真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水果保鮮【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供了一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種實(shí)施該應(yīng)用的方法，將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸1~4min后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為：0.1％-0.2%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質(zhì)量百分比為：1％-2%。該應(yīng)用采用生物天然提取物，應(yīng)用到水果保鮮中，安全、無毒、有效，為鮮果保鮮開發(fā)有效方法。
【專利說明】真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水果保鮮【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水果由于含有豐富的碳水化合物、有機(jī)酸、維生素及無機(jī)鹽等，因而成為了人類重要的營養(yǎng)源。水果不僅味美可口，還具有降血壓、減緩衰老、減肥瘦身、預(yù)癌癥等優(yōu)點(diǎn)。但水果生產(chǎn)存在較強(qiáng)的季節(jié)性、區(qū)域性以及水果本身的易腐性，這使得水果貯藏保鮮的問題日趨突出。目前，國內(nèi)外在水果保鮮領(lǐng)域采用的保鮮手段主要有低溫保鮮、氣調(diào)保鮮、化學(xué)保鮮、生物保鮮等。雖然目前水果保鮮技術(shù)類型多樣，但由于人們不僅對水果保鮮傳統(tǒng)上的色、香、味要求提高，也更加關(guān)注食品的安全性，新型的保鮮技術(shù)主要集中在生物保鮮領(lǐng)域。生物保鮮技術(shù)在水果中的應(yīng)用將主要集中在微生物菌體及其代謝產(chǎn)物的保鮮、生物天然提取物的保鮮及利用遺傳基因進(jìn)行保鮮三方面。目前，該類保鮮技術(shù)還處于研究階段，作用機(jī)理不明確，相關(guān)技術(shù)也不成熟，還未得到廣泛的應(yīng)用。但是安全、無毒、環(huán)保的新型生物保鮮技術(shù)將會成為今后保鮮行業(yè)發(fā)展的重要方向。擬為開發(fā)安全、無毒、有效的天然抑菌齊?、保鮮劑提供一定的理論基礎(chǔ)，為鮮果保鮮開發(fā)有效方法，于是研究一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種真姬菇凝集素和脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0005]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0006]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇為原料，結(jié)合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩沖液透析技術(shù)提取得真姬燕凝集素粗品，利用DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基_瓊脂糖凝膠)離子交換層析技術(shù)進(jìn)行凝集素粗品純化收集沉淀，經(jīng)過脫鹽后冷凍干燥得真姬菇凝集素。
[0007]所述真姬菇脫蛋白多糖是采用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進(jìn)行提取真姬菇抑菌多糖，經(jīng)醇沉后收集多糖沉淀為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應(yīng)用Sevag法脫除其中的蛋白成分進(jìn)行純化，脫除蛋白后的多糖成分再經(jīng)過真空冷凍干燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0008]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸Ilmin后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為:0.1% -0.2%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質(zhì)量百分比為:1% -2%。
[0009]所述真姬菇凝集素具體制備步驟為:真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:(3~7)g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，在4°C下浸提24h，4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%-75%硫酸銨飽和度沉淀部分，沉淀復(fù)溶于濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止，冷凍干燥后即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow (二乙胺乙基-瓊脂糖凝膠)柱，以 0.05mol/L,ρΗ=7.8 的 PBS憐酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細(xì)胞檢測洗脫峰的凝血活性，將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow (羧甲基-瓊脂糖凝膠)層析純化,收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品。
[0010]所述真姬菇脫蛋白多糖具體制備步驟為:采用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取濕重為500 g的真姬菇，按質(zhì)量/體積比為(1-3): lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻衆(zhòng)10 min,而后置于90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,收集沉淀為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，加入質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000rpm離心10 min,沉淀物冷凍干燥即為真姬燕去蛋白多糖。
