一種封閉式超濾管道系統(tǒng)及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種封閉式超濾管道系統(tǒng)，包括緩沖液容器、待濃縮液容器、最終收集液容器、濃縮液容器和超濾設備，容器頂蓋上均設置有孔，有管道穿過孔從容器中引出；緩沖液容器引出的管道與待濃縮液容器引出的管道分別連接三通兩個接口，三通的第三個接口通過泵和管道與另一三通連接；最終收集液容器和濃縮液容器引出的管道分別連接三通的兩個接口，其第三個接口與三通的另一個接口連接；所述三通的第三個接口與連接超濾設備的回流管路連接。本發(fā)明提出的系統(tǒng)可簡化生產步驟，使生產效率提高，其可拆卸清潔和組合后高壓的超濾封閉式組合管道，便于清潔、高壓，且保障了專管專用，可多次重復使用，降低了生產的成本，增加了疫苗無菌生產的可控性。
【專利說明】一種封閉式超濾管道系統(tǒng)及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學領域，具體涉及一種病毒載體的純化系統(tǒng)及其應用。
【背景技術】
[0002]在疫苗生產的工序中，需要對所收獲的病毒液進行純化以去除非抗原類的雜分子物質，獲得較純的抗原用來制備疫苗終產品。在病毒純化的工藝中，超濾濃縮和透析為常用的方法。在病毒的濃縮和提純工藝中，需要向病毒液中加入外源性的物質，比如沉淀工藝中引入的PEG6000，抽提工藝中引入的三氯甲烷，層析過程中引入的吐溫-80等。上述外源物質的殘留影響產品質量，為獲得純化后病毒液，在對病毒進行濃縮的同時需要去除引入的雜質分子。純化階段常常采用超濾濃縮和多次透析相結合的方法去除上一工序所引進的外源物質，如PEG6000、三氯甲烷、吐溫-80等。
[0003]在疫苗的生產工藝中，采用PEG6000沉淀后離心的方式將病毒液按工藝所需倍數(shù)進行濃縮，以等體積或多倍體積的方式加入磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L PBS溶液)稀釋，將稀釋后的病毒液再次進行濃縮，如此反復進行以達到去除病毒液中雜質分子的作用，稱此步驟為透析。經多次透析后即可獲得符合生產所要求標準的疫苗病毒液。
[0004]疫苗生產工藝中無菌的控制非常必要，直接影響終產品的質量，特別是非滅活類的疫苗，主要依靠疫苗生產過程中的無菌控制。在現(xiàn)有的疫苗生產工藝技術中，多數(shù)企業(yè)采用的病毒超濾步驟多為分步進行，即對超濾系統(tǒng)分別進行沖堿清潔后沖注射用水，再用緩沖液平衡超濾系統(tǒng)，最后濃縮和透析病毒液，且使用硅膠管道分別連接超濾系統(tǒng)的進液、回流與濾過端，在操作過程中分別將與超濾系統(tǒng)的進液、回流與濾過端連接的硅膠管直接伸入桶內，在操作環(huán)境中屬于敞口生產，采用的這種管道為非閉合式分類管道。在無菌生產過程中這類管道較分散，在物品準備的清潔過程及生產操作過程中需要多次重復的拆裝和組合，工作量大且管道易混淆，不能保證專管專用，增加交叉污染的風險?？傊@類非閉合式分類管道不僅在操作過程中步驟繁瑣、耗時耗力，而且整個過程很難保證無菌，操作過程中帶來的污染風險程度較高。

【發(fā)明內容】

[0005]介于上述現(xiàn)有技術的不足和疫苗生產的需要，本申請?zhí)岢鲆环N可拆卸清潔和組合后再滅菌使用的封閉式超濾組合管道系統(tǒng)，不僅有效地保證了疫苗生產工藝中的無菌生產，而且操作簡便，適合大規(guī)模的生產。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提出所述系統(tǒng)的應用。
[0007]實現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術方案為:
