本發(fā)明屬于重組腺病毒載體技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

牛丙酮酸脫氫酶β亞基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因催化丙酮酸成為乙酰輔酶a(acetyl-coa)，是將糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝途徑連接起來(lái)的關(guān)鍵酶。研究表明pdhb基因的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪(imf)含量成正相關(guān)。而對(duì)基因的功能研究，主要采用過(guò)表達(dá)技術(shù)。目前，將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞表達(dá)的載體主要有兩類(lèi)。一類(lèi)是非病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，常見(jiàn)的為pcdna3.1(±)非融合性真核細(xì)胞表達(dá)載體，其優(yōu)點(diǎn)是安全性高、毒性小、外源基因長(zhǎng)度不受限制，缺點(diǎn)為效率較低，在細(xì)胞中屬于瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)時(shí)間較短。另一類(lèi)是病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，常見(jiàn)的有慢病毒(屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)載體系統(tǒng)和腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是可將外源基因整合到靶細(xì)胞基因組，持久穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，缺點(diǎn)為可引起人獲得性免疫缺陷癥，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的安全級(jí)別要求較高。腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生的病毒顆粒比較穩(wěn)定，裝載量大(可插入約10kb的外源基因)，對(duì)人的致病性低，且能將外源基因在靶細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)10d以上。本發(fā)明中使用的adeasy腺病毒表達(dá)載體已在基因的功能研究中廣泛應(yīng)用。秦川牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體的構(gòu)建及其包裝對(duì)進(jìn)一步在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制具有重要意義。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建容易，但存在在原代細(xì)胞中轉(zhuǎn)染難度大，表達(dá)時(shí)間短等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體，所述秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體的序列為：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法，所述牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟一，根據(jù)牛pdhb基因mrna序列設(shè)計(jì)引物，克隆該基因的編碼區(qū)序列；

步驟二，測(cè)序驗(yàn)證后將其重組到穿梭載體padtrack-cmv上，經(jīng)pmeⅰ線性化后，轉(zhuǎn)化到含有padeasy-1腺病毒骨架載體的e.colibj5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，以獲得重組質(zhì)粒pad-pdhb；

步驟三，再將經(jīng)pacⅰ酶切線性化的pad-pdhb轉(zhuǎn)染到hek293a細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝并擴(kuò)增高滴度病毒ad-pdhb，綠色熒光蛋白標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度；

步驟四，將高濃度的ad-pdhb病毒感染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)pdhb的表達(dá)量。

進(jìn)一步，所述引物序列為pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr產(chǎn)物大小為1166bp。

進(jìn)一步，所述pcr以肌肉cdna為模板，用kod高保真dna聚合酶擴(kuò)增牛pdhb基因，pcr反應(yīng)體系為：模板1.2μl,引物f/r各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg²⁺2.0μl，ddh2o12.0μl；

pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終止反應(yīng)10min。

進(jìn)一步，將pgmt-pdhb重組質(zhì)粒和padtrack-cmv穿梭質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶kpni和noti進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用t4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到后top10-gold感受態(tài)細(xì)胞后挑取padtrack-cmv-pdhb陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

進(jìn)一步，將padtrack-cmv-pdhb重組質(zhì)粒用pmeⅰ線性化后，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183感受態(tài)細(xì)胞；挑取pad-pdhb陽(yáng)性克隆，搖菌后提取質(zhì)粒；用pacⅰ對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pad-pdhb進(jìn)行酶切鑒定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆、菌液鑒定后送測(cè)序驗(yàn)證。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：通過(guò)構(gòu)建秦川牛丙酮酸脫氫酶β亞基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因的重組腺病毒載體，為pdhb基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的功能做準(zhǔn)備。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，本發(fā)明克隆獲得的牛pdhb基因cds與數(shù)據(jù)庫(kù)genbank收錄的序列一致，將pdhb基因cds與穿梭載體padtrack-cmv重組并轉(zhuǎn)染hek293a細(xì)胞后成功獲得了重組腺病毒ad-pdhb，其滴度為1.66×10⁹pfu·ml^-1。腺病毒ad-pdhb侵染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞后，pdhb在mrna的表達(dá)水平比對(duì)照組高25.5倍。

