的功能，和天然蛋白相比具有很多優(yōu)越性。
【專利說明】新型PTD4-Cu, Zn-SOD融合蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體涉及一種新型PTD4-CU, Zn-SOD融合蛋白；本發(fā)明還涉及這種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氧自由基是細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，正常情況下，氧自由基的產(chǎn)生和清除基本平衡，當(dāng)機(jī)體氧自由基生成明顯增多或抗氧化系統(tǒng)功能障礙時，堆積在體內(nèi)的大量氧自由基會攻擊機(jī)體，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)。超氧化物歧化酶(SOD)能夠催化超氧化物陰離子自由基(02_.)發(fā)生歧化反應(yīng)，從而有效地清除02_，使細(xì)胞免受02_.的氧化損傷。但由于自由基的產(chǎn)生和作用主要是在胞內(nèi)進(jìn)行的，任何外源的抗氧化劑都需要首先進(jìn)入細(xì)胞，才能發(fā)揮其作用。所以SOD必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)甚至是線粒體內(nèi)才能起到抗氧化損傷的作用。然而SOD分子沒有特異性受體，很難直接穿過細(xì)胞膜，其臨床作用受到很大的限制。HIV-1編碼的反式激活蛋白(TAT)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)是一種能夠把生理狀態(tài)下不能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)帶入細(xì)胞內(nèi)的載體工具?，F(xiàn)已證明PTD與其他蛋白融合表達(dá)，可以使生物大分子以非受體依賴方式進(jìn)入細(xì)胞，且具有轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白廣譜以及外源蛋白質(zhì)生物活性不受影響等優(yōu)點。然而現(xiàn)有PTD存在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對低下和潛在的細(xì)胞毒性等缺陷。針對此問題，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PTD4，其通過化學(xué)合成法把其中的3個精氨酸、2個賴氨 酸和I個甘氨酸均用丙氨酸(Ala)替換，使其a-螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，核心序列是YARAAARQARA，PTD4肽在二級結(jié)構(gòu)上是一個雙親結(jié)構(gòu)，雙親結(jié)構(gòu)的親水部分有利于精氨酸中帶正電荷的胍基和細(xì)胞表面結(jié)合，其疏水部分更有利于穿透細(xì)胞膜，被證明具有高于TAT-PTD 32倍的轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效率。同時現(xiàn)有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制備方法并不成熟和完善，融合基因的構(gòu)建、蛋白的分離及純化工藝過程復(fù)雜，尤其是誘導(dǎo)融合蛋白大量表達(dá)的條件眾說紛紜，并沒有摸索清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的主要目的是提供一種新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白，利用PTD4的高穿膜功能和低細(xì)胞毒性將原本不能通過細(xì)胞膜的Cu，Zn-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞膜發(fā)揮生物學(xué)功能，解決現(xiàn)有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白存在的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對低下以及潛在的細(xì)胞毒性問題。
[0004]本發(fā)明的另一個目的是提供所述新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，解決現(xiàn)有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制備方法融合基因的構(gòu)建、蛋白的分離和純化工藝過程復(fù)雜以及誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)量少的缺陷。
[0005]本發(fā)明構(gòu)建PTD4-Cu，Zn-SOD重組基因，該重組基因由PTD4基因、Cu，Zn-SOD基因設(shè)計合成。
[0006]PTD4基因 序列如SEQID NO:1所示，具體序列如下:
[0007]tatgcgcgtg cggcagcgcg tcaggctcgt gcc33
[0008]Cu，Zn-SOD基因序列如SEQID NO:2所示，具體序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種新型PTD4-CU，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，編碼該融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括有以下步驟: 1)分別設(shè)計Cu，Zn-SOD特異性引物和PTD4寡核苷酸序列； 2)通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增Cu，Zn-SODcDNA片段； 3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物和pET16b載體分別經(jīng)雙酶切、膠回收后進(jìn)行連接反應(yīng)； 4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DHlOB大腸桿菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定命名為pET16b-Cu，Zn-SOD 質(zhì)粒； 5)將PTD4兩條寡核苷酸鏈煮沸復(fù)性； 6)分別雙酶切pET16b-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒和煮沸復(fù)性的PTD4兩條寡核苷酸鏈，膠回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DHlOB大腸桿菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定命名為pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 質(zhì)粒； 7)將pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21 (DE3)大腸桿菌中，然后加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白表達(dá)； 8)取經(jīng)溶菌酶加超聲裂解法處理誘導(dǎo)表達(dá)后菌體的上清溶液，利用N1-NTA親和層析柱在天然條件下，依次加入咪唑結(jié)合緩沖液、咪唑漂洗緩沖液緩和咪唑洗脫緩沖液，純化PTD4-Cu, Zn-SOD 融合蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述Cu，Zn-SOD特異性引物包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物以及如SEQ ID Ν0:5所示的下游引物，其中上游引物5'端加有Xho I限制性內(nèi)切酶位點，下游引物5'端加有BamHI限制性內(nèi)切酶切位點，且含終止密碼子ΤΤΑ。
4.如權(quán)利要求2所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，所述PTD4寡核苷酸序列包括如SEQ ID NO:6所示的正鏈以及如SEQ ID NO:7所示的負(fù)鏈，其中正鏈的 端加有Nde I限制性內(nèi)切酶位點，且含起始密碼子ATG，負(fù)鏈的5'端加有Xho I限制性內(nèi)切酶位點。
5.如權(quán)利要求3所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的Cu，Zn-SOD cDNA片段和pET16b載體分別經(jīng)Xho I和BamH I限制性內(nèi)切酶切位點進(jìn)行雙酶切。
6.如權(quán)利要求4所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述pET16b-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒和煮沸復(fù)性的PTD4兩條寡核苷酸鏈分別經(jīng)Nde I和Xho I兩個限制性內(nèi)切酶位點進(jìn)行雙酶切。
7.如權(quán)利要求5或6所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)時，搖床震蕩頻率為160-220rpm/min、溫度20-37°C, IPTG終濃度為0.2-1.0mM，誘導(dǎo)時間1-6小時。
8.如權(quán)利要求7所 述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液咪唑濃度為10mM，漂洗緩沖液咪唑濃度為20mM，洗脫緩沖液咪唑濃度為50_500mM。
【文檔編號】C12N15/70GK103789278SQ201310317554
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】薛榮亮, 黨莎杰 申請人:薛榮亮