[0011]所述真姬菇原料可以是真姬菇下腳料或子實(shí)體。
[0012]所述PBS磷酸鹽緩沖液是將Na2HPO4.12H20溶于蒸餾水中配制得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶于蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將制備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合后，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，儲存于冷暗處，備用。
[0013]真姬菇子實(shí)體中含有多種活性物質(zhì)，同時(shí)具有多種重要的功能作用，真姬菇下腳料和子實(shí)體一樣也具有多種活性物質(zhì)，其中含有大量具有活性的多糖和活性蛋白，抑菌活性就是其中一種重要的功能作用。結(jié)合食品科學(xué)中高效的提取技術(shù)，對真姬菇中抑菌多糖與凝集素進(jìn)行有效提取并分離純化，制備復(fù)合涂膜保鮮劑，研究復(fù)合涂膜保鮮劑對枇杷的高效保鮮作用。前期對真姬菇、雙胞蘑菇、竹蓀、香菇等食用菌開展大量的活性物質(zhì)提取的試驗(yàn)并進(jìn)行抑菌活性的研究，在此基礎(chǔ)上，以真姬菇為實(shí)驗(yàn)材料，對真姬菇多糖和凝集素進(jìn)行高效提取和分離純化，獲得較高純度的抑菌多糖和凝集素，進(jìn)行抑制枇杷炭疽病菌活性的初步研究，制備真姬菇多糖與凝集素復(fù)合保鮮涂膜，開展復(fù)合涂膜保鮮劑對枇杷鮮果的保鮮效果。
[0014]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)該應(yīng)用原料易得，采用下腳料作為原料減小成本，提高工業(yè)產(chǎn)值。
[0015](2)采用生物天然提取物，應(yīng)用到水果保鮮中，安全無毒，減少污染，對人體健康有
[0016]( 3 )本發(fā)明應(yīng)用對于枇杷保鮮效果明顯，能具有較好的社會經(jīng)濟(jì)效益。
[0017](4)為開發(fā)安全、無毒、有效的天然抑菌劑、保鮮劑提供一定的理論基礎(chǔ)，為枇杷鮮果保鮮開發(fā)有效方法。
[0018](5)本技術(shù)達(dá)到菌業(yè)廢棄物資源化再利用的目的，資源化利用手段綠色環(huán)保，利用效果顯著，同時(shí)實(shí)現(xiàn)真姬菇有效活性物質(zhì)首次應(yīng)用于枇杷保鮮。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1是真姬菇涂膜保鮮劑對枇杷失重率的影響。
[0020]圖2是真姬菇涂膜保鮮劑對枇杷好果率的影響。
[0021]圖3是真姬菇涂膜保鮮劑對枇杷保鮮效果，處理組I涂膜配方A，處理組2涂膜配方B。
[0022]圖4是真姬菇提取物涂膜對枇杷有機(jī)酸含量的影響。
[0023]圖5是真姬菇涂膜保鮮劑對枇杷VC含量的影響。
[0024]圖6是枇杷鮮果儲藏期間呼吸強(qiáng)度的變化。
[0025]圖7是真姬菇涂膜保鮮劑對枇杷可溶性固形物的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面的實(shí)例是為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明特征而非限制本發(fā)明。以下實(shí)施例為本發(fā)明較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)本發(fā)明的涵蓋范圍。
[0027]實(shí)施例1
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0028]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0029]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇為原料，結(jié)合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩沖液透析技術(shù)提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術(shù)進(jìn)行凝集素粗品純化收集沉淀，經(jīng)過脫鹽后冷凍干燥得真姬菇凝集素。
[0030]所述真姬菇脫蛋白多糖是采用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進(jìn)行提取真姬菇抑菌多糖，經(jīng)醇沉后收集多糖沉淀為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應(yīng)用Sevag法脫除其中的蛋白成分進(jìn)行純化，脫除蛋白后的多糖成分再經(jīng)過真空冷凍干燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0031]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸Imin后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為:0.1%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質(zhì)量百分比為:2%。
[0032]所述真姬菇凝集素具體制備步驟為:真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:3g/ml加入濃度為0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，在4°C下浸提24h，4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%硫酸銨飽和度沉淀部分,沉淀復(fù)溶于濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍干燥后即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細(xì)胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品。
