高活性重組人糜蛋白酶制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及高活性重組人糜蛋白酶制備方法和應用。本發(fā)明的方法包括表達人糜蛋白酶包涵體，之后對其進行變性和復性處理、純化，復性過程中調(diào)節(jié)特定的PH值、溫度、稀釋比例、添加劑成分，有效地提高了可溶性蛋白的得率，所獲得的可溶性蛋白可良好地恢復天然態(tài)結(jié)構(gòu)以及保持生物學活性，陽離子交換色譜相對于陰離子交換色譜更適合于重組人糜蛋白酶的純化，獲得高純度、高活性的重組人糜蛋白酶。重組人糜蛋白酶與糜蛋白酶應用與大鼠燙傷模型具有同樣的效果。
【專利說明】高活性重組人糜蛋白酶制備方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及高活性重組人糜蛋白酶制備方 法和應用。

【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶（Chymotrypsin，CT)，又稱胰凝乳蛋白酶，在胰臟中以糜蛋白酶原的形態(tài) 生物合成，隨著胰液分泌出去。在小腸中，糜蛋白酶原受到胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用，轉(zhuǎn) 變成具有活性的a-糜蛋白酶，是絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶。糜蛋白酶催化中心內(nèi)的專一性袋穴 較寬，主要作用于芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）等氨基酸形成的肽鍵。
[0003] 糜蛋白酶的應用主要集中在醫(yī)療方面：糜蛋白酶可以分解炎癥部位纖維蛋白的凝 結(jié)物，促進血凝塊、膿性分泌物及壞死組織的溶化分解，從而凈化創(chuàng)面，使肉芽組織新生，促 進傷口愈合。在國外，該藥在眼科、皮膚科做臨床局部應用己被肯定。國內(nèi)臨床上主要用于 眼科手術(shù)，也可用于創(chuàng)口或局部炎癥，以減少局部分泌和水腫。近年來隨著臨床藥理學研究 的不斷發(fā)展，其臨床應用范圍也日漸廣泛。
[0004] 傳統(tǒng)的糜蛋白酶制備方法是先將動物胰臟進行酸提取，提取液進行分段鹽析，除 去含雜蛋白的上清液，鹽析得到的沉淀即為糜蛋白酶原粗品；將粗品糜蛋白酶原再次分段 鹽析純化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸銨低溫結(jié)晶后透析、凍干后既得。該生產(chǎn)工 藝生產(chǎn)時間長，收率低，并且耗費大量的試劑，增加了環(huán)境凈化的成本。同時由于是從牛、豬 胰臟中提取，對動物的健康要求較高，并且有潛在的病毒污染風險。
[0005] 無動物源性、無血漿的生物藥物是目前生物藥物的國際研發(fā)前沿。從1982年第 一個上市的生物藥物--重組人胰島素替代其他從動物胰腺提取的胰島素的全面成功，到 2008美國FDA批準的第一個無血漿制品一重組凝血酶的上市和銷售的成功，研發(fā)無動物源 性的重組人糜蛋白酶替代其他從動物胰腺提取的糜蛋白酶符合這一生物藥物的發(fā)展趨勢， 本領(lǐng)域有必要開發(fā)重組人糜蛋白酶制備新工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供高活性重組人糜蛋白酶制備工藝和應用。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備高活性人糜蛋白酶的方法，所述方法包括：
[0008] (1)將人糜蛋白酶的包涵體進行變性，分離含有經(jīng)變性的人糜蛋白酶的上清；
[0009] (2)應用復性液進行復性，所述復性液包括100±10mMTris-HCl;復性時，調(diào)節(jié) pH8. 0±0. 2、溫度2?20°C(較佳地3?18°C;更佳地4-10°C)、復性液：變性液的體積比 大于8 (較佳地等于9)，經(jīng)激活獲得可溶的高活性人糜蛋白酶。
[0010] 在一個優(yōu)選例中，所述的復性液中，還添加按照體積〇. 1-0. 8%甘油；較佳地添加 按照體積〇. 4-0. 6%甘油；和/或
[0011] 所述的復性液中，還添加l-10mMGSH;更佳地添加2-6mMGSH;和/或
[0012] 所述的復性液中，還添加激活劑重組胰蛋白酶。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的包涵體如下表達：
[0014] (a)將含有人糜蛋白酶編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)該大腸桿菌；