本發(fā)明成功克隆了秦川牛pdhb基因并構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pad-pdhb，并獲得能夠在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pdhb基因的高滴度重組腺病毒ad-pdhb。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建腺病毒過(guò)表達(dá)載體，持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)pdhb基因。本發(fā)明采用秦川牛背最長(zhǎng)肌組織作為實(shí)驗(yàn)材料，克隆秦川牛pdhb基因。利用adeasy-1系統(tǒng)構(gòu)建牛pdhb基因的高滴度重組腺病毒，從而能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)該基因。為研究該基因在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后，對(duì)細(xì)胞分化的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建牛pdhb基因的腺病毒過(guò)表達(dá)載體系統(tǒng)，為檢測(cè)pdhb基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了秦川牛pdhb基因的重組腺病毒表達(dá)載體，重組腺病毒ad-pdhb能夠在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pdhb基因。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的牛pdhb基因的克隆示意圖；

圖中：m:dl2000dnamarker；1-2:pdhb基因pcr產(chǎn)物。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的牛pdhb基因的亞克隆示意圖；

圖中：m:dl2000dnamarker；1:pdhb基因cds序列pcr產(chǎn)物。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的padtrack-cmv-pdhb質(zhì)粒的雙酶切鑒定示意圖；

圖中：m:trans2kplusiidnamarke；1:雙酶切產(chǎn)物。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的腺病毒重組質(zhì)粒pad-pdhb酶切鑒定示意圖；

圖中：m:λ-hindⅲdigestmarker；1:pacⅰ酶切產(chǎn)物。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺病毒ad-pdhb的包裝示意圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺病毒ad-pdhb感染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞示意圖；

圖中：a:重組腺病毒ad-pdhb；b:對(duì)照組ad-egfp；c:空白對(duì)照。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的牛pdhb基因在感染48h的相對(duì)表達(dá)水平示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體的序列為：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的牛pdhb基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建方法包括以下步驟：

s101：根據(jù)牛pdhb基因mrna序列(genbankaccessionno.nm_001035435)設(shè)計(jì)引物，克隆該基因的編碼區(qū)(codingsequence,cds)序列；

s102：測(cè)序驗(yàn)證后將其重組到穿梭載體padtrack-cmv上，經(jīng)pmeⅰ線性化后，轉(zhuǎn)化到含有padeasy-1腺病毒骨架載體的e.colibj5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，以獲得重組質(zhì)粒pad-pdhb；

s103：再將經(jīng)pacⅰ酶切線性化的pad-pdhb轉(zhuǎn)染到hek293a細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝并擴(kuò)增高滴度病毒ad-pdhb，綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度；

s104：將高濃度的ad-pdhb病毒感染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)檢測(cè)pdhb的表達(dá)量。

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

1材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)用到的cdna是以24月齡秦川公牛背最長(zhǎng)肌提取rna后反轉(zhuǎn)錄而來(lái)的(由本實(shí)驗(yàn)室保存)；腺病毒穿梭載體padtrack-cmv、含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183菌株、hek293a細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；瓊脂糖、脂質(zhì)體lipofectamintm2000、dmem培養(yǎng)基、胎牛血清fbs、胰蛋白酶trypsin0.25％edta均購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；top10-gold感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提中量抽提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素大提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；trans2kplusiidnamarker購(gòu)自北京全式金生物公司；pgem-t載體、dnat4連接酶購(gòu)自promega公司；dl2000marker、λ-hindⅲdigestmarker、kod高保真dna聚合酶、熒光定量pcr試劑盒、限制性內(nèi)切酶pmeⅰ、pacⅰ、kpni和noti均購(gòu)自大連寶生物(takara)公司；dna引物合成和測(cè)序均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2方法

