槐耳多糖蛋白及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及槐耳多糖蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明的槐耳多糖蛋白的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其質(zhì)量比為3.2：2.0：33.5：5.5：1.2：50.4，該多糖蛋白的重均分子量為7.0×105～5.0×106Da，優(yōu)選為2.69×106Da。本發(fā)明的多糖蛋白可以用于制備治療腫瘤的藥物。
【專利說明】槐耳多糖蛋白及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種槐耳多糖蛋白及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 槐耳為多孔菌科真菌槐栓菌（Trametes robiniophila Murr.)的子實體，是一種 重要的民間藥用真菌，在中國具有1600余年的用藥歷史。Ainsworth真菌分類系統(tǒng)將其歸 屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌科、栓菌屬。槐耳子實體中等至較大，木栓質(zhì)，無菌 柄，生于槐、刺槐等闊葉樹的樹干上，分布于河北、陜西、遼寧、湖南、廣西、福建等地，是一種 可以導(dǎo)致樹木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平無毒，有"治風(fēng)"、"破血"、"益力"的 功效，臨床上用于治療多種疾病。由于老齡中國槐日益稀少，導(dǎo)致槐耳資源非常稀少，難以 滿足臨床用藥需求，更難以滿足槐耳相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)需求。為了解決槐耳的資源問 題，啟東蓋天力藥業(yè)有限公司經(jīng)過長期的研究和實踐，攻克了槐耳菌絲體大規(guī)模發(fā)酵難題， 實現(xiàn)了菌絲體的工業(yè)化生產(chǎn)，并以槐耳菌質(zhì)(槐耳菌絲體發(fā)酵物）提取物為原料開發(fā)了槐耳 顆粒和槐杞黃顆粒等藥品，滿足了臨床用藥需求。
[0003] 近年來大量的化學(xué)成分及藥理活性研究資料證實槐耳菌質(zhì)提取物的有效成分為 槐耳多糖蛋白，其主要功效是治療或輔助治療腫瘤性疾病。然而，目前對于槐耳多糖蛋白的 組成、結(jié)構(gòu)及制備方法研究很少。在化學(xué)成分研究方面，僅粗多糖的單糖組成及比例分析有 文獻(xiàn)報道，缺乏對其均一多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)研究，如均一多糖蛋白所含的糖殘基種類、 比例、在主鏈中的排列次序、蛋白部分所占的比例、組成等，而這些信息對于闡明槐耳菌質(zhì) 真正的藥效成分、槐耳多糖蛋白的作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系等至關(guān)重要。同樣在槐耳多糖蛋白 的生物活性研究方面，多以粗多糖作為研究對象，缺乏應(yīng)用均一多糖組分獲得的體內(nèi)、體外 藥理學(xué)研究數(shù)據(jù)，導(dǎo)致無法深入了解槐耳多糖蛋白與人體免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)多 糖受體的作用過程，因而無法深入的闡明其作用原理。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種槐耳多糖蛋白及其制備方法和用途。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種槐耳多糖蛋白，該多糖蛋白的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯 糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其質(zhì)量比為3. 2 :2. 0 :33. 5 :5. 5 :1. 2 :50. 4。
[0007] 優(yōu)選地，所述多糖蛋白的重均分子量為7. OX 105?5. OX 106Da，優(yōu)選為 2. 69X 106Da。
[0008] 優(yōu)選地，該多糖蛋白的制備方法包括如下步驟：
[0009] (1)將濃度為2%?20% (質(zhì)量/體積)，優(yōu)選為8% (質(zhì)量/體積）的槐耳菌質(zhì)提取 物水溶液采用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分；
[0010] (2)將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為30%?80%(體 積)，優(yōu)選為30%?50% (體積)，更優(yōu)選為40% (體積）的糖溶液，離心，得到沉淀物；
[0011] (3)將步驟（2)得到的沉淀物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內(nèi)部分；以及
[0012] (4)使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，其中使用的洗脫 液為水、〇. IMol/L?1. OM〇1/L NaCl水溶液，優(yōu)選為0. IMol/L?0. 3Mol/L NaCl水溶液，更 優(yōu)選為0. IMol/L的NaCl水溶液。
[0013] 優(yōu)選地，所述多糖蛋白的制備方法還包括對NaCl溶液洗脫得到的產(chǎn)品進(jìn)行透析 除鹽的步驟。
