一種半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因csw2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種半滑舌鰨雌性特異蛋白CSW2，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:2；編碼上述的雌性特異蛋白CSW2的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發(fā)明的CSW2基因的體外重組蛋白能夠明顯升高半滑舌鰨魚苗雌性相關(guān)基因foxl2和P450芳香化酶的表達(dá)水平，具有刺激雌性相關(guān)基因表達(dá)的生物活性；同時(shí)具有降低雄性相關(guān)基因SOX9表達(dá)水平的生物活性。將CSW2重組表達(dá)產(chǎn)物作為飼料添加劑使用后將具有刺激雌性性腺發(fā)育的作用，具有提高雌魚比例的效果。因此，本發(fā)明篩選的CSW2基因在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【專利說明】—種半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)中的功能基因篩選與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因，即半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2的篩選、克隆、體外重組表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的活性分析。
【背景技術(shù)】
[0002]半滑舌鰨(Cynoglossus semiIaevis)是一種近海溫水性大型底棲魚類,其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，是我國海水養(yǎng)殖主導(dǎo)魚類之一。但半滑舌鰨雌、雄個(gè)體生長(zhǎng)速度差異很大，雌性比雄性生長(zhǎng)快2-4倍。由于雄性個(gè)體生長(zhǎng)緩慢、個(gè)體小等原因，致使增加了半滑舌鰨的養(yǎng)殖成本、降低了養(yǎng)殖產(chǎn)量，嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因而開展半滑舌鰨雌、雄特異基因的篩選鑒定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鰨性別決定機(jī)制、探索雌、雄生長(zhǎng)差異的分子機(jī)理、建立性別控制技術(shù)的重要任務(wù)。
[0003]許多魚類在生長(zhǎng)速率上存在性別差異。例如，羅非魚雄性個(gè)體生長(zhǎng)比雌性個(gè)體快30%以上；大馬哈魚雌性個(gè)體比雄性個(gè)體生長(zhǎng)快30%以上。同樣，許多海水鲆鰈魚類的雌性個(gè)體生長(zhǎng)也比雄性個(gè)體快許多。例如，半滑舌鰨、牙鲆和條斑星鰈等鲆鰈魚類的雌性個(gè)體比雄性個(gè)體生長(zhǎng)快30-100%以上。目前美國、日本、德國、法國、加拿大等國家紛紛投巨資以大馬哈魚、羅非魚和青鏘等為材料開展魚類性別特異基因篩選和性別決定機(jī)理的研究(Lee et al., 2004; Devlin and Nagahama, 2002; Matsuda et al., 2002; Nanda etal.，2002)，研究結(jié)果在Nature，PNAS等國際頂尖刊物上發(fā)表論文多篇。其中最為成功的是日本科學(xué)家以青鏘為材料篩選到青鏘雄性決定基因Y染色體特異的功能基因DMY，論文在Nature上發(fā)表(Matsuda et al.，2002)。不過，隨后的研究表明，DMY只在青鏘和另一種親緣關(guān)系很近的弓背青鏘中發(fā)現(xiàn)，而在其它親緣關(guān)系遠(yuǎn)的鏘科魚類以及其它魚類中未見DMY 雄性決定基因(Matsuda et al.,2003 ； Volff et al., 2003; Kondo et al.，2003)。因而，迄今為止，只在青鏘和弓背青鏘等極少數(shù)魚類克隆到雄性決定基因(DMY)，而在其它魚類尚未見有關(guān)性別決定基因克隆的成功報(bào)道。另外，上述魚類的性別絕大多數(shù)為XY決定類型，即雄魚為XY型，雌魚為XX型，而半滑舌鰨為ZW性別決定型，即雌性具有特異的W染色體，而雄性性染色體同型(ZZ)(周麗青等，2005)。而有關(guān)魚類雌性特異或決定基因的篩選與克隆，特別是半滑舌鰨雌性特異基因的篩選與克隆目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，魚類性別特異/決定基因，特別是半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因或決定基因的篩選與克隆以及性別決定分子機(jī)制的研究是目前國內(nèi)外上急待攻克的重要科學(xué)問題，也是建立半滑舌鰨性別控制和全雌苗種培育技術(shù)的重要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因，并構(gòu)建了該基因的體外重組表達(dá)載體，對(duì)該基因進(jìn)行體外重組表達(dá)，獲得重組表達(dá)產(chǎn)物，鑒定重組表達(dá)產(chǎn)物的生物活性及基因的功能，為半滑舌鰨性別控制和全雌苗種研制提供基因資源和技術(shù)方法。[0005]本發(fā)明的半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2。上述的雌性特異基因CSW2，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ；
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于重組表達(dá)CSW2蛋白的重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒中插入了序列為SEQ ID NO:1的DNA片段。