[0008]一種封閉式超濾管道系統(tǒng)，包括緩沖液容器1、待濃縮液容器2、最終收集液容器
3、濃縮液容器4和超濾設備5 ；
[0009]所述緩沖液容器1、待濃縮液容器2、最終收集液容器3和濃縮液容器4的均設置有頂蓋，頂蓋上設置有孔，有管道穿過所述孔從容器中弓I出；[0010]所述緩沖液容器I引出的管道6與待濃縮液容器2引出的管道7分別連接三通11的兩個接口，所述三通11的第三個接口通過泵16和管道與三通12的一個接口連接；所述最終收集液容器3和濃縮液容器4引出的管道10、8分別連接三通13的兩個接口，所述三通13的第三個接口與三通12的另一個接口通過管道9連接；所述三通12的第三個接口與連接超濾設備5的回流管路14連接；所述濃縮液容器4還通過泵17、進液管路15與超濾設備5連接。
[0011]其中，所述緩沖液容器I引出的管道6與待濃縮液容器2引出的管道7均通過所述孔插入容器底部，所述管道6、7與容器底部接觸的部分為不銹鋼材質或可高壓滅菌的塑料材質的直管，所述管道6、7其余部分為硅膠材質，優(yōu)選鉬金硫化硅膠。
[0012]其中，所述進液管路15和/或管道8與濃縮液容器4底部接觸部分管道為不銹鋼材質或可高壓滅菌的塑料材質的直管；其余部分為硅膠材質，優(yōu)選鉬金硫化硅膠。
[0013]其中，所述最終收集液容器3和濃縮液容器4引出的管道10、回流管路14、進液管路15均為硅膠材質，優(yōu)選為鉬金硫化硅膠。
[0014]其中，所述三通11為T三通，所述三通12、13為Y三通，所述T三通與Y三通的材質為可高壓的塑料材質，如聚丙烯PP。
[0015]其中，所述超濾設備5還連接有用于排出廢液的濾過管路16。
[0016]本發(fā)明所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)的應用，其特征在于，包括步驟:
[0017]I)濃縮:將病毒液接入待濃縮液容器2，封閉管道6、回流管道14和管道10，用泵16將病毒液泵入濃縮液容器4 ；
[0018]然后打開回流管道14，開啟泵17，啟動超濾設備5運行，超濾設備5產生的濃縮液通過回流管道14進入濃縮液容器4 ；
[0019]當待濃縮液容器2內的病毒液被完全泵入濃縮液容器4內，關閉泵16和管道7，將濃縮液容器4內病毒液濃縮至工藝要求倍數(shù)時，關閉泵17和回流管道14 ;所述工藝要求的濃縮倍數(shù)視病毒液而定，例如為2-15倍。
[0020]2)透析:所述緩沖液容器I內裝緩沖液，封閉管道7和回流管道14，通過管道6和泵16將緩沖液泵入濃縮液容器4，然后封閉管道6和關閉泵16，打開回流管道14、開啟泵17，啟動超濾設備5以去除非抗原性成分；
[0021]3)收集:封閉管道8、濾過管路16，打開管路10，啟動泵17將濃縮液容器4內的溶液經超濾設備5處理后進入最終收集液容器3。
[0022]其中，用止血鉗或彈簧夾夾住管道，實現(xiàn)對管道的封閉。
[0023]其中，所述步驟I)中的病毒液是細胞培養(yǎng)制得的病毒收獲液，或者指收獲后加入非抗原性成分，所述非抗原性成分選自PEG6000、三氯甲烷或吐溫-80中的一種或其它用在病毒濃縮、透析工藝中添加的外源物質；
[0024]所述步驟2)中的緩沖液為磷酸緩沖液。
[0025]其中，所述步驟2)重復進行2-10次。
[0026]本發(fā)明提出的超濾封閉式組合管道，取代了現(xiàn)有方法用分類管道進行疫苗的超濾生產工作，主要可實現(xiàn)以下的有益技術效果:
[0027]I)簡化生產步驟，減短了生產時間，使生產的效率提高。
[0028]2)這是一種可拆卸清潔和組合后高壓的超濾封閉式組合管道，便于清潔、高壓，且保障了專管專用，可多次重復使用，降低了生產的成本。
[0029]3)減少了用于生產疫苗的病毒液在外部環(huán)境暴露的時間及次數(shù)，增加了疫苗無菌生產的可控性。