[0033]所述真姬菇脫蛋白多糖具體制備步驟為:采用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取濕重為500 g的真姬菇，按質(zhì)量/體積比為1: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿10min,而后置于90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,收集沉淀為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，加入質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min，沉淀物冷凍干燥即為真姬菇去蛋白多糖。[0034]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0035]所述PBS磷酸鹽緩沖液是將Na2HPO4.12H20溶于蒸餾水中配制得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶于蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將制備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合后，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，儲存于冷暗處，備用。
[0036]實(shí)施例2
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0037]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0038]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇為原料，結(jié)合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩沖液透析技術(shù)提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術(shù)進(jìn)行凝集素粗品純化收集沉淀，經(jīng)過脫鹽后冷凍干燥得真姬菇凝集素。
[0039]所述真姬菇脫蛋白多糖是采用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進(jìn)行提取真姬菇抑菌多糖，經(jīng)醇沉后收集多糖沉淀為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應(yīng)用Sevag法脫除其中的蛋白成分進(jìn)行純化，脫除蛋白后的多糖成分再經(jīng)過真空冷凍干燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0040]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸4min后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為:0.2%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫 蛋白多糖的質(zhì)量百分比為:1%。
[0041]所述真姬菇凝集素具體制備步驟為:真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:7g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，在4°C下浸提24h，4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集75%硫酸銨飽和度沉淀部分,沉淀復(fù)溶于濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍干燥后即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-Sepharose FastFlow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細(xì)胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品。
[0042]所述真姬菇脫蛋白多糖具體制備步驟為:采用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取濕重為500 g的真姬菇，按質(zhì)量/體積比為3: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿10min,而后置于90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,收集沉淀為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，加入質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min，沉淀物冷凍干燥即為真姬菇去蛋白多糖。
[0043]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0044]所述PBS磷酸鹽緩沖液是將Na2HPO4.12H20溶于蒸餾水中配制得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶于蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將制備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合后，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，儲存于冷暗處，備用。
[0045]實(shí)施例3
真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用。[0046]真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