[0015] (b)用IPTG誘導大腸桿菌，使之表達人糜蛋白酶的包涵體。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，還包括：破碎大腸桿菌細胞，分離獲取沉淀，其中含有人糜蛋白 酶的包涵體。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對獲得的人糜蛋白酶的包涵體進行洗滌。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的變性包括：將人糜蛋白酶的包涵體溶解于變性液中變性 0. 5-6小時；所述變性液包含：4-10M尿素，0. 1-lOOmMP-巰基乙醇。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)之后，還包括：DEAE-FFSepharose陰離子交換柱或 CM-FF陽離子交換層析柱進行人糜蛋白酶的純化；較佳地，應用CM-FF陽離子交換層析柱進 行人糜蛋白酶的純化。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：對純化產(chǎn)物進行凍干。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法依次包括：將含有人糜蛋白酶編碼基因的表達載體 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)酵培養(yǎng)該大腸桿菌一離心收集細胞一細胞破碎一離心收集包涵體一包涵 體洗滌一包涵體溶解變性一復性一微濾除菌澄清一超濾濃縮一透析一離子柱純化一濃縮 -透析一除菌過濾一凍干。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述方法生產(chǎn)的重組人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符 合2010版藥典對于生物制品的要求。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供前面任一所述的方法獲得的重組人糜蛋白酶或其凍干 粉在制備治療皮膚創(chuàng)傷中的用途；較佳地，所述的重組人糜蛋白酶或其凍干粉與天然人糜 蛋白酶具有相同的效果。
[0024] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1、應用大腸桿菌重組表達人糜蛋白酶，各階段樣品的電泳結(jié)果。Linel:誘導前 全菌，Line2:誘導后全菌，Line3:誘導后破菌產(chǎn)物離心上清，Line4:誘導后破菌產(chǎn)物離心 沉淀。
[0026] 圖2、復性pH優(yōu)化試驗。將lmL變性液分別緩慢加入到1OmL復性液（1OOmM Tris-HCl，pH8. 0、8. 5、9. 0、9. 5)中。25°C復性 24h后激活 2h，測定酶活性。
[0027] 圖3、復性溫度優(yōu)化試驗。將lmL變性液分別緩慢加入到溫度為4、18、25、37°C， 10mL復性液（100mMTris-HClpH8. 0)中。復性24h后激活12h，測定酶活性。
[0028] 圖4、稀釋倍數(shù)條件優(yōu)化試驗。將lmL變性液分別緩慢加入6、7、8、9mL復性液 (100mMTris-HClpH8.0)中。復性24h后激活12h，測定酶活性。
[0029] 圖5、添加劑的優(yōu)化。將lmL變性液分別緩慢加入到9mL復性液（100mMTris-HCl pH8. 0)、復性液（100mMTris-HClpH8. 0、0?l%(v/v)甘油）、復性液（100mMTris-HCl pH8.0、0.01%(v/v)TritonX-100)中。復性 24h后激活 12h，測定酶活性。
[0030] 圖6、將lmL變性液分別緩慢加入到9mL復性液（lOOmMTris-HClpH8. 0)、復性液 (lOOmMTris-HClpH8.0、0.25%(v/v)甘油）、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0、0.5%(v/v)甘 油）、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0、0.75%(v/v)甘油）、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0、l%(v/v)甘油）、復性液（lOOmMTris-HClpH8. 0、1.25%(v/v)甘油）中。復性 24h后激活 12h，測定酶活性。