[0007]本發(fā)明再一個(gè)方面涉及CSW2蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚苗比例中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的CSW2蛋白作為飼料添加劑，用于刺激半滑舌鰨雌性性腺發(fā)育。
[0009]本發(fā)明的CSW2基因的體外重組蛋白能夠明顯升高半滑舌鰨雌性相關(guān)基因foxl2和P450芳香化酶的表達(dá)水平，具有刺激雌性相關(guān)基因表達(dá)的生物活性；同時(shí)具有降低雄性相關(guān)基因S0X9表達(dá)水平的生物活性，因而具有刺激雌性性腺發(fā)育的活性。將CSW2重組表達(dá)產(chǎn)物作用于半滑舌鰨魚苗后將具有刺激雌性性腺發(fā)育、具有提高雌魚比例的效果。因此，本發(fā)明篩選的CSW2基因在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0010]圖1:半滑舌鰨不同組織中CSW2基因的表達(dá)水平分析；
[0011]A:半定量PCR分析結(jié)果，上面的DNA條帶為CSW2表達(dá)水平，下面的DNA條帶為actin作為內(nèi)參；B:適時(shí)定量PCR分析結(jié)果。
[0012]圖2:半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期精巢(斜線柱)和卵巢(黑色柱)中CSW2基因的表達(dá)水平分析；4d:4 天，7d:7 天，25d:25 天，48d:48 天，62d:62 天，5m:5 個(gè)月，In:1年，2n:2年。
[0013]圖3:半滑舌鰨CSW2基因 的重組表達(dá)載體質(zhì)粒圖；
[0014]圖4:含半滑舌鰨CSW2基因的重組大腸桿菌培養(yǎng)上清液中的總蛋白及純化后重組蛋白電泳圖；其中M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker ； 1.空載體pet_32a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體蛋白電泳圖，2.CSW2重組表達(dá)載體pet-32-CSW2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體蛋白電泳圖，3.純化后的CSW2重組蛋白電泳圖；
[0015]圖5:半滑舌鰨重組CSW2蛋白注射后魚體性腺中foxl2基因在O小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析；
[0016]圖6:半滑舌鰨重組CSW2蛋白注射后魚體性腺中P450基因在O小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析；
[0017]圖7:半滑舌鰨重組CSW2蛋白注射后魚體性腺中sox9基因在O小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0019]一、半滑舌鰨雌性特異基因CSW2的克隆及其序列
[0020]對(duì)半滑舌鰨雌、雄魚分別進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)ZW雌性個(gè)體基因組中具有一個(gè)特異的基因CSW2，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，從半滑舌鰨卵巢中克隆到了雌性特異基因CSW2的cDNA，其全長(zhǎng)序列為SEQ ID N0:1，編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0021]半滑舌鰨雌性特異基因CSW2的cDNA序列全長(zhǎng)為2043bp，包括669bp的開放閱讀框(0RF區(qū)域)，編碼222個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)長(zhǎng)233bp，3,非編碼區(qū)長(zhǎng)1141bp，有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。
[0022]具體步驟如下:
[0023]1.半滑舌鰨雌性特異基因的篩選與克隆
[0024]本發(fā)明專利中的雌性特異基因序列來源于半滑舌鰨基因組測(cè)序項(xiàng)目。對(duì)半滑舌鰨雌性個(gè)體和雄性個(gè)體采用SOLEXA測(cè)序技術(shù)分別進(jìn)行全基因組測(cè)序和組裝，采用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的雌魚基因組序列和雄魚基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，從中篩選出半滑舌鰨雌性特異候選基因；對(duì)這些雌性特異候選基因設(shè)計(jì)引物，利用這些特異引物對(duì)半滑舌鰨雌雄魚基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)10個(gè)候選基因在雌魚基因組DNA中存在，而在雄魚基因組中擴(kuò)增不出來。將這10個(gè)基因命名為雌魚基因組特異基因。
[0025]2.半滑舌鰨雌性特異基因的序列
[0026]接下來，分析這10個(gè)基因組特異基因的編碼框，設(shè)計(jì)擴(kuò)增cDNA片段的引物，采用這些引物對(duì)雌魚和雄魚性腺cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將在雌魚性腺中特異表達(dá)、而在雄魚性腺中基本不表達(dá)的基因確定為雌性特異表達(dá)基因。通過這些方法我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在ZW雌魚性腺中特異表達(dá)的I個(gè)基因，命名為半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2。采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，采用CSW2基因的特異PCR引物(