[0047]所述真姬菇凝集素是采用真姬菇為原料，結(jié)合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩沖液透析技術(shù)提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術(shù)進(jìn)行凝集素粗品純化收集沉淀，經(jīng)過脫鹽后冷凍干燥得真姬菇凝集素。
[0048]所述真姬菇脫蛋白多糖是采用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進(jìn)行提取真姬菇抑菌多糖，經(jīng)醇沉后收集多糖沉淀為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應(yīng)用Sevag法脫除其中的蛋白成分進(jìn)行純化，脫除蛋白后的多糖成分再經(jīng)過真空冷凍干燥得真姬菇脫蛋白多糖。
[0049]所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，是將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸
2.5min后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為:0.15%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質(zhì)量百分比為:1.5%。
[0050]所述真姬菇凝集素具體制備步驟為:真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:5g/ml加入濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，在4°C下浸提24h，4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min下冷凍離心40 min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集57.5%硫酸銨飽和度沉淀部分，沉淀復(fù)溶于濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液,裝入透析袋中除鹽,透析至外透析液無S042-檢出為止,冷凍干燥后即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-SepharoseFast Flow柱，以0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm,以兔血紅細(xì)胞檢測洗脫峰的凝血活性,將具有凝血活性的通過CM-Sepharose FastFlow層析純化，收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品。
[0051]所述真姬菇脫蛋白 多糖具體制備步驟為:采用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取濕重為500 g的真姬菇，按質(zhì)量/體積比為2: lg/ml加入蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿10min,而后置于90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,收集沉淀為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，加入質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min，沉淀物冷凍干燥即為真姬菇去蛋白多糖。
[0052]所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
[0053]所述PBS磷酸鹽緩沖液是將Na2HPO4.12H20溶于蒸餾水中配制得到濃度為0.2mo I/L的Na2HPO4,將NaH2PO4.2H20溶于蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將制備得到NaH2PO4 ^Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合后，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，儲存于冷暗處，備用。
[0054]實(shí)施例4
本實(shí)施例以真姬菇菇腳樣品為例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的一種具體實(shí)施方法，本發(fā)明包括但不限于本實(shí)施例。
[0055]試驗(yàn)菌株:真姬燕(Hypsizygusmarmoreus (Peck) H.E.Bigelow)燕腳，由福建省順昌神農(nóng)燕業(yè)有限公司提供；枇杷炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),由福建師范大學(xué)生命科學(xué)院提供。
[0056]試驗(yàn)水果:枇杷購買于福州市水果市場，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后剔除次果，選擇大小、顏色一致，沒有機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行冷藏。
[0057]藥品試劑:葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、維生素B1、抗壞血酸、2，6- 二氯酚靛酚、草酸、碳酸氫鈉、石油醚60-90、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇、無水乙醇、甲醛、戊二醛、醋酸異戊酯、鋨酸、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，以上試劑均為普通國產(chǎn)分析純。CM-纖維素鈉鹽300-800 (上海潤捷化學(xué)試劑有限公司)，薄層層析硅膠GF254化學(xué)純(青島海洋化工有限公司)，層析硅膠(100-200目，國藥試劑)，Sephadex LH-20 凝膠(瑞典 GE Healthcare), Epon812 環(huán)氧樹脂。
