熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶突變體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶突變體及其制備方法，該突變體源于博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)的野生型甲酸脫氫酶，能夠催化輔酶NADH循環(huán)再生，與野生型甲酸脫氫酶相比表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，具有I98V、V152I、A154D、D158R中的一個或多個突變特征。本發(fā)明的重組甲酸脫氫酶突變體具有更好的熱穩(wěn)定性，適用于較高溫度下的NADH的循環(huán)再生，與目前發(fā)現(xiàn)的甲酸脫氫酶相比，本發(fā)明的甲酸脫氫酶突變體在50℃－55℃之間活性沒有明顯降低，具有更好的熱穩(wěn)定性，因此更適合于工業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶突變體及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甲酸脫氫氣酶突變體，特別涉及一種熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶 突變體及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氧化還原酶在制備手性醇、氨基酸及羥基酸等方面的應(yīng)用越來越多。但在其催 化的反應(yīng)中，90%需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH)，或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP，NADPH)做為輔酶。因為在氧化還原酶的應(yīng)用中，還需要低成本、高效的輔酶再生體 系。甲酸脫氫酶（Formate Dehydrogenase, FDH)是最成功的輔酶再生體系之一，已應(yīng)用于 工業(yè)生產(chǎn)中。其優(yōu)勢在于反應(yīng)不可逆，并只產(chǎn)生一種副產(chǎn)物一二氧化碳，對酶的活性沒有任 何影響。Kula等在2002年因為發(fā)現(xiàn)這一體系而被授予德國未來獎。但目前發(fā)現(xiàn)的FDH熱 穩(wěn)定性較差，在55°C - 60°C之間迅速失活。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種與野生型甲酸脫氫酶相比熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶 突變體、編碼序列及其制備方法。
[0004] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種甲酸脫氫酶突變體，其源于博伊 丁假絲酵母（Candidaboidinii)的野生型甲酸脫氫酶，能夠催化輔酶NADH循環(huán)再生。所述 甲酸脫氫酶突變體，與SEQIDN0. 2的野生型甲酸脫氫酶相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。甲 酸脫氫酶突變體和編碼這種突變體的多核苷酸可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法 制備。突變體可以通過使編碼該酶的體外重組、多核苷酸誘變、DNA改組、易錯PCR和定向 進(jìn)化方法等獲得。
[0005] 上述甲酸脫氫酶突變體，具有選自以下特征中的一個或多個突變：I98V，V152I， A154D，D158R。
[0006] 上述甲酸脫氫酶突變體，優(yōu)選自序列SEQIDNO. 4。全長突變的甲酸脫氫酶對于 保持酶的活性和熱穩(wěn)定性并不是必需的。相應(yīng)地，應(yīng)考慮甲酸脫氫酶突變體的截短的類似 物和有催化活性的片段。例如，在一些實施方案中，C端或N端的數(shù)個氨基酸可以被刪去。 任何特定的截短的類似物或片段可以利用相應(yīng)的試驗來評估催化活性。同樣的，額外的氨 基酸殘基可以被添加到一個或兩個末端而不影響催化活性。額外序列可以是功能性的或 非功能性的。例如，額外氨基酸序列可以被用來幫助純化，做為標(biāo)記，或執(zhí)行一些其它的功 能。因此，本公開內(nèi)容的甲酸脫氫酶突變體可以是融合蛋白的形式，其中甲酸脫氫酶突變體 (或其片段）諸如通過助溶標(biāo)簽（如SUM0蛋白）、純化標(biāo)簽（如結(jié)合金屬的His標(biāo)簽） 和細(xì)菌定位信號（如分泌信號）的實例而非限制的方式被融合到其它蛋白質(zhì)。
[0007] 上述甲酸脫氫酶突變體，其甲酸脫氫酶比野生型甲酸脫氫酶具有更好的熱穩(wěn)定 性。
[0008] 本發(fā)明提供一種編碼甲酸脫氫酶突變體的基因，其優(yōu)選自SEQIDN0. 3,其已經(jīng)過 序列優(yōu)化以適于在大腸桿菌中表達(dá)。在一些實施方案中，多核苷酸包括被優(yōu)化用于在特定 類型的宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。用于各種不同類型的微生物的密碼子的使用和偏好性是 已知的，因為其是用于在這些微生物的表達(dá)特定的氨基酸的優(yōu)化的密碼子。