[0027]CSW2-5 ' GSP:ACTGCTCCCGTTCTTGCTCCTGTTCC，CSW2-3 ' GSP:CGAGACAGGGATGAAGCCATAGCCA)，從半滑舌鰨卵巢中克隆到了雌性特異基因CSW2基因的全長(zhǎng)cDNA，其全長(zhǎng)序列為SEQ ID NO:1見序列表。
[0028]cDNA序列獲得采取cDNA末端擴(kuò)增(RACE)，方法按照SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit (Clontech),
[0029]RACE所用的體系以及反應(yīng)條件:
[0030]50μ1反應(yīng)體系
[0031]5M-1 IOX BD Advantage 2 PCR Buffer
[0032]1μ1 dNTP Mix (10 mM)
[0033]5μ1 UPM
[0034]1μ1 GSP
[0035]2μ1 3' -RACE-Ready cDNA
[0036]1μ150Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0037]35μ1 PCR-grade water
[0038]反應(yīng)條件如下:
[0039]94°C 30S, 72°C 3min 5 個(gè)循環(huán)，94°C 30S, 70°C 30S, 72°C 3min 5 個(gè)循環(huán)，94°C 30S, 68 °C 30S, 72 °C 3min 25 個(gè)循環(huán)
[0040]5' RACE所用體系及反應(yīng)條件:
[0041]50μ1反應(yīng)體系[0042]5M-1 IOX BD Advantage 2 PCR Buffer
[0043]?μ? dNTP Mix (10 mM)
[0044]5μ1 UPM
[0045]?μ? GSP
[0046]2μ1 5' -RACE-Ready cDNA
[0047]?μ150Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0048]35M-1 PCR-grade water
[0049]反應(yīng)條件如下:
[0050]94°C 30S, 72°C 3min 5 個(gè)循環(huán)，94°C 30S, 70°C 30S, 72°C 3min 5 個(gè)循環(huán)，94°C 30S, 68°C 30S, 72°C 3min 25 個(gè)循環(huán)。
`[0051]將3' RACE和5' RACE的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和純化，再與pMD_18T載體(Takara)連接，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，3730DNA Analyzer (ABI)測(cè)序，測(cè)得的序列經(jīng)CLUSTER分析拼接得到全長(zhǎng)序列。而從SEQ ID NO:1的核苷酸兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，結(jié)果表明沒有發(fā)生拼接錯(cuò)誤。
[0052]半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2的cDNA序列全長(zhǎng)為2043bp，包括669bp的開放閱讀框(0RF區(qū)域)，編碼222個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)長(zhǎng)233bp，3'非編碼區(qū)長(zhǎng)1141bp，有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。
[0053]二、半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2在不同組織及不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式
[0054]1.半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2在不同組織的表達(dá)模式:采用半定量和適時(shí)定量PCR技術(shù)分析了 CSW2基因在半滑舌鰨不同組織(心、肝、鰓、皮膚、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢、精巢)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CSW2只在雌性個(gè)體表達(dá)，其中在雌魚卵巢中表達(dá)水平最高，在雌魚垂體、腦表達(dá)量較少，其它組織幾乎不表達(dá)，而在雄魚精巢等組織中幾乎檢測(cè)不出來表達(dá)(圖1A和B)。由此證明，CSW2是半滑舌鰨雌性特異表達(dá)、且在卵巢中高表達(dá)的基因。雌魚和偽雄魚遺傳性別的鑒定按照已報(bào)道的方法進(jìn)行(Chen S L et al.，2012，Marine Biotechnology, 14(I): 120-128.)。CSW2基因在不同組織的表達(dá)檢測(cè)的具體步驟為:
[0055](I).半滑舌鰨不同組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:取250-500克重的半滑舌鰨雌魚的心、肝、鰓、皮、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢、精巢組織，用RNA提取試劑盒提取總RNA，采用常規(guī)方法通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0056](2).實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件
