支原體核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種支原體核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，具體地，本發(fā)明方法包括步驟：在反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增支原體的特異性引物對(duì)，所述引物可以從極低支原體拷貝數(shù)的檢測(cè)樣品中擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)于支原體特征性序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明方法能夠高特異性、高靈敏度、低污染、快速地對(duì)含有支原體RNA的待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，尤其適用于對(duì)含有生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP的待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，具有檢測(cè)效率高，準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】支原體核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物的生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí) 熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的支原體的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)中使用的引物、探 針及相關(guān)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 支原體是一類介于細(xì)菌與病毒之間的原核細(xì)胞微生物，缺少細(xì)胞壁，能獨(dú)立復(fù)制。 寄生于人和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物的泌尿生殖道中，依靠高度特異的寄生機(jī)制包括獨(dú)特的頂端細(xì) 胞器移植并侵入到人類細(xì)胞。
[0003] 近年來(lái)大量的流行病學(xué)資料提示，生殖支原體MG是人類泌尿生殖道的常見(jiàn)病原 體，與許多非淋球菌性尿道炎（NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有關(guān)系，是性傳播疾病的病原 體之一。
[0004]目前，MG的主要檢測(cè)方法有：培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。分離培養(yǎng) 和血清學(xué)方法，繁雜費(fèi)時(shí)，無(wú)法滿足同時(shí)處理大量樣本的需要。分子生物學(xué)方法需要經(jīng)歷幾 十個(gè)溫度變化的循環(huán)過(guò)程，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且產(chǎn)物為DNA，易污染，易受其他因素影響。因 此，開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、特異且不易污染的試劑盒非常必要。
[0005] 肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae,MP)感染不僅引起肺部病變，且能侵入心、 腦、肝、腎等其他器官，引起多種肺外表現(xiàn)。由于感染常無(wú)特異性表現(xiàn)，容易與一般的病毒性 感冒相混淆。
[0006]目前，MP的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。然而，傳 統(tǒng)的MP分離培養(yǎng)需3周甚至更長(zhǎng)時(shí)間；MP快速培養(yǎng)法是利用MP在選擇性液體培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)，根據(jù)其代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變的特點(diǎn)來(lái)判斷MP是否生長(zhǎng)，顯著縮短了MP的培 養(yǎng)時(shí)間，一般實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，但在判斷時(shí)需要注意假陰性。
[0007] 免疫學(xué)方法包括很多，其中冷凝集試驗(yàn)（cold agglutinin test, CAT)的敏感性及 特異性均不理想。富士明膠顆粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction, PLA)的靈敏度和特異性均提高，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，3小時(shí)能出報(bào)告， 適合臨床常規(guī)檢查。ELISA間接法用于檢測(cè)血清中特異性的IgM和IgG抗體，但檢測(cè)結(jié)果 受免疫系統(tǒng)狀況的影響。
[0008] 分子生物學(xué)主要為檢測(cè)DNA的PCR法和檢測(cè)RNA的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法。PCR屬于 一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，用寡核苷酸指導(dǎo)的DNA合成的重復(fù)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶核酸序列的擴(kuò) 增。從理論上PCR可將最初的靶DNA擴(kuò)增109倍。最后可用凝膠電泳或探針雜交檢測(cè)擴(kuò)增 的DNA。除了樣本中的抑制物會(huì)影響PCR的敏感性，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果外，PCR的另外一 個(gè)缺點(diǎn)是由于其本身技術(shù)原理的原因，容易造成假陽(yáng)性污染。
[0009] 最新發(fā)展RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的是Gen-Probe公司的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法（TMA)，其采用 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，在檢測(cè)中，需要打開(kāi)反應(yīng)管進(jìn)行滅活，在污染控制上稍顯不足。
[0010]實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Simultaneous AMGlification and Testing， 簡(jiǎn)稱SAT)是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處， 前者檢測(cè)體系多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟，核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行（42°C)，無(wú)需熱循 環(huán)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相對(duì)于其它核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)抑 制物更少，能有效減少假陰性結(jié)果。然而，SAT技術(shù)在不同種類病毒的檢測(cè)中應(yīng)用所面臨的 問(wèn)題各不相同，需要具體分析病毒的特性進(jìn)行專門設(shè)計(jì)。目前尚無(wú)針對(duì)生殖支原體（MG)及 肺炎支原體（MP)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種快速，高準(zhǔn)確度，污染易控，設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低的支原體 RNA檢測(cè)方法。
[0012] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種支原體的擴(kuò)增方法，所述擴(kuò)增方法包括步驟：在 反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增支原體的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包 括：