[0014] 優(yōu)選地，所述多糖蛋白的制備方法還包括采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對 透析除鹽后的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化的步驟。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供一種上述多糖蛋白的制備方法，該制備方法包括如下步 驟：
[0016] (1)將濃度為2%-20% (質(zhì)量/體積)，優(yōu)選為8% (質(zhì)量/體積）的槐耳菌質(zhì)提取物 水溶液采用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分；
[0017] (2)將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為30%?80%(體 積)，優(yōu)選為30%?50% (體積)，更優(yōu)選為40% (體積）的糖溶液，離心，得到沉淀物；
[0018] (3)將步驟（2)得到的沉淀物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內(nèi)部分；以及
[0019] (4)使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，其中使用的洗脫 液為水、〇. IMol/L?1. 0Mol/L NaCl水溶液，優(yōu)選為0. IMol/L?0. 3Mol/L NaCl水溶液，更 優(yōu)選為0. IMol/L的NaCl水溶液，即得。
[0020] 優(yōu)選地，所述制備方法還包括對NaCl溶液洗脫得到的產(chǎn)品進(jìn)行透析除鹽的步驟。
[0021] 優(yōu)選地，所述制備方法還包括采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽后 的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化的步驟。
[0022] 在一個具體實施方案中，所述制備方法包括如下步驟：
[0023] ( 1)準(zhǔn)確稱取槐耳菌質(zhì)提取物槐耳清膏300g，加入適量蒸餾水將其稀釋為濃度約 為8% (質(zhì)量/體積）的稀溶液，之后采用Sevage法除去游離蛋白，重復(fù)操作5次，收集糖類 部分；
[0024] (2)向步驟（1)得到的槐耳菌質(zhì)糖類部分中緩緩加入無水乙醇使其成為醇濃度為 40% (體積)的糖溶液，4°C靜置24小時后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，沉淀，得到 沉淀物；
[0025] (3)稱取適量步驟（2)得到的沉淀物，將其溶解于150ml蒸餾水中，過濾，減壓濃縮 至體積50ml;透析收集袋內(nèi)部分，以及
[0026] (4)使用DEAE-52離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，先用 水洗脫，再采用〇. IMol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，0. IMol/L NaCl溶液洗脫部分在濃縮后進(jìn)行 透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天；以及
[0027] (5)采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對步驟（4)得到的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化，直 至高效液相色譜法檢測為純品為止。
[0028] 又一方面，本發(fā)明提供上述多糖蛋白在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0030] 本發(fā)明首次采用系統(tǒng)的水提取、醇沉淀、去游離蛋白、透析小分子、離子交換色譜 及凝膠分子排阻色譜分離的手段從槐耳菌質(zhì)中分離獲得了一個均一的多糖蛋白組分，并綜 合的應(yīng)用分子量分析、單糖組成及氨基酸組成分析、紅外光譜分析及甲基化分析等手段，對 其進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的確認(rèn)，明確了其重均分子量、單糖組成及比例、氨基酸組成及比 例，以及所含糖殘基的連接方式。這樣一個結(jié)構(gòu)特點(diǎn)明晰、分子量均一的槐耳菌質(zhì)多糖組 分，是研究槐耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型，為闡明槐耳多糖的免疫調(diào)節(jié) 及抗腫瘤有效成分和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，本發(fā)明將為槐耳菌質(zhì)深層次開發(fā)及相關(guān)制劑的 質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0032] 圖1為槐耳菌質(zhì)提取物槐耳清膏分級醇沉淀流程圖；
[0033] 圖2為槐耳菌質(zhì)提取物槐耳清膏40%乙醇沉淀部位TCP-40柱色譜純化流程圖；
[0034] 圖3為槐耳多糖蛋白TP-1分子量（Mw)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035] 圖4為槐耳多糖蛋白TP-1單糖組分分析中對照品溶液的離子色譜圖；
[0036] 圖5為槐耳多糖蛋白TP-1的UPLC-GPC圖譜；
[0037] 圖6為槐耳多糖蛋白TP-1單糖組成分析離子色譜圖；
[0038] 圖7為3H_TdR摻入法檢測小鼠脾細(xì)胞增殖，其中，TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋 白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多糖蛋白-3 ;TP-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;Τ〇-1 :槐耳 低分子量組分-1 ;T〇-2 :槐耳低分子量組分-2 ;T〇-3 :槐耳低分子量組分-3 ;T〇-4 :槐耳低 分子量組分-4 ;TFP :槐耳粗總游離蛋白部分；