[0058]實(shí)驗(yàn)儀器:電熱恒溫培養(yǎng)箱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52-1 ;SHB-1IIS循環(huán)水式多用真空泵；奧豪斯電子天平CPl 14 ；LMQ-R3260自動高壓滅菌鍋；UD_650型桌上式潔凈工作臺；恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-200B ；ZF-1型石英紫外檢測儀(上海顧村電光儀器廠)；層析柱(Φ1.6cmX60cm、Φ2.6cmX40cm) ;HL_2N恒流泵(上海滬西分析儀器廠)；冷凍干燥機(jī)FD-1A-50B ；S-100N自動分部收集器(上海滬西分析儀器廠)；Leica EM UC6超薄切片機(jī)JE0L/E0掃描電子顯微鏡JEOL透視電子顯微鏡。HWF-1型紅外二氧化碳分析儀金壇市現(xiàn)代儀器廠；酸堿滴定管。
[0059]培養(yǎng)基:
(I) PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水lOOOmL，pH自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL。
[0060](2)孟加拉紅培養(yǎng)基:孟加拉紅培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)，孟加拉紅培養(yǎng)基31.6g，水lOOOmL。
[0061]涂膜保鮮劑配方:配方A: 1%真姬菇脫蛋白多糖+0.1%真姬菇凝集素；配方B:1%真姬菇脫蛋白多糖；c K:對照組。
[0062]試驗(yàn)方法
(I)真姬菇菇腳去蛋白多糖的制備
采用熱水浸提法提取真姬菇菇腳多糖，稱取500 g (濕重)真姬菇菇腳，按質(zhì)量/體積比為2:1 (即w:v=2:1)加入蒸餾水，用高速組織搗碎機(jī)勻漿10 min，而后置于90°C水浴鍋浸提8 h, 5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至1/10, 3倍95%乙醇沉淀,8000 rpm離心10 min，收集沉淀為菌絲粗多糖。粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,沉淀物冷凍干燥即為真姬燕燕腳去蛋白多糖。
[0063](2)真姬菇凝集素的制備
各種真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:5加入PBS磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L, pH=7.8)在4°C下浸提24h,4°C下冷凍離心(8000r/min,40 min),取上清液。上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%?75%硫酸銨飽和度沉淀部分。沉淀復(fù)溶于少量的PBS磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH=7.8)裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無S042-檢出為止，冷凍干燥后即為凝集素粗品。將凝集素粗品上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，以PBS磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH=7.8)進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細(xì)胞檢測各峰的凝血活性，收集活性峰，再將活性峰通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化,收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品，將所得凝集素經(jīng)SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測，顯示為約35kDa大小的單一條帶。
[0064]所述PBS磷酸鹽緩沖液是先進(jìn)行母液的配制:0.2M Na2HPO4:稱取71.6gNa2HPO4.12H20，溶于 1000ml 水；0.2M NaH2PO4:稱取 31.2g NaH2PO4.2H20，溶于 1000ml水。再進(jìn)行PBS磷酸鹽緩沖液(pH=7.8 0.05mol/L)的配制:先配0.2M PBS磷酸鹽緩沖液(ρΗ=7.8，100ml):取 8.5ml 0.2mol/L 的 NaH2PO4, 91.5ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4,即可；然后將配得的0.2M PBS磷酸鹽緩沖液(pH=7.8)稀釋四倍，在溫度為121° C下滅菌30min，即得0.05M PBS磷酸鹽緩沖液(pH=7.8)，儲存于冷暗處，備用。
[0065](3)抑枇杷炭疽病菌活性檢測
采用菌絲生長速率法(林陳強(qiáng)，林戎斌，蔡海松，等.虎奶菇抑菌物質(zhì)與食品防腐劑抑菌活性的比較[J].食用菌學(xué)報(bào)，2007，14(3):62-66.):
①菌餅制備:取活化的枇杷炭疽病菌，接于PDA培養(yǎng)基上，于28°C ±1培養(yǎng)5?6d，用無菌水洗下分生孢子，制成孢子懸液(濃度約為106個(gè)/mL)。取5mL孢子懸液，倒入熔化并冷卻至45°C?50°C的孟加拉紅培養(yǎng)基中，搖勻后，迅速分裝培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入10mL，待凝固后置于恒溫培養(yǎng)箱中，28°C ± I倒置培養(yǎng)2?3d至菌絲長滿全皿。用直徑為
0.9cm的打孔器制成若干菌餅備用。
[0066]②含藥培養(yǎng)基平板制備:準(zhǔn)確將0.1mL藥液涂布孟加拉紅培養(yǎng)基上制成含藥培養(yǎng)基平板，在對照上則涂布相同體積的溶劑。
[0067]③抑制菌絲生長實(shí)驗(yàn):用接種針挑取菌餅輕放于含藥培養(yǎng)基中央(每皿一塊菌餅，菌絲面朝下)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，并設(shè)對照。28°C ± I恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后用十字交叉法測菌落直徑，計(jì)算供試真菌菌絲生長相對抑制率，比較抑制效果。計(jì)算公式:相對抑制率(％)=(對照菌落平均直徑一處理菌落平均直徑)+ (對照菌落平均直徑一菌餅直徑)X 100%ο
[0068]根據(jù)藥劑濃度的對數(shù)值(X)和菌絲生長抑制率的幾率值(y)，用0rigin8.0軟件擬合直線毒力回歸方程，并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，比較真姬菇多糖和真姬菇凝集素對枇杷炭疽病菌的抑制作用。