[0031] 圖7、谷胱甘肽（GSH)對糜蛋白酶復性的影響。將lmL變性液分別緩慢加入到9mL 復性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5% 甘油）、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v) 甘油、ImMGSH)、復性液（lOOmMTris-HClpH8. 0,0? 5%(v/v)甘油、2mMGSH)、復性液（lOOmM Tris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘油、3mMGSH)、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘 油、4mMGSH)、復性液（lOOmMTris-HClpH8.0,0.5%(v/v)甘油、5mMGSH)中。復性 24h后 激活12h
[0032] 圖8、激活劑濃度選擇。將lmL變性液緩慢加入到三組9mL復性液（lOOmMTris-HCl pH8. 0,0. 5%甘油、2mMGSH)中。復性24h后分別向每組復性液中加入30、60、90u/mL激活 劑激活12h，測定酶活性。
[0033] 圖9、DEAE_FFS印harose柱純化電泳圖。泳道1-12:洗脫液1-12;泳道13:上樣 液；泳道 14 :marker〇
[0034] 圖 10、CM-FF柱純化rhCTSDS-PAGE電泳圖。泳道M:Marker;Lanel:流出 1 ;Lane2: 流出 2 ;Lane3 :流出 3 ;Lane4 :100mMNaCl溶液；Lane5 :200mMNaCl溶液①；Lane6 :200mM NaCl溶液②；Lane7 :300mMNaCl溶液。
[0035] 圖11、CM-FF純化后合并液純化產(chǎn)物凍干后成品的SDS-PAGE結(jié)果。泳道1: Marker;泳道2 :凍干樣品。
[0036] 圖12、標準曲線。

【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，提供了一種應用生物工程重組技術(shù)生產(chǎn)高活性重組人 糜蛋白酶的優(yōu)化工藝，所述工藝包括表達人糜蛋白酶包涵體，之后對其進行變性和復性處 理，復性過程中調(diào)節(jié)特定的PH值、溫度、稀釋比例、添加劑成分，有效地提高了可溶性蛋白 的得率、純度，且所獲得的可溶性蛋白可良好地恢復天然態(tài)結(jié)構(gòu)以及保持生物學活性。
[0038] 工藝流程
[0039] 本發(fā)明中，糜蛋白酶的總體生產(chǎn)工藝流程如下：發(fā)酵離心收集細胞細胞 破碎離心收集包涵體包涵體洗滌包涵體溶解變性復性一微濾除菌澄 清一超濾濃縮一透析一離子柱純化一濃縮一透析一除菌過濾一凍干。在該 工藝流程中，本發(fā)明人對部分流程進行了優(yōu)化。
[0040] 蛋白的表達
[0041] 本發(fā)明人嘗試了采用多種表達系統(tǒng)（如酵母系統(tǒng)，大腸桿菌系統(tǒng)）來表達人糜蛋 白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌系統(tǒng)較適于表達人糜蛋白酶，獲得包涵體形式的蛋白。
[0042] 研究表明包涵體形成的主要原因是蛋白質(zhì)表達速度過快，以致蛋白質(zhì)沒有足夠 的時間進行正確的折疊；另外由于大腸桿菌的胞質(zhì)環(huán)境是一個還原性的環(huán)境，導致蛋白質(zhì) 中的二硫鍵無法正確配對，這也是導致包涵體形成的一個重要原因[MisawaS，Kumagai I.RefoldingoftherapeuticproteinsproducedinEscherichiacoliasinclusion bodies.Biopolymers. 1999;51 (4) :297_307]。在研究之初，本發(fā)明人曾試圖通過低濃度 IPTG誘導或低溫等方式促進蛋白的可溶表達，但是表達結(jié)果顯示這些方法對提高人糜蛋白 酶的可溶表達并無明顯效果。也即，只能采取包涵體表達，后續(xù)進行變復性獲得可溶性蛋白 這一途徑。
[0043] 因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的包涵體如下表達：(a)將含有人糜蛋白酶編 碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)該大腸桿菌；(b)用IPTG誘導大腸桿菌，使之表達人 糜蛋白酶的包涵體。