[0009] 本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，其源自SEQIDN0. 5,比pET系列及pQE系列表達(dá)載 體相比其具有更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋磉_(dá)控制。在一些實施方案中，控制序列包括啟動子、前導(dǎo)序列、多 腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子等。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞，指導(dǎo)編碼序 列的轉(zhuǎn)錄的適合的啟動子包括但不限于從噬菌體T5、噬菌體17、噬菌體lambda、大腸桿菌 lacUV5操縱子、大腸桿菌trp操縱子、大腸桿菌tac操縱子等。
[0010] 本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，優(yōu)選自大腸桿菌W3110,DH1，和JM109中的一種。表 達(dá)甲酸脫氫酶突變體的表達(dá)載體可以包含允許載體整合到宿主細(xì)胞基因組中或者載體 在細(xì)菌中獨立于基因組自主復(fù)制的元件。為整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可以通過 recombineering重組工程使載體整合到基因組中。
[0011] 本發(fā)明提供一種制備甲酸脫氫酶突變體的方法，其特征在于包括以下步驟：(a) 構(gòu)建表達(dá)甲酸脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞，表達(dá)載體以及 甲酸脫氫酶突變體基因；(b)篩選得到所述基因工程菌；（c)培養(yǎng)所述基因工程菌；（d)誘 導(dǎo)表達(dá)所述基因工程菌；（e)收集和制備甲酸脫氫酶突變體。
[0012] 所述步驟a為將來自博伊丁假絲酵母（Candidaboidinii)的編碼野生型甲酸脫 氫酶的多核苷酸（SEQIDN0 :1)進(jìn)行序列優(yōu)化后通過全基因合成的方式獲得。將優(yōu)化后的 編碼甲酸脫氫酶的多核苷酸克隆到改進(jìn)后的表達(dá)載體（SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下， 得到可以表達(dá)野生型甲酸脫氫酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。所 用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴(kuò)增引物為：
[0013] F:5'TAACTTTTAGGAGGTAAAACATATGAAAATCGTTCTGGTTCTGTACG3' ；
[0014] R:5'AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTTTTTGTCGTGTTTACCGTAAGC3'
[0015] 類似的，將編碼甲酸脫氫酶突變體的多核苷酸（SEQIDN0 :3)克隆到表達(dá)載體 (SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá)甲酸脫氫酶突變體的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒 通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH1中。
[0016] 所述步驟c為挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于l〇ml高壓滅菌后 的第一培養(yǎng)基中30°C，250rpm過夜培養(yǎng)，次日取三角瓶，按1 :100的接種比例接入到100ml 高壓滅菌后的于30°C中培養(yǎng)至菌體0D5-6,立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng) lh，加入IPTG至終濃度0.ImM，并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)12h;
[0017] 所述第一培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氫二鈉3. 55g/L， 磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化銨2. 68g/L，硫酸鈉0. 71g/L，七水硫酸鎂0. 493g/L，六水氯化 鐵0. 027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 8g/L，滅菌后添加氨節(jié)青霉素至100mg/L;
[0018] 所述第二培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氫二鈉3. 55g/L， 磷酸二氫鉀3. 4g/L，氯化銨2. 68g/L，硫酸鈉0. 71g/L，七水硫酸鎂0. 493g/L，六水氯化 鐵0. 027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 3g/L。滅菌后添加卡那霉素至50mg/L。