[0069](4)涂膜方法及枇杷生理指標(biāo)測定
涂膜方法:每組樣品選用大小均勻的枇杷10顆，分別在不同的保鮮液中浸Imin后取出，涼干，放入搪瓷盤中，在常溫條件下貯藏，每組重復(fù)4次，并每隔2d進(jìn)行隨機(jī)取樣分析。
[0070](5)生理指標(biāo)測定
1)失重率[10]=(失重克數(shù)/原克數(shù))X100%
2)好果率=(完好果數(shù)/檢查總果數(shù))X100%
當(dāng)爛斑直徑大于IOmm時(shí)，則認(rèn)定該果實(shí)為腐爛果；
3)可溶性固形糖的測定:用WYA阿貝折光儀測定；
4)VC測定:2，6- 二氯靛酚滴定法；
5)有機(jī)酸測定:酸堿滴定法；
6)呼吸強(qiáng)度測定:用紅外二氧化碳分析儀測定。
[0071]試驗(yàn)結(jié)果與分析
(I)真姬菇去蛋白多糖抑制枇杷炭疽病活性
采用菌絲生長速率法測定了 0.3125,0.6250、1.250,2.500,5.0OOmg.mL_l 5個(gè)梯度濃度的真姬菇去蛋白多糖對枇杷炭疽病菌菌絲生長的抑制活性(表I)。經(jīng)0rigin8.0軟件擬合直線毒力回歸方程(該步驟由實(shí)驗(yàn)人員指導(dǎo)通過計(jì)算機(jī)軟件完成，下同)，可知72h后，真姬菇去蛋白多糖對枇杷炭疽病菌菌絲生長的P IC50為0.56 mg.mL_l。
[0072]
【權(quán)利要求】
1.真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
2.真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用，其特征在于:所述真姬菇凝集素是采用真姬菇為原料，結(jié)合硫酸銨鹽析和PBS磷酸鹽緩沖液透析技術(shù)提取得真姬菇凝集素粗品，利用DEAE離子交換層析技術(shù)進(jìn)行凝集素粗品純化收集沉淀，經(jīng)過脫鹽后冷凍干燥得真姬菇凝集素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，其特征在于:所述真姬菇脫蛋白多糖是采用真姬菇為原料，利用水提醇沉法進(jìn)行提取真姬菇抑菌多糖，經(jīng)醇沉后收集多糖沉淀為菌絲粗多糖，將菌絲粗多糖應(yīng)用Sevag法脫除其中的蛋白成分進(jìn)行純化，脫除蛋白后的多糖成分再經(jīng)過真空冷凍干燥得真姬菇脫蛋白多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的真姬菇凝集素或脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，其特征在于:將真姬菇凝集素或真姬菇脫蛋白多糖中的一種或兩種，配制成涂膜保鮮液，將枇杷放在上述涂膜保鮮液中浸Ilmin后取出，晾干，在常溫條件下貯藏；所述涂膜保鮮液中真姬菇凝集素的質(zhì)量百分比為:0.1%-0.2%，所述涂膜保鮮液中真姬菇脫蛋白多糖的質(zhì)量百分比為:1% -2%ο
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的真姬菇凝集素在枇杷保鮮中的應(yīng)用，其特征在于:所述真姬菇凝集素具體制備步驟為:真姬菇以質(zhì)量/體積比為1:(3~7)g/ml加入濃度為0.05mol/L，pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，在4°C下浸提24h，4°C、轉(zhuǎn)速為8000r/min下冷凍離心40min,取上清液；上清液通過硫酸銨鹽析，收集40%~75%硫酸銨飽和度沉淀部分,沉淀復(fù)溶于濃度為0.05mol/L, pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，裝入透析袋中除鹽，透析至外透析液無SO42-檢出為止，冷凍干燥后即為凝集素粗品；將凝集素粗品上DEAE-S印harose Fast Flow柱，以0.05mol/L,pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫并分管收集，檢測波長280nm，以兔血紅細(xì)胞檢測洗脫峰的凝血活性，將具有凝血活性的通過CM-Sepharose Fast Flow層析純化，收集、脫鹽后冷凍干燥即得真姬菇凝集素純品。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的真姬菇脫蛋白多糖在枇杷保鮮中的應(yīng)用，其特征在于:所述真姬菇脫蛋白多糖具體制備步驟為:采用熱水浸提法提取真姬菇多糖，稱取濕重為500 g的真姬燕，按質(zhì)量/體積比為(1~3): lg/ml加入蒸懼水,用高速組織搗碎機(jī)勻衆(zhòng)10 min,而后置于90°C水浴鍋浸提8 h,5000 rpm離心5 min,取上清液冷凍干燥濃縮至原體積的1/10，加入3倍體積的質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min,收集沉淀為菌絲粗多糖；菌絲粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白后，濃縮，加入質(zhì)量濃度為95%乙醇沉淀，8000 rpm離心10 min，沉淀物冷凍干燥即為真姬菇去蛋白多糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述真姬菇原料為真姬菇下腳料。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述PBS磷酸鹽緩沖液是將Na2HPO4? 12H20溶于蒸餾水中配制得到濃度為0.2 mo I/L的Na2HPO4，將NaH2PO4.2H20溶于蒸餾水中配置得到濃度為0.2 mo I/L NaH2PO4 ;將制備得到NaH2PO4、Na2HPO4和水按照8.5:91.5:400的體積比混合后，在溫度為121° C下滅菌30min，得到濃度為0.05mol/L、pH=7.8的PBS磷酸鹽緩沖液，儲存于冷暗處，備用。
【文檔編號】A23B7/154GK103461471SQ201310396752
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】林勇, 毛方華, 張迪, 肖冬來, 王宏雨, 曾輝 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所