[0030]4)避免了疫苗生產的中間產品過長時間的放置于室溫中，提高了疫苗的品質質量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為封閉式超濾管道系統(tǒng)結構圖。
[0032]圖中，I為緩沖液容器，2為待濃縮液容器，3為最終收集液容器，4為濃縮液容器，5為超濾設備，6、7、8、9、10為管道，11為T三通，12、13為Y三通，14為回流管路，15為進液管路,16、17為泵’ 18為濾過管路。
【具體實施方式】
[0033]現(xiàn)以以下最佳實施例來說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0034]實施例1:封閉式超濾管道系統(tǒng)
[0035]封閉式超濾管道系統(tǒng)，包括緩沖液容器1、待濃縮液容器2、最終收集液容器3、濃縮液容器4和超濾設備5 ；
[0036]所述緩沖液容器1、待濃縮液容器2、最終收集液容器3和濃縮液容器4的頂蓋上均設置有孔，有管道穿過所述孔從容器中引出；
[0037]緩沖液容器I引出的管道6與待濃縮液容器2引出的管道7分別連接T三通11的兩個接口，T三通11的第三個接口通過泵16 (蠕動泵)和管道與Y三通12的一個接口連接；最終收集液容器3和濃縮液容器4引出的管道10、8分別連接Y三通13的兩個接口，Y三通13的第三個接口與Y三通12的另一個接口通過管道9連接；Y三通12的第三個接口與連接超濾設備5的回流管路14連接；所述濃縮液容器4還通過泵17(蠕動泵)、進液管路15與超濾設備5連接。
[0038]管道6、管道7均通過頂蓋上的孔插入容器底部，管道6、7與容器底部接觸的部分為不銹鋼材質的直管，其余部分為鉬金硫化娃膠材質。管道8、9、10、回流管路14、進液管路15均為鉬金硫化娃膠材質。
[0039]進液管路15與濃縮液容器4桶底接觸部分管道為不銹鋼材質的直管或可高壓滅菌的塑料材質(如聚丙烯PP)的直管。超濾設備5還連接有用于排出廢液的濾過管路18。本實施例的系統(tǒng)還配有若干止血鉗。
[0040]實施例2
[0041]PEG沉淀甲肝病毒收獲液使用實施例1的封閉式超濾管道系統(tǒng)生產初純甲肝病毒I (超濾膜包型號:0S05(F05\0S050T06 ;截留分子量:50_100KD)。
[0042]I)、經細胞工廠培養(yǎng)人二倍體細胞，接種甲型肝炎病毒培養(yǎng)后，加入細胞裂解液收獲甲肝病毒液。
[0043]2)、向甲肝病毒收獲液中加入PEG6000溶液，過夜沉淀。經離心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。[0044]3)、對PEG沉淀甲肝病毒上清液進行超濾，生產初純甲肝病毒1:
[0045]3-1)、超濾系統(tǒng)經堿清潔、注水平衡及緩沖液平衡后，連接組合管道。
[0046]3-2)、濃縮:將收獲的PEG沉淀病毒液，接入管道7處的待濃縮液容器2，同時用止血鉗將圖1中位點①、④、⑤管道處夾死，使管道6、管道14和管道10封閉；用蠕動泵16將PEG沉淀甲肝病毒液泵入連接管道8處的濃縮容器4內。打開超濾設備5的回流管路14，即打開圖1中位點④處止血鉗并開啟蠕動泵17，使整個超濾系統(tǒng)運轉，實現(xiàn)邊加待濃縮病毒液邊濃縮的操作。待待濃縮液容器2內的PEG沉淀甲肝病毒液被完全濃縮在濃縮容器4內，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死圖1中位點②處的管道7。將濃縮容器4內病毒液濃縮至3-6倍時，關閉蠕動泵17，用止血鉗夾死超濾系統(tǒng)回流管路14，即附圖中位點④。