[0044] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有編碼目的蛋白的DNA序列的表達 載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0045] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進行。
[0046] 培養(yǎng)基因工程菌并使之表達目的蛋白的方法和條件是本領(lǐng)域人員已知的，例如可 采用IPTG或者高溫誘導表達。較佳地，采用IPTG誘導表達。
[0047] 在基因工程菌表達了包涵體蛋白后，通常需要進行破菌（S卩：破碎大腸桿菌細 胞），從而釋放出包涵體蛋白。破菌的方法沒有特別的限制，例如超聲破菌或高壓均漿破菌。[0048] 破碎細胞后，分離獲取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵體。分離沉淀通常采取離 心的方法。
[0049] 在獲得含有包涵體的沉淀后，優(yōu)選地還包括洗滌的步驟，這樣可以去除與包涵體 混合在一起的脂質(zhì)體、脂多糖、核酸或雜蛋白等雜質(zhì)，有利于后續(xù)變復性的進行。
[0050] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的洗滌包括步驟：先應用TritonX-100洗滌1-2次， 再通過1-3次純水洗滌。
[0051] 蛋白的變性
[0052] 包涵體的變性可以采用多種蛋白變性試劑，例如尿素和鹽酸胍，其都可以實現(xiàn)將 包涵體溶解的目的。對于人糜蛋白酶而言，較佳地應用尿素以及巰基乙醇。更佳的變性 方法為：將人糜蛋白酶的包涵體溶解于變性液中變性0. 5-6小時；所述變性液包含：4_10M 尿素，0.l-100mM0 -疏基乙醇。
[0053] 蛋白的復性
[0054] 本發(fā)明人在摸索人糜蛋白酶的包涵體的復性條件時，考慮了很多條件，最終確定 pH對人糜蛋白酶的復性影響最大，具體體現(xiàn)為在弱堿性（pH8或9. 5左右之間）條件下人 糜蛋白酶的復性活性較好。同時，溫度對于復性也有影響，較佳的溫度是2?20°C;更佳地 3?18°C;最佳地4-10°C。同時，復性液：變性液的體積比也有影響，較佳的體積比大于8， 更佳地等于9。
[0055] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的復性液中，還添加按照體積0. 1-0.8%甘油；較佳 地添加按照體積〇. 4-0. 6%甘油。更佳地，所述的復性液中，還添加l-10mMGSH;更佳地添加 2-6mMGSH。更佳地，所述的復性液中，還添加激活劑重組胰蛋白酶。
[0056] 對蛋白進行復性的時候，在選用上述試劑的情況下，可以通過多種途徑進行復性， 例如但不限于：稀釋復性、透析復性、層析復性等。優(yōu)選的是稀釋復性。
[0057] 復性實驗結(jié)果表明，在上述優(yōu)化條件下，獲得的人糜蛋白酶的酶活性超過4. 5U/ mlo
[0058]蛋白的純化
[0059] 在經(jīng)過蛋白復性后，還可對復性后的蛋白進行純化。蛋白純化可采用本領(lǐng)域常用 于蛋白純化的方法，例如超濾、透析、離子交換層析、分子篩層析等。
[0060] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，應用DEAE-FFS印harose陰離子交換柱或CM-FF陽離子 交換層析柱進行人糜蛋白酶的進行純化。
[0061] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，還包括：對純化產(chǎn)物進行凍干。
[0062] 本發(fā)明的優(yōu)化工藝通過優(yōu)化蛋白復性時的PH值、溫度、稀釋比例以及添加劑，有 效地提高了可溶性蛋白的得率、純度，以及提高了人糜蛋白酶的活性。所獲得的可溶性蛋白 可良好地恢復天然態(tài)結(jié)構(gòu)以及保持生物學活性。
[0063] 并且，本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的重組人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合 2010版藥典對于生物制品的要求。
[0064] 動物試驗表明，本發(fā)明所述的方法獲得的重組人糜蛋白酶或其凍干粉對于治療皮 膚創(chuàng)傷具有良好的藥效；與天然人糜蛋白酶具有相同的效果。
[0065] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0066] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0067]實施例1、載體構(gòu)建及表達鑒定