[0039] 圖8為3H_TdR摻入法檢測小鼠 T、B淋巴細(xì)胞增殖，其中，圖A為⑶19+細(xì)胞；圖B 為⑶3+細(xì)胞；圖C為小鼠 T淋巴細(xì)胞；圖D為小鼠 B淋巴細(xì)胞；Dex :葡聚糖；TCP :粗多糖； TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多糖蛋白-3 ;TP-4 :槐耳多糖 蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0040] 圖9為槐耳多糖刺激后小鼠及人T、B淋巴細(xì)胞比例變化，其中，圖A為小鼠 T淋巴 細(xì)胞；圖B為小鼠 B淋巴細(xì)胞；圖C為人類T淋巴細(xì)胞；圖D為人類B淋巴細(xì)胞；Dex :葡聚 糖（Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多 糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0041] 圖10為槐耳多糖刺激后T、B淋巴細(xì)胞表面⑶69的表達(dá)，圖A為槐耳多糖刺激后T 淋巴細(xì)胞表面⑶69的表達(dá)，圖B為槐耳多糖刺激后B淋巴細(xì)胞表面⑶69的表達(dá)，其中Dex : 葡聚糖（Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐 耳多糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;LPS :脂多糖；
[0042] 圖11為槐耳多糖刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞N0釋放變化，其中Dex :葡聚糖 (Dextran) ;TCP :粗多糖；TP-1 :槐耳多糖蛋白-1 ;TP-2 :槐耳多糖蛋白-2 ;TP-3 :槐耳多 糖蛋白-3 ;ΤΡ-4 :槐耳多糖蛋白-4 ;Τ〇-1 :槐耳低分子量組分-1 ;Τ〇-2 :槐耳低分子量組 分-2 ;Τ〇-3 :槐耳低分子量組分-3 ;Τ〇-4 :槐耳低分子量組分-4 ;TFP :槐耳粗總游離蛋白部 分；LPS :脂多糖；
[0043] 圖12槐耳多糖蛋白對腫瘤血管形成內(nèi)皮細(xì)胞增值的抑制作用，其中TP-1 :槐耳多 糖蛋白-1。

【具體實施方式】
[0044] 下面通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例僅用于說明本發(fā)明，而不 以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0045] 實施例1 :槐耳多糖蛋白（TP-ι)的分離純化方法
[0046] 準(zhǔn)確稱取槐耳菌質(zhì)提取物槐耳清膏（由啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供)300g，加入 適量蒸餾水將其稀釋為濃度約為8% (質(zhì)量/體積）的稀溶液，之后采用Sevage法去游離蛋 白，重復(fù)操作5次，分別收集糖類部分（TCP)及槐耳粗總游離蛋白部分（TFP)，槐耳粗總游離 蛋白部分真空干燥備用，槐耳菌質(zhì)糖類物質(zhì)部分（TCP)在減壓濃縮去除殘存的氯仿及正丁 醇后，進(jìn)行分級醇沉淀。首先向TCP中緩緩加入無水乙醇使其成為醇體積濃度為40% (體 積）的糖溶液，4°C靜置24小時后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，沉淀編號為TCP-40,減壓干 燥以備進(jìn)一步分離純化，之后向上清液中繼續(xù)加入適量無水乙醇使其成為含醇60% (體積） 的糖溶液，4°C靜置24小時后，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，沉淀編號為TCP-60,減壓干燥 以備進(jìn)一步分離純化，在此之后繼續(xù)向上清液中加入適量無水乙醇至乙醇濃度達(dá)到80%(體 積)，4°C靜置24小時后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清，沉淀編號為TCP-80,減壓干 燥以備進(jìn)一步分離純化，具體分級醇沉淀流程圖見圖1。
[0047] 稱取適量的槐耳清膏40 % (體積）乙醇沉淀部位TCP-40,將其溶解于150ml蒸餾 水中，經(jīng)0. 45 μ m水系濾膜過濾后，減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內(nèi)部分及袋外部分， 袋外部分為槐耳低分子量組分-1 (T0-1)，袋內(nèi)部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分 別采用蒸餾水及〇. lMNaCl溶液、0. 5M NaCl洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮 至干，氯化鈉洗脫部分均在濃縮后進(jìn)行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析 兩天。然后各段分別采用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，直至高效液相色 譜法檢測為純品為止，經(jīng)過上述柱色譜分離過程，分別從TCP-40離子交換柱色譜0. IMol/L NaCl洗脫部位純化獲得了 UPLC(超高效液相色譜)驗證為均一組分的多糖蛋白TP-l(397mg) 以及從0. 5Mol/L NaCl洗脫部位獲得了均一多糖蛋白TP-2 (1212mg)，分離流程圖見圖2。
