專利名稱：一種同時高效制備金針菇多糖和蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食用菌有效成份提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種同時高效制備金針菇多糖和蛋白的方法。
背景技術(shù)：
舖；\鬼(FIamrnuIina又名樸 ,冬;,隸屬真菌門,擔(dān)子菌綱,傘菌目，口蘑科，金針菌屬。金針菇營養(yǎng)極為豐富，有增智菇和“一休菇”等美稱，是世界上著名的食用菌，目前已發(fā)展成為第三大食用菌。金針菇清嫩爽口，鮮美味香，營養(yǎng)豐富，是一道極為高檔的佳肴，具有較高的營養(yǎng)價值。文獻(xiàn)報道，金針菇中含較高的蛋白質(zhì)、碳水化合物和粗纖維，而脂肪含量較低，是一種不可多得的高營養(yǎng)食品。目前，在金針菇所含的生物活性成份中，國內(nèi)外對金針菇多糖的研究報到比較多，開發(fā)利用也比較深入，而對其他活性成分的研究開發(fā)比較少。對金針菇多糖的制備主要是水提，醇沉，然后利用Sevage法，三氯醋酸沉淀蛋白或蛋白酶水解的方法來去除蛋白，在制備金針菇多糖這種單一成份時，金針菇蛋白都白白的丟棄，不僅導(dǎo)致提取成本的提高，而且浪費了大量的金針菇資源。雙水相萃取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，由于雙水相萃取條件溫和，容易放大，可連續(xù)操作，因此該技術(shù)已成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸和病毒等生物產(chǎn)品的分離和純化，也有抗生素，中藥有效成份等小分子分離方面的嘗試(食品工業(yè)科技，2012，33: 191-194 ；食品科學(xué)，2009，30:110-113 ;沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2012，4: 302-305 ;中藥材，2009,11:1754-1757)。離子液體是一類室溫或相近溫度下完全由離子組成的有機液體化合物，離子液體一般由有機陽離子和無機或有機陰離子組成。離子液體與目前廣泛應(yīng)用的有機熔劑相比，具有以下獨特優(yōu)點:蒸汽壓低，不易揮發(fā)；具有較強的化學(xué)穩(wěn)定性；具有較大的結(jié)構(gòu)可調(diào)性；具有介質(zhì)和催化 雙重功能；具有較好的導(dǎo)電性、熱穩(wěn)定性和抗氧化性等。離子液體可與多種物質(zhì)如鹽、糖、表面活性劑等形成雙水相體系，其在萃取分離生物物質(zhì)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，這無疑會開拓一種新的綠色分離技術(shù)。現(xiàn)有技術(shù)對雙水相體系用于活性成分提取分離的報道比較多，但是利用離子液體/鹽雙水相的報道比較少。公開號為CNlOl 164905A的專利文獻(xiàn)利用離子液體-鹽雙水相體系萃取回收水溶液中的芳香類化合物；公開號為CN102267933A的專利文獻(xiàn)利用離子液體-雙水相體系萃取氨基酸；公開號為CN102796163A的專利文獻(xiàn)利用離子液體提取分離豆柏中的蛋白質(zhì)；以上技術(shù)都取得了較好的提取分離效果。然而，利用離子液體/鹽雙水相來同時制備金針菇多糖和蛋白的技術(shù)卻沒有文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)提取金針菇多糖時的提取率低及不能同時制備蛋白成份導(dǎo)致浪費的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種能從金針菇中同時高效、綠色、低成本地制備多糖和蛋白的方法。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
一種同時高效制備金針菇多糖和蛋白的方法，該方法包括以下步驟:
(1)原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體經(jīng)粉碎后，與蒸餾水按1:30-50的重量比混合成混合液后，備用；
(2)酶解處理:取占混合液重量0.05-0.2%的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至4-6，振蕩或攪拌下于45-55°C酶解30-90分鐘；
(3)微波輔助萃取:將步驟(2)所得酶解液進(jìn)行微波處理5-20分鐘后，離心，得上清液和沉淀物；
(4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入2-4倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，離心，冷凍高燥后得金針菇粗多糖；
(5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入離子液體/鹽雙水相體系中，在溫度30-50°C、pH 4-7的條件下震蕩30-50分鐘，震蕩速度為100_200r.min—1，然后靜置20-40分鐘分層；
(6)金針菇多糖的制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖；
(7)金針菇蛋白的制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，取有機相真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白。優(yōu)選地，上述方法的步驟(2)中微波處理的條件為50-100Hz，300-800W。優(yōu)選地,上述方法的步驟(3)、(4)的離心步驟均在6000rpm離心10分鐘。優(yōu)選地，上述方法的步驟(5)所述的離子液體/鹽雙水相體系，其中離子液體為1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體，鹽為NaH2PO4和NaCl。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述方法的步驟(5)中粗多糖溶液加入離子液體/鹽雙水相體系后，使得離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%-25%，NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%_28%，粗多糖濃度為0.2mg/ml, NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%_6%。優(yōu)選地，上述方法的步驟(7)萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。進(jìn)一步優(yōu)選地，上述方法的步驟(2)所采用的纖維素酶的活性為160000U/g。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的提取分離工藝將酶解、微波輔助萃取、離子液體、雙水相有機結(jié)合后一次性制備獲得了金針菇多糖和蛋白，具體的進(jìn)步性表現(xiàn)如下:
(1)纖維素酶的預(yù)處理能夠改變金針菇的結(jié)構(gòu)，破壞了纖維素的阻礙，同時通過水解使部分纖維素降解成可溶性的多糖，從而使多糖和蛋白的提取更為有效；
(2)微波萃取能夠在很大程度上破壞金針菇的結(jié)構(gòu)，使多糖和蛋白的提取更為有效；
