不同品種豬背最長肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種不同品種豬背最長肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬肉是人類動(dòng)物蛋白的主要來源，我國是目前世界上生豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)的第一 大國。改善肉品質(zhì)已經(jīng)成為豬肉產(chǎn)業(yè)及滿足消費(fèi)者口感、健康和營養(yǎng)需求的關(guān)鍵因素。骨 骼肌是動(dòng)物體內(nèi)最豐富的組織，約占動(dòng)物體重的40%，豬肌肉生長發(fā)育的差異是引起不同 品種豬肉質(zhì)差異的重要原因。由于肉質(zhì)性狀形成的復(fù)雜性及不能（或不易）活體測(cè)定，傳 統(tǒng)的選育方法很難對(duì)肉質(zhì)性狀取得較大遺傳進(jìn)展。因此采用分子生物學(xué)手段，深入分析肉 質(zhì)性狀遺傳機(jī)制，為其改良提供給了機(jī)會(huì)，從而參考制定合理遺傳改良方案是后基因組時(shí) 代家畜動(dòng)物育種研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 隨著后基因組時(shí)代的到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼 出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組是在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞 中表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物的集合。通過轉(zhuǎn)錄組分析可以幫助我們?cè)谡w水平上研宄細(xì)胞中基因 轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。過去的轉(zhuǎn)錄組研宄通常采用Sanger測(cè)序和cDNA芯片方法， 而現(xiàn)在的轉(zhuǎn)錄組研宄越來越多采用高通量測(cè)序技術(shù)。新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq) 與傳統(tǒng)的基因芯片相比具有高通量、低成本、高靈敏度、重復(fù)性好且無需已知參考序列等優(yōu) 點(diǎn)，已逐步取代基因芯片成為轉(zhuǎn)錄組研宄的主要手段。該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于小鼠、海鱸魚和水 稻等的RNA測(cè)序。此外，2013年楊亞嵐利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出了不同豬種間的差異表 達(dá)基因并對(duì)其進(jìn)行了功能注釋和分析。
[0004] 中外豬種比較發(fā)現(xiàn)，國外豬種具有生長速度快、瘦肉率高和飼料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)， 但往往存在肌內(nèi)脂肪少、肉色灰白和系水力低等缺點(diǎn)，我國地方豬種具有肉色鮮紅、系水力 強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高和肌纖維直徑小等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于RNA-Seq技術(shù)對(duì)不同品種豬背最長肌 差異表達(dá)基因的篩選與注釋方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：不同品種豬背最長肌差異表 達(dá)基因的篩選與注釋方法，包括以下步驟：
[0007] (1)采樣與測(cè)序：按不同豬種，采取成年期的背最長肌組織，每個(gè)豬種采集三頭個(gè) 體，樣品采集后-80°c貯存，提取各樣品總RNA，采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序；
[0008] (2)原始數(shù)據(jù)處理：將測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列 數(shù)據(jù)，并稱之為原始序列數(shù)據(jù)，其結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)；由于原始序列數(shù)據(jù)可能包 含低質(zhì)量序列、接頭序列等雜質(zhì)序列數(shù)據(jù)，不能直接用于生物信息分析，所以原始序列數(shù)據(jù) 必需經(jīng)過數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)換為高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，利用Tophat (version :2. 0. 6)軟件的spliced mapping算法對(duì)高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)進(jìn)行豬基因組比對(duì)，采用基因組版本為SscrofalO. 2 ;
[0009] (3)差異基因的篩選：基因表達(dá)量的計(jì)算使FPKM法；根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM值） 計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)；差異表達(dá)基因定義為FDRS 0. 01且倍數(shù)差異在 2倍及以上的基因；
[0010] (4)功能顯著性富集分析：把所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫的各條 目映射，計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在 差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，其計(jì)算公式為：
[0011]
【主權(quán)項(xiàng)】
1.不同品種豬背最長肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋方法，包括以下步驟： (1) 采樣與測(cè)序：按不同豬種，采取成年期的背最長肌組織，每個(gè)豬種采集三頭個(gè)體， 樣品采集后-80°c貯存，提取各樣品總RNA，采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序； (2) 原始數(shù)據(jù)處理：將測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)， 并稱之為原始序列數(shù)據(jù)，其結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)；將原始序列數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn) 換為高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，利用Tophat軟件的spliced mapping算法對(duì)高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)進(jìn)行豬 基因組比對(duì)，采用基因組版本為SscrofalO. 2 ; (3) 差異基因的篩選：基因表達(dá)量的計(jì)算使FPKM法；根據(jù)基因的表達(dá)量（FPKM值）計(jì) 算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)；差異表達(dá)基因定義為FDR < 0. 01且倍數(shù)差異在2 倍及以上的基因； (4) 功能顯著性富集分析：把所有差異表達(dá)基因向Gene Onto Iogy數(shù)據(jù)庫的各條目映 射，計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異 表達(dá)基因中顯著富集的GO條目，其計(jì)算公式為：
公式（1)中，N為基因組中具有GO注釋的基因數(shù)目；η為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目；M 為基因組中注釋為某特定GO條目的基因數(shù)目；m為注釋為某特定GO條目的差異表達(dá)基因 數(shù)目；計(jì)算得到的P值通過Bonferroni校正之后，以校正后的P值< 0. 01為閾值，滿足此 條件的GO條目定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目； (5) Pathway顯著性富集分析：Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用 超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway ;該分 析的計(jì)算公式同GO功能顯著性富集分析所用公式（1)，其中N為芯片中具有Pathway注釋 的基因數(shù)目；η為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目；M為芯片中注釋為某特定Pathway的基因數(shù)目； m為注釋為某特定Pathway的差異表達(dá)基因數(shù)目；P < 0. 01的Pathway定義為在差異表達(dá) 基因中顯著富集的Pathway。
【專利摘要】本發(fā)明公開了不同品種豬背最長肌差異表達(dá)基因的篩選與注釋方法，包括以下步驟：(1)采樣與測(cè)序；(2)原始數(shù)據(jù)處理；(3)差異基因的篩選；(4)功能顯著性富集分析；(5)Pathway顯著性富集分析。本發(fā)明采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建不同品種豬背最長肌組織的基因表達(dá)譜，獲得差異表達(dá)基因，利用GO分析和pathway分析對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，確定調(diào)控肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因，加深對(duì)肌肉生長發(fā)育和脂肪代謝調(diào)控的了解，為之后研究形成國內(nèi)外品種在肉質(zhì)和生長性狀方面的差異的分子機(jī)理提供分子生物學(xué)證據(jù)。
【IPC分類】G06F19-20
【公開號(hào)】CN104636638
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510034015
【發(fā)明人】王重龍, 李小金, 錢坤, 劉林清, 錢蓉
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月23日