[0057]根據(jù)半滑舌鰨CSW2基因cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物CSW2-S，CSW2_A(CSW2-S: TAACCTCCCTCAGTTCTTCTCCTAA, CSW2-A: CCTCAGCCAAGGATGTGCC )，對(duì)半滑舌鰨雌魚不同組織(心、肝、鰓、皮、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢)以及雄魚精巢中CSW2的表達(dá)進(jìn)行分析。
[0058]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件:
[0059]20μ1反應(yīng)體系
[0060]10μ1 SYBR Taq
[0061]0.4Μ-1 primer F
[0062]0.4M-1 Primer R[0063]0.4M-1 Rox RD II
[0064]0.5Μ-1 cDNA(600ng/M-l)
[0065]8.3μ1 H2O
[0066]發(fā)現(xiàn)CSW2在卵巢中表達(dá)水平最高，在雌魚其它組織以及雄魚精巢等各組織中表達(dá)均很少(見圖1Β)，因此，CSW2是半滑舌鰨雌魚性腺高表達(dá)基因。
[0067]2.半滑舌鰨雌性特異基因CSW2在半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá):采用適時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2在半滑舌鰨雌魚和雄魚不同發(fā)育時(shí)期(4d、7d、25d、48d、62d、5m、ly、2y) (d為天，m為月，y為年)性腺中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在卵巢中62天前表達(dá)較少，幾乎不表達(dá)，62天表達(dá)明顯增強(qiáng)，62天至一年表達(dá)量呈現(xiàn)隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加趨勢(shì)，I年齡(Iy)表達(dá)量最高，2年齡(2y)表達(dá)量稍有降低。在精巢中，在各個(gè)發(fā)育時(shí)期CSW2的表達(dá)水平都非常低，甚至幾乎檢測(cè)不到表達(dá)，且不同階段無顯著性差異(圖2)。由此證明，CSW2基因在半滑舌鰨雌魚性腺分化和發(fā)育過程中起著重要作用，而在雄魚性腺發(fā)育過程中沒有起什么作用。
[0068]雌、雄魚遺傳性別的鑒定按照已報(bào)道的方法進(jìn)行(Chen S L et al.，2012，Marine Biotechnology, 14 (I): 120-128.)。CSW2基因在半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)檢測(cè)的具體步驟為:
[0069](I)半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期雌魚性腺總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:取半滑舌鰨4d、7d、25(1、48(1、62(1、5111、17、27等不同發(fā)育時(shí)期的雌雄魚性腺，用1?應(yīng)提取試劑盒提取1'0丨&1 RNA,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0070](2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:
[0071]對(duì)不同發(fā)育時(shí)期(4d、7d、25d、48d、62d、5m、8m、10m、ly、2y)雌魚性腺的cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)突光定量PCR分析,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:
[0072]20μ1反應(yīng)體系
[0073]10μ1 SYBR Taq
[0074]0.4Μ-1 primer F
[0075]0.4M-1 Primer R
[0076]0.4μ1 Rox RD II
[0077]0.5Μ-1 cDNA(600ng/M-l)
[0078]8.3μ1 H2O。
[0079]結(jié)果表明CSW2基因隨著魚體生長(zhǎng)和雌性性腺發(fā)育的進(jìn)行，卵巢中CSW2的表達(dá)水平從4(1、7(1、25(1、48(1、62(1、5111、17和2y逐漸升高，在I年齡時(shí)達(dá)最高，在二年齡時(shí)表達(dá)量稍有降低(圖2)。
[0080]3.半滑舌鰨魚苗和成魚的遺傳性別鑒定:
[0081]從半滑舌鰨魚苗或成魚上采取0.1g大小的尾鰭組織，按照常規(guī)的酚氯仿方法提取基因組DNA，隨后采用中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳松林實(shí)驗(yàn)室建立的半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記和建立的遺傳性別鑒定方法(Chen S L et al.，2012，MarineBiotechnology, 14:120-128)進(jìn)行半滑舌鰨魚苗和成魚的遺傳性別鑒定。