[0013]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0014]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系中還包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括待測(cè)支原體的特異性捕獲探針。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括待測(cè)支原體的特異性檢測(cè)探針。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針的一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)探針的5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，且檢測(cè)探針的3'端 標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDN0:5所示。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 13所示。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針可與生殖支原體MG的靶標(biāo)核酸（MGRNA)序列 特異結(jié)合。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在另一對(duì)照反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)照反應(yīng)體系中含有所述特異性引物對(duì)、MG內(nèi)標(biāo)（MG1C RNA)、所述捕獲探針和所述檢測(cè)探針。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的MG檢測(cè)探針用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述MG 靶標(biāo)核酸（MGRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中生殖支原體MG或的拷貝數(shù)小于100個(gè)，較佳 地為1-50個(gè)拷貝，更佳地為1-10個(gè)拷貝。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針可與肺炎支原體MP的靶標(biāo)核酸（MPRNA)序列 特異結(jié)合。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在另一對(duì)照反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)照反應(yīng)體系中含有所述特異性引物對(duì)、MP內(nèi)標(biāo)（MP1C RNA)、所述MP捕獲探針和所述MP檢測(cè)探針。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述捕獲探針的核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的MP檢測(cè)探針用于與在I7RNA聚合酶作用下根據(jù)所述MP 靶標(biāo)核酸（MPRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中肺炎支原體MP或的拷貝數(shù)小于100個(gè)，較佳 地為1-50個(gè)拷貝，更佳地為1-10個(gè)拷貝。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)待測(cè)支 原體的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述方法為實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增法。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系中還含有待測(cè)的生殖支原體或衍生自所述生殖支 原體核酸。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)核酸是來(lái)自環(huán)境樣品或人類泌尿生殖道分泌物的核 酸。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)核酸是來(lái)自環(huán)境樣本或人類泌尿生殖道或呼吸道 分泌物的核酸。
[0041] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種支原體的非診斷性檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包 括：
[0042] 用如本發(fā)明第一方面中所述的擴(kuò)增方法擴(kuò)增待測(cè)樣品；和
[0043] 在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)待測(cè)支原體的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括設(shè)置一個(gè)或多個(gè)對(duì)照組。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)照組包括：陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、內(nèi)標(biāo)對(duì)照組。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0047] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種支原體的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：
[0048] (a)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的擴(kuò)增生殖支原體的特異性引物對(duì)，所述引物 對(duì)包括：
[0049]T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0050]nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示；
[0051] 以及使用說(shuō)明書(shū)。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測(cè)含有生殖支原體（MG)和/或肺炎支原體 (MP)的待測(cè)樣品。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的一種或多種組分：
[0054](b)捕獲探針；
[0055] (c)檢測(cè)探針；
[0056] (d)待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列；和/或
[0057](e)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括一種或多種酶。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的酶是M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲 探針存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MG檢測(cè)探針存在于一檢測(cè)液中。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和I7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕獲 探針存在于一核酸提取液中，所述17引物、n!7引物和MP檢測(cè)探針存在于一檢測(cè)液中。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于MG檢測(cè)液中。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針存在于MP檢測(cè)液中。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述MG內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，并與MG靶標(biāo)核苷酸（MGRNA)使用 同一對(duì)引物07和nT7)。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，所述MP內(nèi)標(biāo)為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)，并與MP靶標(biāo)核苷酸（MPRNA)使用 同一對(duì)引物07和nT7)。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照和/或陰性對(duì)照。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括MG陽(yáng)性對(duì)照和/或MG陰性對(duì)照。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括MP陽(yáng)性對(duì)照和/或MP陰性對(duì)照。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0070] 所述捕獲探針是與生殖支原體的靶標(biāo)核酸（MGRNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針； 和/或