[0019] 本發(fā)明具有積極的效果：（1)本發(fā)明的重組甲酸脫氫酶突變體具有更好的熱穩(wěn)定 性，適用于較高溫度下的NADH的循環(huán)再生，與目前發(fā)現(xiàn)的甲酸脫氫酶相比，本發(fā)明的甲酸 脫氫酶突變體在50°C- 55°C之間活性沒有明顯降低，具有更好的熱穩(wěn)定性，因此更適合于 工業(yè)化應(yīng)用。

【具體實施方式】
[0020] (實施例1)
[0021] 將來自博伊丁假絲酵母（Candidaboidinii)的編碼野生型甲酸脫氫酶的多核苷 酸（SEQIDN0 :1)進(jìn)行序列優(yōu)化后通過全基因合成的方式獲得。將優(yōu)化后的編碼甲酸脫氫 酶的多核苷酸克隆到改進(jìn)后的表達(dá)載體（SEQIDN0. 5)的啟動子的控制下，得到可以表達(dá) 野生型甲酸脫氫酶的質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒通過標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH1中。所用克隆方 法為同源重組的方式，所用到的擴(kuò)增引物為：

【權(quán)利要求】
1. 一種熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶突變體，其源于博伊丁假絲酵母的野生型甲酸脫氫 酶，能夠催化輔酶NADH循環(huán)再生，與野生型甲酸脫氫酶相比表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性，具有 選自以下特征中的一個或多個突變：I98V、V152I、A154D、D158R。
2. 根據(jù)權(quán)利要求2所述熱穩(wěn)定性增強(qiáng)的甲酸脫氫酶突變體，其特征在于：其序列為SEQ ID NO. 4。
3. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求1-2中任一項所述的重組多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：其序列為SEQ ID NO. 3。
5. -種重組質(zhì)粒，其包括表達(dá)載體連接權(quán)利要求4所述的多核苷酸，所述載體序列為 SEQ ID NO. 5。
6. -種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌，為大腸桿菌W3110， DH1，和JM109中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的宿主細(xì)胞，其中所述重組質(zhì)粒的密碼子已經(jīng)為在所述宿 主細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化。
9. 一種如權(quán)利要求1~8所述甲酸脫氫酶突變體的制備方法，包括以下步驟：(a)采用博 伊丁假絲酵母構(gòu)建表達(dá)甲酸脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主細(xì)胞， 表達(dá)載體以及甲酸脫氫酶突變體基因，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌W3110，DH1，和JM109中的 一種；(b)篩選得到所述基因工程菌；(c)培養(yǎng)所述基因工程菌；(d)誘導(dǎo)表達(dá)所述基因工 程菌；（e)收集和制備甲酸脫氫酶突變體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的甲酸脫氫酶突變體的制備方法，其特征在于：所述步驟 (c)為挑取含有目的表達(dá)載體的大腸桿菌單菌落接種于10ml高壓滅菌后的第一培養(yǎng)基中 30°C，250rpm過夜培養(yǎng)，次日取三角瓶，按1 :100的接種比例接入到100ml高壓滅菌后的于 30°C中培養(yǎng)至菌體0D 5-6,立刻將三角瓶置于25°C搖床中，250rpm培養(yǎng)lh，加入IPTG至終 濃度0. ImM，并于25°C，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)12h ; 所述第一培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸 二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0. 027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 8g/L，滅菌后添加氨節(jié)青霉素至100mg/L ; 所述第二培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氫二鈉3.55 g/L，磷酸 二氫鉀3.4 g/L，氯化銨2.68 g/L，硫酸鈉0.71 g/L，七水硫酸鎂0.493 g/L，六水氯化鐵 0. 027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0. 3g/L。滅菌后添加卡那霉素至50mg/L。
11. 一種NADH循環(huán)再生方法，包括在與權(quán)利要求1-2任一項所述的甲酸脫氫酶突變體 的存在下，將NAD催化生成NADH。
【文檔編號】C12N15/53GK104342406SQ201310320779
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】丁雪峰 申請人:南京朗恩生物科技有限公司