[0048] 稱取適量的槐耳清膏60% (體積）乙醇沉淀部位TCP-60,將其溶解于150ml蒸 餾水中，過濾，經(jīng)減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內(nèi)部分及袋外部分，袋外部分為槐耳低 分子量組分-2 (T0-2)，袋內(nèi)部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分別采用蒸餾水及 1. OMol/LNaCl溶液洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮至干，氯化鈉洗脫部分 均在濃縮后進(jìn)行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天。然后各段分別采 用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，直至高效液相色譜法檢測為純品為止，經(jīng) 過上述柱色譜分離過程，分別從TCP-60離子交換柱色譜1. 0M〇l/L NaCl洗脫部位純化獲得 了 UPLC (超高效液相色譜）驗證為均一組分的多糖蛋白TP-3 (12. lg)。
[0049] 稱取適量的槐耳清膏80% (體積）乙醇沉淀部位TCP-80,將其溶解于150ml蒸 餾水中，過濾，減壓濃縮至體積50ml，透析收集袋內(nèi)部分及袋外部分，袋外部分為槐耳低 分子量組分-3 (T0-3)，袋內(nèi)部分通過DEAE-52離子交換柱色譜分離，分別采用蒸餾水及 1. 0Mol/L NaCl水洗脫，每個部位收集3. 0L，水洗脫部分直接濃縮至干，氯化鈉洗脫部分均 在濃縮后進(jìn)行透析除鹽，透析過程為對流水透析三天，蒸餾水透析兩天。然后各段分別采用 S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行分離純化，直至高效液相色譜法檢測為純品為止，經(jīng)過 上述柱色譜分離過程，分別從TCP-80離子交換柱色譜1. OMol/LNaCl洗脫部位純化獲得了 UPLC (超高效液相色譜)驗證為均一組分的多糖蛋白TP-4 (10. Og)，收集槐耳清膏80% (體 積）乙醇沉淀上清液部分得槐耳低分子量組分-4 (T0-4)(圖1)。
[0050] 實施例2 :槐耳多糖蛋白（TP-ι)化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究
[0051] 本實施例研究了實施例1制備的槐耳多糖蛋白TP-ι的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0052] -、槐耳多糖蛋白（TP-1)化學(xué)結(jié)構(gòu)研究方法
[0053] 1、純度及分子量的測定
[0054] UPLC-GPC-ELSD 儀器配置及色譜條件：美國 Waters UPLC，TSK-3000GPC 色譜柱， 自動進(jìn)樣器，Millipore超純水離子交換器制備高純水（0. 45 μ m醋酸纖維素膜過濾）；流速 0· 3ml/min〇
[0055] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別稱取適量的右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入去離子水，將其配置成濃 度0. 5mg/ml的對照品溶液，之后逐一進(jìn)行UPLC檢測，結(jié)果見圖3。
[0056] 樣品溶液制備：分別稱取一定量的TP-1，加入適量去離子水，將其配制成濃度為 lmg/ml的溶液，MilliporeO. 22 μ m水系濾膜過濾，進(jìn)樣檢測。
[0057] 2、單糖組成分析
[0058] 完全酸水解：精密稱取TP-1 (10mg)放入厚壁耐壓瓶中，加入4ml的2Mol/L三氟乙 酸（TFA)，充氮?dú)?，封管后?00°C水解2小時，減壓蒸干。
[0059] 樣品的離子色譜分析
[0060] 儀器配置及色譜條件：Dionex ICS 3000型離子色譜，CarboPac PA20分析柱， 150X3mm，S/N 002823，CarboPac PA20 保護(hù)柱，50*3mm，S/N 002652,淋洗液組成及流速 l-25min,lm Mol/L Κ0Η ；25.l-32min,30m Mol/L Κ0Η ；32.l-35min,lm Mol/L Κ0Η ；0.45mL/ min,進(jìn)樣 10 μ L〇
[0061] 對照品溶液的制備：取巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖對照品適 量，用去離子水溶解成各含10. 〇mg/L的對照品溶液，搖勻，即得。
[0062] 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取對照品混合貯備液適量，分別用去離子水將其稀釋成 0· 5mg/L、lmg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0· 45 μ m微孔濾膜過濾之后依次進(jìn) 行離子色譜測定，離子色譜條件為：Dionex ICS 3000型離子色譜，CarboPac PA20分析 柱，150X3mm，S/N002823, CarboPac PA20 保護(hù)柱，50*3mm，S/N 002652,淋洗液組成及流 速 l-25min，lm Mol/L K0H;25.1-32min，30m Mol/L Κ0Η，；32.1-35min，lm Mol/L Κ0Η; 0.45mL/min，進(jìn)樣10yL。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y)、以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X)，繪 制各對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程，結(jié)果見表1和圖4。