[0047]3-3)、透析:打開圖1中位點①處的管道6的止血鉗，開啟蠕動泵16，向管道8處的濃縮容器4內等體積加入裝在緩沖液容器I里的0.0lmol/LPBS (pH7.2，)緩沖液，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死圖1中位點①處的管道6，打開超濾系統(tǒng)回流管路14，即圖1中位點
④處止血鉗,開啟螺動泵17進行透析去除PEG6000等非抗原性成分。等體積加入0.0lmol/LPBS (pH7.2)緩沖液進行透析的反復操作3-6次，完成透析，關閉蠕動泵17。
[0048]3-4)、收集:用止血鉗夾死圖1中位點⑥處管道8，關閉超濾系統(tǒng)的濾過端，即關閉濾過管路18上的閥門，打開附圖中位點⑤處管道10上的止血鉗，開啟蠕動泵17將管道8處的濃縮容器4內的透析后病毒液經超濾系統(tǒng)后打入管道10處的最終收集液容器，此時收獲的病毒液為超濾后病毒液。
[0049]實施例3
[0050]氯仿抽提甲肝病毒液使用實施例1的封閉式超濾管道系統(tǒng)生產初純甲肝病毒II(超濾膜包型號:3051446801E-SG\3051446801E-SW ;截留分子量:50_100KD)。
[0051]I)、經細胞工廠培養(yǎng)人二倍體細胞，接種甲型肝炎病毒毒種培養(yǎng)后，加入細胞裂解液收獲甲肝病毒液。
[0052]2)、向甲肝病毒收獲液中加入PEG6000溶液，過夜沉淀。經離心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。
[0053]3)、對PEG沉淀甲肝病毒上清液進行超濾，濃縮3-6倍，透析3_6次，生產初純甲肝
病毒I。
[0054]4)、氯仿抽提生產初純甲肝病毒1:加入一定量氯仿，抽提一段時間后離心，收集氯仿抽提甲肝病毒液。
[0055]5)、對氯仿抽提甲肝病毒液進行超濾，濃縮8-12倍，透析3-6次，生產初純甲肝病毒II:
[0056]5-1)、超濾系統(tǒng)經堿清潔、注水平衡及緩沖液平衡后，連接組合管道。
[0057]5-2)、氯仿抽提甲肝病毒液濃縮:將收獲的氯仿抽提甲肝病毒液，接入管道7處的待濃縮液容器2，同時將圖1中位點①、④、⑤管道處用止血鉗夾死，用蠕動泵16將氯仿抽提甲肝病毒液泵入管道8處的濃縮容器4內。打開超濾系統(tǒng)的回流管路14，即附圖中位點④處止血鉗并開啟蠕動泵17，使整個超濾系統(tǒng)運轉，實現(xiàn)邊加待濃縮病毒液邊濃縮。待待濃縮液容器2內的氯仿抽提甲肝病毒液被完全濃縮在管道8處的濃縮容器4內，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死附圖中位點②處管道7。將濃縮容器4內病毒液濃縮至工藝要求8-12倍時，關閉蠕動泵17，用止血鉗夾死超濾系統(tǒng)回流管路14，即附圖中位點④。[0058]5-3)、透析:打開圖中位點①處的管道6的止血鉗，開啟蠕動泵16，向管道8處的濃縮容器4內等體積加入0.0lmol/LPBS (pH7.2)緩沖液，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死附圖中位點①處的管道6，打開超濾系統(tǒng)回流管路14，即附圖中位點④處止血鉗，開啟蠕動泵17進行透析去除氯仿等非抗原性成分。等體積加入0.0lmol/LPBS (pH7.2)緩沖液進行透析需反復操作3-6次，即完成透析，關閉蠕動泵17。
[0059]5-4)、收集:用止血鉗夾死附圖中位點⑥處管道8,關閉超濾系統(tǒng)的濾過管路18的閥門，打開圖中位點⑤處管道10上的止血鉗，開啟蠕動泵17將管道8處的濃縮容器4內的透析后病毒液經超濾系統(tǒng)后打入管道10處的最終收集液容器3,此時收獲的病毒液為初純甲肝病毒II。
[0060]實施例4