1.2.1秦川牛pdhb基因的克隆

根據(jù)牛pdhb基因mrna(genbankaccessionno.nm_001035435)序列，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列為pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr產(chǎn)物大小為1166bp。以肌肉cdna為模板，用kod高保真dna聚合酶擴(kuò)增牛pdhb基因，pcr反應(yīng)體系(20μl)為：模板1.2μl,引物f/r(10μm)各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg²⁺2.0μl，ddh2o12.0μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終止反應(yīng)10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將pcr產(chǎn)物經(jīng)dna片段回收試劑盒純化后連接到pgem-t載體，進(jìn)而轉(zhuǎn)化到top10-gold感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，菌液pcr鑒定正確后送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。以測(cè)序正確的菌液為模板，引物序列為gpdhb-f：ggggtaccagatggcggtggttgctgtg；gpdhb-r：ataagaatgcggccgcattaaaaggtcttatgggat(小寫(xiě)字母分別為引人的kpni和noti酶切位點(diǎn))，進(jìn)行亞克隆牛pdhb基因的cds序列，pcr產(chǎn)物大小為1080bp。pcr反應(yīng)體系同前。反應(yīng)條件退火溫度為62℃，其余條件也同前。pcr產(chǎn)物純化后連接到pgem-t載體，轉(zhuǎn)化后挑取pgmt-pdhb陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，菌液pcr鑒定正確后送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2腺病毒ad-pdhb的構(gòu)建及鑒定

1.2.2.1重組穿梭質(zhì)粒padtrack-cmv-pdhb的構(gòu)建及鑒定

將pgmt-pdhb重組質(zhì)粒和padtrack-cmv穿梭質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶kpni和noti進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后用t4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到后top10-gold感受態(tài)細(xì)胞后挑取padtrack-cmv-pdhb陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁獲取菌液，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

1.2.2.2重組腺病毒質(zhì)粒pad-pdhb的構(gòu)建及鑒定

將padtrack-cmv-pdhb重組質(zhì)粒用pmeⅰ線性化后，酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183感受態(tài)細(xì)胞。挑取pad-pdhb陽(yáng)性克隆，搖菌后提取質(zhì)粒。用pacⅰ對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pad-pdhb進(jìn)行酶切鑒定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、挑取單克隆、菌液鑒定后送測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2.3腺病毒ad-pdhb的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定

取5μg無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取重組腺病毒質(zhì)粒pad-pdhb，用pacⅰ酶切后回收大片段。當(dāng)hek293a細(xì)胞生長(zhǎng)到80％左右時(shí)，按脂質(zhì)體lipofectamin^tm2000說(shuō)明書(shū)2μg質(zhì)粒/孔轉(zhuǎn)染，進(jìn)行重組腺病毒ad-pdhb包裝。將細(xì)胞置于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中孵育6h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，將細(xì)胞傳代于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中。每天觀察綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，再傳入75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察出毒跡象，即細(xì)胞收縮變圓，并伴隨有細(xì)胞脫落。轉(zhuǎn)染12-14d后，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變反應(yīng)，且有50％以上細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落后收集細(xì)胞，-80℃/37℃反復(fù)凍融3次，10，000g離心10min，收集病毒上清，即為第一代病毒母液p1。將p1病毒再次感染hek293a細(xì)胞，感染48h后收集細(xì)胞，-80℃/37℃反復(fù)凍融3次，10，000g離心10min收集病毒上清，標(biāo)記為p2。同樣方法用p2代病毒感染大量的hek293a細(xì)胞擴(kuò)增病毒至p3代。取200μl的p3代病毒沸水孵育10min后立即冰浴，短暫離心后取上清用于pcr鑒定模板。pcr鑒定反應(yīng)體系和條件同1.2.1。將收集的高滴度病毒懸液用綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度的方法。