(3)雙水相體系中NaCl的添加，不僅改變了離子液體在水中的溶解度和乳化性，而且改變了水相的密度，利于萃取的完成，提高了萃取效率；
(4)離子液體幾乎沒有蒸汽壓 ，同時具有不揮發(fā)、不易燃燒和爆炸等許多優(yōu)點，所以在蒸餾分離過程中不會因為揮發(fā)造成損失以及對環(huán)境造成污染和損害，并且在工藝上實現(xiàn)了離子液體的再生和回收；
(5)通過本發(fā)明的工藝可獲得產(chǎn)量高、純度高的金針菇多糖和蛋白，并且操作簡單，對于挖掘金針菇的潛在價值具有非常重要的經(jīng)濟(jì)意義。


圖1為從金針菇中同時高效制備多糖和蛋白的工藝流程圖。
具體實施例方式以下通過實施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例1-4所涉及的材料說明如下:
纖維素酶:160000U/g，湖州禮來生物科技有限公司
1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽[Bmin]BF4，上海成捷化學(xué)有限公司。離子液體/鹽雙水相體系:離子液體為1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，鹽為NaH2PO4 和 NaCl。實施例1 (從金針菇中同時高效制備多糖和蛋白的方法一)
(O原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體IOg經(jīng)粉碎后，將其與蒸餾水按1:30的重量比例混合成混合液后，備用；
(2)酶解處理:將占混合液重量0.05%的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至4，置振蕩器上在45°C下酶解30分鐘；
(3)微波輔助萃取:步驟(2)酶解液進(jìn)行微波處理(80HZ，500W)5分鐘后，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，得上清液和沉淀物；
(4)醇沉多糖，將步驟(3)的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積得五分之一后，在加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，在6000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，冷凍高燥后得金針菇粗多糖0.92g ；
(5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入適量離子液體/鹽雙水相體系中，使離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，粗多糖濃度為0.2mg/ml,NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，在溫度30°C，pH4的條件下震蕩30分鐘，震蕩速度為150r^mirT1,然后靜置30分鐘；
(6)金針菇多糖制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖0.47 g ；
(7)金針菇蛋白得制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，然后真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白0.16 g。萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。
實施例2 (從金針菇中同時高效制備多糖和蛋白的方法二)
(O原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體IOg經(jīng)粉碎后，將其與蒸餾水按1:40的重量比混合成混合液后，備用；
(2)酶解處理:將占混合液重量0.1 %的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至4.5，置振蕩器上在48°C下酶解50分鐘；
(3)微波輔助萃取:步驟(2)酶解液進(jìn)行微波處理(80HZ，800W)10分鐘后，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，得上清液和沉淀物；
(4)醇沉多糖，將步驟(3)的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積得五分之一后，在加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，在6000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，冷凍高燥后得金針菇粗多糖1.04g ；
(5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入適量離子液體/鹽雙水相體系中，使離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,粗多糖濃度為0.2mg/ml, NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，在溫度35°C，pH=5的條件下震蕩40分鐘，震蕩速度為ΙδΟρπ η—1，然后靜置30分鐘；
(6)金針菇多糖制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖0.52 g ；
(7)金針菇蛋白得制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，然后真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白0.29 g。萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。
實施例3 (從金針菇中同時高效制備多糖和蛋白的方法三)
(O原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體IOg經(jīng)粉碎后，將其與蒸餾水按1:45的重量比混合成混合液后，備用；
(2)酶解處理:將占混合液重量0.15%的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至5.5，置振蕩器上在50°C下酶解70分鐘；
(3)微波輔助萃取:步驟(2)酶解液進(jìn)行微波處理(50HZ，500W)15分鐘后，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，得上清液和沉淀物；
(4)醇沉多糖，將步驟(3)的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積得五分之一后，在加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，在6000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，冷凍高燥后得金針菇粗多糖1.11 g;
(5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入適量離子液體/鹽雙水相體系中，使離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，粗多糖濃度為0.2mg/ml, NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，在溫度42°C，pH=6的條件下震蕩45分鐘，震蕩速度為ΙδΟρπ η—1，然后靜置30分鐘；