[0061]精純甲肝病毒I使用實施例1的封閉式超濾管道系統(tǒng)生產精純甲肝病毒II (超濾膜包型號:0S050C10/0S050T12 ;截留分子量:50_100KD)
[0062]I)、經細胞工廠培養(yǎng)人二倍體細胞，接種TZ84甲型肝炎病毒毒種培養(yǎng)后，加入細胞裂解液收獲甲肝病毒液。
[0063]2)、向甲肝病毒收獲液中加入PEG6000溶液，過夜沉淀。經離心后，可收集PEG沉淀甲肝病毒上清液。
[0064]3)、對PEG沉淀甲肝病毒上清液進行超濾，濃縮3-6倍，透析3_6次，生產初純甲肝
病毒I。
[0065]4)、氯仿抽提生產初純甲肝病毒1:加入一定量氯仿，抽提一段時間后離心，收集氯仿抽提甲肝病毒液。
[0066]5)、對氯仿抽提甲肝病毒液進行超濾，濃縮8-12倍，透析3-6次，生產初純甲肝病毒II。
[0067]6)、層析凝膠過濾:初純甲肝病毒II經上樣用緩沖液為0.01mol/LT80(pH7.2)洗
脫，生產精純甲肝病毒I。
[0068]7)、對精純甲肝病毒I進行超濾，濃縮3-6倍，透析3-6次，生產精純甲肝病毒II:
[0069]7-1)、超濾系統(tǒng)經堿清潔、注水平衡及緩沖液平衡后，連接組合管道。
[0070]7-2)、精純甲肝病毒I濃縮:將收獲的精純甲肝病毒I，接入管道7處的待濃縮液容器2，同時將附圖中位點①、④、⑤管道處用止血鉗夾死，用蠕動泵16將精純甲肝病毒I泵入管道8處的濃縮容器4內。打開超濾設備5的回流管路14即圖中位點④處的止血鉗并開啟蠕動泵17，使整個超濾系統(tǒng)運轉，實現(xiàn)邊加待濃縮病毒液邊濃縮。待管道7處容器內的精純甲肝病毒I被完全濃縮在管道8處的濃縮容器4內，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死附圖中位點②處管道7。將濃縮容器4內病毒液濃縮至工藝要求3-6倍時，關閉蠕動泵17，用止血鉗夾死超濾系統(tǒng)回流管路14，即圖中位點④。
[0071]7-3)、透析:打開圖中位點①處的管道6的止血鉗，開啟蠕動泵1，向管道8處的濃縮容器4內等體積加入0.0lmol/LPBS (pH7.2)緩沖液，關閉蠕動泵16，用止血鉗夾死附圖中位點①處的管道6，打開超濾設備5的回流管路14，即圖中位點④處止血鉗，開啟蠕動泵17進行透析去除吐溫-80等非抗原性成分。等體積加入0.0lmol/LPBS (pH7.2)緩沖液進行透析需反復操作3-6次，即完成透析，關閉蠕動泵2。
[0072]7-4)、收集:用止血鉗夾死附圖中位點⑥處管道8，關閉超濾系統(tǒng)的濾過管路18，打開圖中位點⑤處管道10上的止血鉗，開啟蠕動泵17將管道8處的濃縮容器4內的透析后病毒液經超濾系統(tǒng)后打入管道10處的最終收集液容器3,此時收獲的病毒液為精純甲肝
病毒II ο
[0073]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和替換，這些改進和替換也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，包括緩沖液容器(I)、待濃縮液容器(2)、最終收集液容器(3 )、濃縮液容器(4 )、超濾設備(5 )和若干個三通； 所述緩沖液容器(I)、待濃縮液容器(2)、最終收集液容器(3)和濃縮液容器(4)均設置有頂蓋，頂蓋上設置有孔，有管道穿過所述孔從容器中引出； 所述緩沖液容器(I)引出的管道(6)與待濃縮液容器(2)引出的管道(7)分別連接三通(11)的兩個接口，所述三通(11)的第三個接口通過泵(16)和管道與三通(12)的一個接口連接；所述最終收集液容器(3)和濃縮液容器(4)引出的管道(10 ;8)分別連接三通(13)的兩個接口，所述三通(13)的第三個接口與三通(12)的另一個接口通過管道(9)連接；所述三通(12)的第三個接口與連接超濾設備(5 )的回流管路(14 )連接；所述濃縮液容器(4 )還通過泵(17 )、進液管路(15 )與超濾設備(5 )連接。