[0071] 所述檢測(cè)探針是與根據(jù)所述MG靶標(biāo)核酸（MGRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特 異結(jié)合的MG檢測(cè)探針；和/或
[0072] 所述的待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列是MG的內(nèi)標(biāo)序列。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0074] 所述捕獲探針是與肺炎支原體的靶標(biāo)核酸（MPRNA)序列特異結(jié)合的捕獲探針； 和/或
[0075] 所述檢測(cè)探針是與根據(jù)所述MP靶標(biāo)核酸（MPRNA)的DNA拷貝產(chǎn)生的RNA拷貝特 異結(jié)合的MP檢測(cè)探針；和/或
[0076] 所述的待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列是MP的內(nèi)標(biāo)序列。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針和/或所述的MG檢測(cè)探針還可與生殖支原體MG 的靶標(biāo)核酸（MGRNA)序列特異結(jié)合。
[0078] 在另一優(yōu)選例中，所述的捕獲探針和/或所述的MP檢測(cè)探針還可與肺炎支原體MP 的靶標(biāo)核酸（MPRNA)序列特異結(jié)合。
[0079] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包含以下組分：裂解液、核酸提取液、洗滌液、MG反 應(yīng)液、MG檢測(cè)液、SAT酶液、MG陽(yáng)性對(duì)照、MG陰性對(duì)照和MG內(nèi)標(biāo)；
[0080] 其中，
[0081] 所述裂解液包括硫酸銨（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0082] 所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
[0083] 所述洗滌液包括NaCl和SDS;
[0084] 所述MG反應(yīng)液包括dNTP和NTP;
[0085] 所述MG檢測(cè)液包括17引物、n!7引物、MG檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；
[0086] 所述SAT酶液包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶；
[0087] 所述MG陽(yáng)性對(duì)照包括含生殖支原體16SRNA的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0088] 所述的MG陰性對(duì)照是不含有生殖支原體靶標(biāo)核酸（MGRNA)序列或不含有生殖支 原體的溶液，較佳地，所述的陰性對(duì)照是生理鹽水；
[0089] MG內(nèi)標(biāo)：含MG內(nèi)標(biāo)RNA(MGICRNA，序列如SEQIDN0:7所示）稀釋物。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包含以下組分：裂解液、核酸提取液、洗滌液、MP反 應(yīng)液、MP檢測(cè)液、SAT酶液、MP陽(yáng)性對(duì)照、MP陰性對(duì)照和MP內(nèi)標(biāo)；
[0091] 其中，
[0092] 所述裂解液包括硫酸銨（(NH4) 2S04)和HEPES;
[0093] 所述核酸提取液包括捕獲探針和磁珠；
[0094] 所述洗滌液包括NaCl和SDS;
[0095] 所述MP反應(yīng)液包括dNTP和NTP;
[0096] 所述MP檢測(cè)液包括17引物、n!7引物、MP檢測(cè)探針和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針；
[0097] 所述SAT酶液包括M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶；
[0098] 所述MP陽(yáng)性對(duì)照包括含肺炎支原體16SRNA的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物；
[0099] 所述的MP陰性對(duì)照是不含有肺炎支原體祀標(biāo)核酸（MPRNA)序列或不含有肺炎支 原體的溶液，較佳地，所述的陰性對(duì)照是生理鹽水；
[0100] MP內(nèi)標(biāo)：含MP內(nèi)標(biāo)RNA(MPICRNA，序列如SEQIDN0:14所示）稀釋物。
[0101]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
[0102] A盒為標(biāo)本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
[0103] B盒為核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元，包括所述MG反應(yīng)液、MG檢測(cè)液、SAT酶液、MG陽(yáng)性對(duì)照、 MG陰性對(duì)照及MG內(nèi)標(biāo)。
[0104] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括A盒和B盒，其中，
[0105] A盒為標(biāo)本處理單元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗滌液；
[0106] B盒為核酸擴(kuò)增檢測(cè)單元，包括所述MP反應(yīng)液、MP檢測(cè)液、SAT酶液、MP陽(yáng)性對(duì)照、 MP陰性對(duì)照及MP內(nèi)標(biāo)。
[0107] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0108] 所述檢測(cè)探針包括如SEQIDN0:5所示的核苷酸序列；和/或
[0109] 所述的捕獲探針包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或
[0110] 所述的待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列包括如SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；和/或
[0111] 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；
[0112] 或所述的試劑盒包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：
[0113] 所述檢測(cè)探針包括如SEQIDN0:13所示的核苷酸序列；和/或
[0114] 所述的捕獲探針包括如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待測(cè)序列 的內(nèi)標(biāo)序列包括如SEQIDN0:14所示的核苷酸序列；和/或
[0115] 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0116] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種擴(kuò)增支原體的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括：
[0117] T7引物：序列如SEQIDN0:3所示；和
[0118] nT7引物：序列如SEQIDN0:4所示。
[0119] 在另一優(yōu)選例中，所述的支原體優(yōu)選為生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0120] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種如本發(fā)明第三方面所述的試劑盒或本發(fā)明第四方 面所述的引物對(duì)的用途，其特征在于，用于檢測(cè)在環(huán)境微生物樣品或人類泌尿生殖道分泌 物或人類呼吸道分泌物樣品中是否存在支原體。
[0121] 在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)境微生物樣品包括：水源、貝類等水產(chǎn)品、水果和蔬菜 等即食性食品、色拉，或其組合。