(6)金針菇多糖制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖0.57 g ；
(7)金針菇蛋白得制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，然后真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白0.24 g。萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。
實施例4(從金針菇中同時高效制備多糖和蛋白的方法四)
Cl)原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體IOg經(jīng)粉碎后，將其與蒸餾水按1:50的重量比混合成混合液后，備用；
(2)酶解處理:將占混合液重量0.2%的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至6，置振蕩器上在55°C下酶解90分鐘；
(3)微波輔助萃取:步驟(2)酶解液進(jìn)行微波處理(100HZ，500W)20分鐘后，在6000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10分鐘，得上清液和沉淀物；
(4)醇沉多糖，將步驟(3)的上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積得五分之一后，在加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，在6000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，冷凍高燥后得金針菇粗多糖1.09g ；
(5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入適量離子液體/鹽雙水相體系中，使離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%,磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,粗多糖濃度為
0.2mg/ml, NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，在溫度50°C，pH=7的條件下震蕩50分鐘，震蕩速度為ΙδΟρπ η—1，然后靜置30分鐘；
(6)金針菇多糖制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖0.61 g；
(7)金針菇蛋白得制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，然后真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白`0.20 g。萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。
權(quán)利要求
1.一種同時高效制備金針菇多糖和蛋白的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: (1)原料預(yù)處理:干燥金針菇子實體經(jīng)粉碎后，與蒸餾水按1:30-50的重量比混合成混合液后，備用； (2)酶解處理:取占混合液重量0.05-0.2%的纖維素酶加入混合液中，調(diào)解pH值至4-6，振蕩或攪拌下于45-55°C酶解30-90分鐘； (3)微波輔助萃取:將步驟(2)所得酶解液進(jìn)行微波處理5-20分鐘后，離心，得上清液和沉淀物； (4)醇沉多糖:將步驟(3)所得上清液減壓濃縮，加入2-4倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉后，離心，冷凍高燥后得金針菇粗多糖； (5)雙水相萃取:將金針菇粗多糖溶于水，得粗多糖溶液，加入離子液體/鹽雙水相體系中，在溫度30-50°C、pH 4-7的條件下震蕩30-50分鐘，震蕩速度為100_200r.min—1，然后靜置20-40分鐘分層； (6)金針菇多糖的制備:取出富含無機鹽的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖； (7)金 針菇蛋白的制備:取出富含離子液體的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，取有機相真空旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中微波處理的條件為50-100Hz，300-800W。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)、(4)的離心步驟均在6000rpm離心10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(5)所述的離子液體/鹽雙水相體系，其中離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體，鹽為NaH2PO4和NaCl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:步驟(5)中粗多糖溶液加入離子液體/鹽雙水相體系后，使得離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%-25%，NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%_28%，粗多糖濃度為0.2mg/ml, NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%_6%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(7)萃取后的水相被回收離子液體循環(huán)使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述纖維素酶的活性為160000U/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時高效制備金針菇多糖和蛋白的方法，該方法將金針菇子實體粉碎，纖維素酶預(yù)處理，微波輔助萃取，離心后醇沉得金針菇粗多糖；將粗多糖溶于水后，加入離子液體/鹽雙水相體系，混勻，離心，分為上下兩相；取出富含多糖的下層，用截留量為6000的超濾膜除鹽，濃縮，冷凍干燥得金針菇多糖；富含蛋白的上層，加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，然后旋轉(zhuǎn)干燥去除二氯甲烷，得金針菇蛋白。本發(fā)明能同時制備金針菇多糖和蛋白，而且提高了多糖和蛋白的提取率，工藝簡單，對設(shè)備要求低，適合于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07K1/14GK103113487SQ20131005511
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者賀偉強 申請人:嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院