2.根據(jù)權利要求1所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，所述緩沖液容器(I)引出的管道(6)與待濃縮液容器(2)引出的管道(7)均通過所述孔插入容器底部，所述管道(6 ；7)與容器底部接觸的部分為不銹鋼材質或可高壓滅菌的塑料材質的直管，所述管道(6 ；7)其余部分為硅膠材質。
3.根據(jù)權利要求1所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，所述進液管路(15)和/或管道(8)與濃縮液容器(4)底部接觸部分管道為不銹鋼材質或可高壓滅菌的塑料材質的直管；其余部分為硅膠材質。
4.根據(jù)權利要求1所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，所述最終收集液容器(3)和濃縮液容器(4)引出的管道(10)、所述回流管路(14)、進液管路(15)均為硅膠材質。
5.根據(jù)權利要求1-4任一所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，所述三通(11)為T三通，所述三通(12 ；13)為 Y三通。
6.根據(jù)權利要求1-4任一所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)，其特征在于，所述超濾設備(5)還連接有用于排出廢液的濾過管路(16)。
7.權利要求1-6任一所述的封閉式超濾管道系統(tǒng)的應用，其特征在于，包括步驟: 1)濃縮:將病毒液接入待濃縮液容器(2)，封閉管道(6)、回流管道(14)和管道(10)，用泵(16)將病毒液泵入濃縮液容器(4)； 然后打開回流管道(14)，開啟泵(17)，啟動超濾設備(5)運行，超濾設備(5)產生的濃縮液通過回流管道(14)進入濃縮液容器(4)； 當待濃縮液容器(2)內的病毒液被完全泵入濃縮液容器(4)內，關閉泵(16)和管道(7)，將濃縮液容器(4)內病毒液濃縮至工藝要求倍數(shù)時，關閉泵(17)和回流管道(14); 2)透析:所述緩沖液容器(I)內裝緩沖液，封閉管道(7)和回流管道(14)，通過管道(6)和泵(16)將緩沖液泵入濃縮液容器(4)，然后封閉管道(6)和關閉泵(16)，打開回流管道(14)、開啟泵(17)，啟動超濾設備(5)； 3)收集:封閉管道(8)、濾過管路(16)，打開管路(10)，啟動泵(17)將濃縮液容器(4)內的溶液經超濾設備(5 )處理后進入最終收集液容器(3 )。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，用止血鉗或彈簧夾夾住管道，實現(xiàn)對管道的封閉。
9.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述步驟I)中的病毒液是細胞培養(yǎng)制得的病毒收獲液，或收獲后加入非抗原性成分進行濃縮后的病毒液；所述步驟2)中的緩沖液為磷酸緩沖液。
10.根據(jù)權利要求7-9任一所 述的應用，其特征在于，所述步驟2)重復進行2-10次。
【文檔編號】C12M1/12GK103480276SQ201310404464
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權日:2013年9月6日
【發(fā)明者】張穎, 張健, 董興華, 黃金鳳, 李靜, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司