1.2.3重組腺病毒ad-pdhb的活性鑒定

當(dāng)牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)到80％左右時(shí)，分別侵染高滴度病毒ad-pdhb和ad-egfp。侵染48h后觀察綠色熒光表情況，收集細(xì)胞提取總rna，實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)檢測(cè)檢測(cè)pdhb基因的表達(dá)情況。定量引物為pdhb-rt-f：tctgagatgggctttgctgg，pdhb-rt-r：tgacctggtcgatggcttgc，pcr產(chǎn)物大小為109bp。以牛gapdh基因(accessionno.nm_001034034)作為內(nèi)參，引物為：gapdh-rt-f：ccaacgtgtctgttgtggat，gapdh-rt-r：ctgcttcaccaccttcttga，pcr產(chǎn)物大小為80bp。

2結(jié)果

2.1秦川牛pdhb基因的克隆及鑒定

通過(guò)克隆獲得條帶單一的pcr產(chǎn)物大小為1166bp(圖2)，膠回收后連接到pgm-t載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，目的基因與數(shù)據(jù)庫(kù)genbank收錄的序列一致。設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行亞克隆獲得1080bp的條帶單一的pcr產(chǎn)物(圖3)，即為牛pdhb基因的cds序列，膠回收后連接到pgm-t載體，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤。說(shuō)明牛pdhb基因克隆成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2重組穿梭質(zhì)粒padtrack-cmv-pdhb的鑒定

限制性內(nèi)切酶kpni和noti雙酶切padtrack-cmv-pdhb質(zhì)粒，得到大小分別約為9kb和1kb的兩條條帶(圖4)，符合預(yù)期。說(shuō)明重組穿梭質(zhì)粒padtrack-cmv-pdhb構(gòu)建成功，可與腺病毒骨架載體重組。

2.3腺病毒重組質(zhì)粒pad-pdhb的鑒定

將經(jīng)pmeⅰ酶切線性化的穿梭質(zhì)粒padtrack-cmv-pdhb轉(zhuǎn)化到含有padeasy-1的e.colibj5183感受態(tài)。提取質(zhì)粒后pacⅰ酶切鑒定，電泳檢測(cè)到兩條大小分別約為30和4.5kb(圖5)的電泳條帶，初步證明腺病毒重組質(zhì)粒pad-pdhb重組成功。后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，表明pad-pdhb重組成功，可進(jìn)行下一步的腺病毒包裝實(shí)驗(yàn)。

2.4腺病毒ad-pdhb的包裝、擴(kuò)繁及滴度測(cè)定

將經(jīng)pacⅰ酶切線性化后的30kb左右的大片段膠回收后，轉(zhuǎn)染hek293a細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h，ad-pdhb在熒光顯微鏡下已能看到少量細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)綠色熒光；10d時(shí)，綠色熒光數(shù)明顯增多，視野變亮并在局部出現(xiàn)葡萄串樣熒光聚集,呈彗星狀；13d時(shí)，綠色熒光鋪滿整個(gè)視野，大量細(xì)胞病變脫落，出現(xiàn)明顯的空斑(圖6)。而空白對(duì)照組ad-egfp,轉(zhuǎn)染24h時(shí)也出現(xiàn)綠色熒光；7d時(shí)，呈現(xiàn)彗星狀；11d時(shí)，大量細(xì)胞病變脫落，出現(xiàn)明顯的空斑(圖6)。反復(fù)感染hek293a細(xì)胞3次后獲得高滴度病毒。滴度病毒用綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度，滴度為1.66×10⁹pfu·ml^-1。

2.5病毒活性鑒定

重組腺病毒ad-pdhb感染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞48h后，觀察到大量的綠色熒光(圖7)，表明病毒感染效率較高。收集細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果表明感染腺病毒ad-pdhb的pdhb基因表達(dá)量比對(duì)照組ad-egfp高25.5倍(圖8)。

本發(fā)明首先通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，將牛pdhb基因克隆出來(lái)，然后再通過(guò)設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行亞克隆獲得牛pdhb基因的cds區(qū)，采用此方法可以有效提高克隆的效率。

本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建牛pdhb基因的腺病毒過(guò)表達(dá)載體系統(tǒng)，為檢測(cè)pdhb基因在牛前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；成功構(gòu)建了秦川牛pdhb基因的重組腺病毒表達(dá)載體，重組腺病毒ad-pdhb能夠在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pdhb基因。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。