[0063] 表1線性關(guān)系考察結(jié)果
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種槐耳多糖蛋白，該多糖蛋白的單糖組成為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木 糖及甘露糖，其質(zhì)量比為3. 2 :2· 0 :33. 5 :5. 5 :1. 2 :50· 4。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的重均分子量為 7· Ο X 105 ?5· Ο X 106Da，優(yōu)選為 2. 69 X 106Da。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多糖蛋白，其特征在于，該多糖蛋白的制備方法包括如下 步驟： (1) 將濃度為2%?20% (質(zhì)量/體積)，優(yōu)選為8% (質(zhì)量/體積）的槐耳菌質(zhì)提取物水 溶液采用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分； (2) 將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為30%?80%(體積)， 優(yōu)選為30%?50% (體積)，更優(yōu)選為40% (體積）的糖溶液，離心，得到沉淀物； (3) 將步驟（2)得到的沉淀物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內(nèi)部分；以及 (4) 使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，其中使用的洗脫液為 水、0· IMol/L?1. OM〇1/L NaCl水溶液，優(yōu)選為0· IMol/L?0· 3Mol/L NaCl水溶液，更優(yōu)選 為0. IMol/L的NaCl水溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制備方法還包括對 NaCl溶液洗脫得到的產(chǎn)品進(jìn)行透析除鹽的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制備方法還包括采 用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽后的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化的步驟。
6. -種權(quán)利要求1至5中任一項所述的多糖蛋白的制備方法，該制備方法包括如下步 驟： (1) 將濃度為2%?20% (質(zhì)量/體積)，優(yōu)選為8% (質(zhì)量/體積）的槐耳菌質(zhì)提取物水 溶液采用Sevage法去除游離蛋白，收集糖類部分； (2) 將步驟（1)得到的糖類部分加入無水乙醇中，使其形成醇濃度為30%?80%(體積)， 優(yōu)選為30%?50% (體積)，更優(yōu)選為40% (體積）的糖溶液，離心，得到沉淀物； (3) 將步驟（2)得到的沉淀物加水溶解，過濾，濃縮、透析收集袋內(nèi)部分；以及 (4) 使用離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，其中使用的洗脫液為 水、0· IMol/L?1. 0Mol/L NaCl水溶液，優(yōu)選為0· IMol/L?0· 3Mol/L NaCl水溶液，更優(yōu)選 為0. IMol/L的NaCl水溶液，即得。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括對NaCl溶液洗 脫得到的產(chǎn)品進(jìn)行透析除鹽的步驟。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括采用Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對透析除鹽后的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下 步驟： (1) 準(zhǔn)確稱取槐耳菌質(zhì)提取物槐耳清膏300g，加入適量蒸餾水將其稀釋為濃度約為8% 的稀溶液，之后采用Sevage法去除游離蛋白，重復(fù)操作5次，收集糖類部分； (2) 向步驟（1)得到的槐耳菌質(zhì)糖類部分中緩緩加入無水乙醇使其成為醇濃度為40% 的糖溶液，4°C靜置24小時后，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘，沉淀，得到沉淀物； (3) 稱取適量步驟（2)得到的沉淀物，將其溶解于150ml蒸餾水中，過濾，減壓濃縮至體 積50ml;透析收集袋內(nèi)部分，以及 (4) 使用DEAE-52離子交換柱色譜對步驟（3)收集到的袋內(nèi)部分進(jìn)行分離，采用 0. IMol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫部分在濃縮后進(jìn)行透析除鹽，透析過程為對流水透析三 天，蒸餾水透析兩天；以及 (5) 采用S印harose CL-6B瓊脂糖凝膠柱對步驟（4)得到的產(chǎn)品進(jìn)行分離純化，直至高 效液相色譜法檢測為純品為止。
10.權(quán)利要求1至6中任一項所述的多糖蛋白在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
【文檔編號】C07K14/37GK104119429SQ201310146448
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】徐無為, 陸正鑫 申請人:啟東蓋天力藥業(yè)有限公司