[0122] 在另一優(yōu)選例中，所述的人類泌尿生殖道分泌物樣本包括尿液、男性尿道分泌物、 前列腺液、精液、尿液離心沉淀物，宮頸和陰道分泌物；所述的人類呼吸道分泌物樣本包括 痰液、胸膜積液、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸液。
[0123] 在另一優(yōu)選例中，所述的支原體是生殖支原體MG和/或肺炎支原體MP。
[0124] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0125] 圖1為比對(duì)組MG的引物對(duì)和探針序列的熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0126] 圖2為本發(fā)明組MG的引物對(duì)序列的熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0127] 圖3為比對(duì)組MP的引物對(duì)和探針序列的熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0128] 圖4為本發(fā)明組MP的引物對(duì)序列的熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0129] 圖5為MG臨床拭子樣本SAT檢測(cè)的靶標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0130] 圖6為MG臨床拭子樣本SAT檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0131] 圖7為MG臨床拭子樣本SAT檢測(cè)的熔解曲線圖；
[0132] 圖8為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測(cè)的靶標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0133] 圖9為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)熒光檢測(cè)結(jié)果；
[0134] 圖10為MP臨床咽拭子樣本SAT檢測(cè)的熔解曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0135] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，經(jīng)過(guò)大量篩選和驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)了一種高特異性，高 靈敏度，且能夠用于多種支原體核酸擴(kuò)增的引物對(duì)。使用該特定的引物序列對(duì)支原體的核 酸進(jìn)行擴(kuò)增，具有高特異性，高靈敏等優(yōu)異優(yōu)點(diǎn)，可以用于準(zhǔn)確地檢測(cè)一系列支原體?；?上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0136] 引物
[0137] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增支原體的特異性引物"指這樣的引物（對(duì)），它擴(kuò)增出的擴(kuò) 增產(chǎn)物具有支原體的互補(bǔ)鏈序列。優(yōu)選的引物序列包括如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4組 成的引物對(duì)，所述的引物對(duì)可以用于擴(kuò)增支原體的RNA序列，較佳地可以用于擴(kuò)增生殖支 原體和/或肺炎支原體的靶標(biāo)核酸序列，可以用于單一支原體的檢測(cè)或多種支原體的總量 檢測(cè)。
[0138] 本發(fā)明的引物序列設(shè)計(jì)包括使用DNAStar、DNAMAN軟件和人工設(shè)計(jì)，得到支原體 通用的引物序列。
[0139] 在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中，產(chǎn)生了諸多對(duì)支原體通用引物序列，比如17-2引物序列

【權(quán)利要求】
1. 一種支原體的擴(kuò)增方法，其特征在于，所述擴(kuò)增方法包括步驟：在反應(yīng)體系中進(jìn)行 擴(kuò)增，所述的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增支原體的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包括待測(cè)支原體的特異性 捕獲探針。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包括待測(cè)支原體的特異性 檢測(cè)探針。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟：在擴(kuò)增反應(yīng) 過(guò)程之中或之后，檢測(cè)待測(cè)支原體的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
5. -種支原體的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括： 用如權(quán)利要求1中所述的擴(kuò)增方法擴(kuò)增待測(cè)樣品；和 在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程之中或之后，檢測(cè)待測(cè)支原體的特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。
6. -種支原體的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的擴(kuò)增生殖支原體的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示； 以及使用說(shuō)明書(shū)。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還含有選自下組的一種或多種組分： (b) 捕獲探針； (c) 檢測(cè)探針； (d) 待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列；和/或 (e) 內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針。
8. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征：所述檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的待測(cè)序列的內(nèi)標(biāo)序列包括如SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；和/或 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； 或所述的試劑盒包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征： 所述檢測(cè)探針包括如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕獲探針包括如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待測(cè)序列的內(nèi) 標(biāo)序列包括如SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列；和/或 所述的內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針包括如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
9. 一種擴(kuò)增支原體的特異性引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括： 17引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和 n!7引物：序列如SEQ ID N0:4所示。
10. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒或權(quán)利要求9所述的引物對(duì)的用途，其特征在于，用于 檢測(cè)在環(huán)境微生物樣品或人類泌尿生殖道分泌物或人類呼吸道分泌物樣品中是否存在支 原體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104342487SQ201310330643
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】王敏, 馬道亮, 湯嘉維, 于明輝, 居金良 申請(qǐng)人:上海仁度生物科技有限公司