[0082]三、半滑舌鰨雌性特異表達(dá)基因CSW2重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌的重組表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化[0083]采用常規(guī)PCR技術(shù)，擴(kuò)增了 CSW2基因的開放閱讀框ORF區(qū)域，并將其克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建了 CSW2原核表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21中，進(jìn)行了 CSW2基因的體外重組表達(dá)，獲得了重組表達(dá)產(chǎn)物，重組表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過GE公司His-tag親和層析柱純化后，獲得了純化的CSW2重組蛋白，重組蛋白分子量為47kd左右。實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的具體方案如下:[0084]1.CSW2重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法:
[0085]對(duì)PET_32a(+)載體序列和CSW2基因ORF區(qū)序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，并設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)特異引物 PET-32-CSW2S, PET-32-CSW2A (PET-32-CSW2S:GCCGATATCATGGAGCAGGAGGAACAGGA,
[0086]PET-32-CSW2A: GCCGAATTCTCACTCTGTGCATGTCATCCTG)
[0087]上游5'端含EcoRV酶切位點(diǎn)，下游3'端含EcoRI酶切位點(diǎn)。以卵巢cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增CSW2編碼區(qū)。將PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD18-T連接，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒與PET-32a ( + )同時(shí)用EcoRI和EcoRV進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳回收CSW2片段與表達(dá)載體質(zhì)粒，按照連接酶說明書，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-CSW2 (圖3)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)，將檢測(cè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒。再將PET-32a-CSW2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)菌，同時(shí)添加30%甘油到2-3毫升感受態(tài)細(xì)菌菌種中于_80°C冷凍保存作為保種菌。
[0088]2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的初步分析
[0089]取5μ1保種的菌體接種到ImL新鮮的LB培養(yǎng)基中(含100 μ g/mL氨節(jié)青霉素)，37 °C，200r/min過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的菌體1%接種到IOmL新鮮的LB培養(yǎng)基中(含100 μ g/mL氨芐青霉素)，37 °C，250r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，在對(duì)照組(PET-32a)和實(shí)驗(yàn)組(PET-32a-CSW2)菌液中加入IPTG誘導(dǎo)，使IPTG終濃度為1mmol/L，28°C，200r/min繼續(xù)培養(yǎng)6h，在0、1、2、3、4、5和6h分別取樣ImL,將采集的樣本在4°C，12000r/min 條件下離心 5min，菌泥用 200 μ L 的 PBS 緩沖液(NaCl 137mmol/L, KCl
2.7mmol/L, Na2HP04 10mmol/L, KH2P04 2mmol/L)洗三次，每次漂洗后 12000r/min 離心211^11，加入3(^1^的？85混勻，在加入等體積的21上樣緩沖液(111101/1 pH 6.8 Tris-HCl, 1%溴酚藍(lán)，0.154gDTT, 10%SDS, 10%甘油)處理，沸水浴5min裂解菌體，收集裂解菌液樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在CSW2重組表達(dá)載體pet-32_CSW2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白中有I條分子量為38.75KD的蛋白帶(圖4中的2)，而在空載體pet_32a對(duì)照組中則無此條蛋白帶(圖4中的3)。
[0090]3.重組蛋白的分離純化
[0091]將上述保種菌在37°C條件下大量(250mL)培養(yǎng)至菌體密度達(dá)到0D600為0.6，加入IPTG終濃度為lmmol/L 28°C誘導(dǎo)6h后，4°C 12000r/min離心5min收集菌體，按照Ig濕菌體/IOmL 裂解緩沖液(20mM/L Na3P04，(λ 5M NaCl，20mM/L 咪唑，DNaseI 10U, 200 μ L50mM/L, 200ul lOmg/L溶菌酶)的比例重懸菌體，在冰浴條件下超聲破碎，4°C，12000r/min離心IOmin收集上清，將上清用0.45 μ L的過濾器過濾，將過濾的上清收集備用。應(yīng)用HisTrap HP (GE公司)親和層析柱進(jìn)行分離純化，具體操作如下:
[0092]首先，用5mL蒸餾水洗ImL柱子一次，隨后5ml結(jié)合緩沖液(20mM/L Na3P04,0.5MNaCl,20mM/L咪唑)洗柱子，再將收集的預(yù)處理的上清過柱子，流速為l_2mL/min，用5mL結(jié)合緩沖液洗柱子，再用5mL的洗脫緩沖液(20mM/L Na3P04,0.5M NaCl,500mM/L咪唑)洗脫一次，最后用5mL的結(jié)合緩沖液再生柱子。收集經(jīng)過親和層析后純化的重組蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，觀察到重組蛋白分子量為47KD左右(圖4)。
[0093]4.蛋白濃度測(cè)定
[0094]采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行定量分析，具體操作按照說明書進(jìn)行。
[0095]四、半滑舌鰨CSW2重組表達(dá)產(chǎn)物生物活性的測(cè)定及其應(yīng)用潛力
[0096]將CSW2重組表達(dá)純化產(chǎn)物注射到100-200克重的半滑舌鰨雄魚精巢，檢測(cè)了重組CSW2蛋白對(duì)性腺foxl2，p450和sox9等性別相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)注射CSW2重組表達(dá)產(chǎn)物后6-48小時(shí)內(nèi)，雌性相關(guān)基因foxl2的表達(dá)水平逐步升高，在24小時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸下降，至96小時(shí)，恢復(fù)到正常水平(圖5)。雌性相關(guān)基因p450也在6-48小時(shí)內(nèi)表達(dá)水平升高，在48小時(shí)達(dá)到最高，至96小時(shí)，恢復(fù)至正常水平(圖6)。與此相反，雄性相關(guān)基因sox9的表達(dá)水平從注射后6-24小時(shí)內(nèi)表達(dá)下降，至24小時(shí)達(dá)最低，隨后逐漸升高，至96小時(shí)，恢復(fù)正常水平(圖7)。
[0097]具體檢測(cè)方法如下:實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的具體方案為:
[0098]取100-200克重的一齡半滑舌鰨雄魚40尾，其中4尾取性腺，作為O小時(shí)對(duì)照。取18尾魚注射重組CSW2蛋白(150ul，lug/ul)，另18尾注射失活重組CSW2蛋白(沸水浴5min, 150ul, lug/ul)作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別在注射后6h，12h，24h，36h，48h，72h，96h取性腺迅速投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入_80°C保存?zhèn)溆?，每個(gè)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣3尾。根據(jù)NCBI中報(bào)道的半滑舌鰨性別相關(guān)基因Foxl2 (GQ402462), P450 (EF134716.1)和Sox9a(GQ402461)等序列設(shè)計(jì)定量引物
[0099]Foxl2-S:TGGTTGGAAGTGCGTGGG,
[0100]Foxl2-A:GAGAGGAAGG`GCAACTACTGGA ；
[0101]P450-S: ACGGGCTGAAATCGCAAG,
[0102]P450-A: GGTGAGGATGTGACCCAGTGT;
[0103]Sox9-S:CGATTCCCCTGCGTCCA,
[0104]Sox9-A: GCTTCAGTTCGGCTTTATTGG.[0105]對(duì)注射重組蛋白后的性腺實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各基因表達(dá)變化。將各基因不同時(shí)間表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析，將有顯著性差異的組用*標(biāo)出。
[0106]由此表明，本發(fā)明獲得的CSW2基因的體外重組蛋白能夠明顯升高雌性相關(guān)基因foxl2和P450基因的表達(dá)水平，具有刺激雌性相關(guān)基因表達(dá)及雌性性腺發(fā)育的生物活性，同時(shí)CSW2基因的體外重組蛋白還可以降低雄性相關(guān)基因S0X9的表達(dá)水平，即具有抑制雄性性腺發(fā)育的生物活性。將CSW2重組表達(dá)產(chǎn)物作為飼料添加劑使用后將具有刺激雌性性腺發(fā)育的作用，具有提高雌魚比例的效果，因此，在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【權(quán)利要求】
1.一種半滑舌鰨雌性特異性蛋白CSW2，其氨基酸序列為SEQ ID N0:2。
2.—種半滑舌鰨雌性特異性基因，所述的基因?yàn)闄?quán)利要求1所述的雌性特異蛋白的編碼基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列為SEQID NO:1。
4.一種重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的蛋白。
5.一種權(quán)利要求1所述的半滑舌鰨雌性特異基因CSW2的體外重組蛋白，所述的重組蛋白用于升高半滑舌鰨雌性相關(guān)基因foxl2和P450芳香化酶的表達(dá)水平，降低雄性相關(guān)基因S0X9的表達(dá)水平的活性,刺激雌性性腺的發(fā)育。
6.權(quán)利要求1所述蛋白在半滑舌鰨性別控制或提高雌性魚苗比例中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103509099SQ201310347678
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】陳松林, 胡喬木, 楊長(zhǎng)庚, 邵長(zhǎng)偉, 王娜, 劉洋, 王凱琳, 劉珊珊 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所