[0068] 根據(jù)人源糜蛋白酶氨基酸序列SEQIDN0:1，人工合成基因序列（GeneCT)。Gene CT整合至表達載體pET24a(購自Invitrogen)的Ndel/EcoRI位點中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌BL21 (DE3)，獲得轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆菌落，接種至30mlLB培養(yǎng)液中 (含100yg/mlKana)，置于37°C搖床過夜培養(yǎng)（10_12h)后，以2%接種量轉(zhuǎn)入二級瓶中，繼 續(xù)培養(yǎng)。菌密度至0D6000. 5-0. 6時，加入終濃度為0. 5mmo/LIPTG誘導4h，lOOOOrpm離心 收集菌體，棄上清，菌體超聲破碎，離心后獲得上清和沉淀，沉淀即為包涵體，對上清和沉淀 進行SDS-PAGE電泳鑒定。
[0069] 人糜蛋白酶氨基酸序列（SEQIDN0:1):

【權(quán)利要求】
1. 一種制備高活性人糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 將人糜蛋白酶的包涵體進行變性，分離含有經(jīng)變性的人糜蛋白酶的上清； (2) 應用復性液進行復性，所述復性液包括100± 10mM Tris-HCl ;復性時，調(diào)節(jié) pH8. 0±0. 2、溫度2?20°C、復性液：變性液的體積比大于8,經(jīng)激活獲得可溶的高活性人 糜蛋白酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復性液中，還添加按照體積0. 1-0. 8% 甘油；較佳地添加按照體積〇. 4-0. 6%甘油；和/或 所述的復性液中，還添加l-l〇mM GSH ;更佳地添加2-6mM GSH ;和/或 所述的復性液中，還添加激活劑重組胰蛋白酶。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包涵體如下表達： (a) 將含有人糜蛋白酶編碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)該大腸桿菌； (b) 用IPTG誘導大腸桿菌，使之表達人糜蛋白酶的包涵體。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還包括：破碎大腸桿菌細胞，分離獲取沉淀， 其中含有人糜蛋白酶的包涵體。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的變性包括：將人糜蛋白酶的包涵體溶 解于變性液中變性〇. 5-6小時；所述變性液包含：4-10M尿素，0. 1-lOOmMP -巰基乙醇。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)之后，還包括：DEAE-FF S印harose 陰離子交換柱或CM-FF陽離子交換層析柱進行人糜蛋白酶的純化；較佳地，應用CM-FF陽離 子交換層析柱進行人糜蛋白酶的純化。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，還包括：對純化產(chǎn)物進行凍干。
8. 如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，該方法依次包括：將含有人糜蛋白酶編 碼基因的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，發(fā)酵培養(yǎng)該大腸桿菌一離心收集細胞一細胞破碎一離心 收集包涵體一包涵體洗滌一包涵體溶解變性一復性一微濾除菌澄清一超濾濃縮一透析一 離子柱純化一濃縮一透析一除菌過濾一凍干。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法生產(chǎn)的重組人糜蛋白酶的宿主 DNA、宿主蛋白含量均符合2010版藥典對于生物制品的要求。
10. 權(quán)利要求1-8任一所述的方法獲得的重組人糜蛋白酶或其凍干粉在制備治療皮膚 創(chuàng)傷中的用途；較佳地，所述的重組人糜蛋白酶或其凍干粉與天然人糜蛋白酶具有相同的 效果。
【文檔編號】C12R1/19GK104342423SQ201310323446
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】趙致, 安少朋 申請人:邁格生物醫(yī)藥（上海）有限公司