一種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述的培養(yǎng)基包含以下組分：小分子抑制劑CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12。本發(fā)明使用兩個(gè)小分子抑制劑CHIR99021、XAV939和成分明確的B27/N2添加物取代了傳統(tǒng)胚胎肝細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞，提供了一種沒有動(dòng)物源物質(zhì)、成份確定的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該培養(yǎng)基不僅可以維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新，并且能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和全能性，且由于其成分清晰明確，所含蛋白和其他成分皆來自人源重組蛋白或化學(xué)合成，不會(huì)造成胚胎干細(xì)胞污染，故而不會(huì)激起相應(yīng)免疫反應(yīng)，引發(fā)免疫排斥。
【專利說明】ー種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，具體地說，是ー種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ES Cells)是由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercell mass, I CM)或原始生埴細(xì)胞(Primordial germ cells,PGCs)經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選出的ー種全能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的形態(tài)特征與早期胚胎細(xì)胞非常相似，具有穩(wěn)定的自我更新能力，長(zhǎng)時(shí)間體外繼代培養(yǎng)后仍能保持正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；同時(shí)胚胎干細(xì)胞也有非常強(qiáng)的分化能力，在特定的條件培養(yǎng)下，它可以増殖分化為全身200多種細(xì)胞類型。因此胚胎干細(xì)胞可以提供ー種理想的生物學(xué)平臺(tái)，用于科學(xué)研究與臨床應(yīng)用，如藥物篩選、細(xì)胞發(fā)育與分化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究、組織工程種子細(xì)胞及基因治療載體的建立、細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)等。
[0003]要想充分運(yùn)用干細(xì)胞，首先要建立和維持好干細(xì)胞系。ES細(xì)胞的培養(yǎng)關(guān)鍵是既要維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)和潛能性，又要使其無限増殖。傳統(tǒng)建立和維持人胚胎干細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)方法是:ESC生長(zhǎng)在有絲分裂失活的飼養(yǎng)層細(xì)胞(FEEDER)上，基本培養(yǎng)基多為DMEM并添加胎牛血清(FCS)及白血病抑制因子(LIF)等。但是，這種培養(yǎng)系統(tǒng)中含有大量的動(dòng)物源成份，如血清及飼養(yǎng)層細(xì)胞等。大量動(dòng)物源成份的長(zhǎng)期使用不僅增加了胚胎干細(xì)胞感染外源性病毒、病原體的危險(xiǎn)性，還可能造成胚胎干細(xì)胞的污染。移植此種來源的胚胎干細(xì)胞，潛在的外源性病原體將感染患者，那些被污染的胚胎干細(xì)胞也有可能在患者體內(nèi)誘發(fā)激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，發(fā)生免疫排斥，這些潛在風(fēng)險(xiǎn)必將極大限制胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，飼養(yǎng)層細(xì)胞或血清產(chǎn)品培養(yǎng)的人類胚胎干細(xì)胞表達(dá)Neu5Gc，ー種非人類的唾液酸，這種被污染的人類胚胎干細(xì)胞將有很大的可能在患者體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)。同吋，飼養(yǎng)層細(xì)胞及血清的使用還對(duì)ESC生長(zhǎng)、増殖及分化等分子機(jī)理研究造成限制，也將給藥物篩選帶來干擾。另外，傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)中各種復(fù)雜未知的營(yíng)養(yǎng)成份，在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，也有可能會(huì)選擇或改變胚胎干細(xì)胞的某些表型。因此，為了更好的利用胚胎干細(xì)胞的這ー理想的生物學(xué)平臺(tái)，必須優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)，建立ー個(gè)沒有動(dòng)物源物質(zhì)、成份確定的人胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。并且該培養(yǎng)基既能維持胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和潛能性，又能使其無限増殖。
[0004]CHIR99021和XAV939均為小分子抑制劑，它們的結(jié)構(gòu)分別如下:
【權(quán)利要求】
1.ー種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，它包含以下組分:小分子抑制劑CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12，所述的添加物B27/N2的組分及各組分重量比為:添加物N2 組分重室比
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的小分子抑制劑 CHIR99021 和 XAV939 的摩爾比為 0.8-0.95:0.95-1.08。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12的組分及各組分重量比為:
4.權(quán)利要求1-3任一所述的胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK103555660SQ201310404474
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】呂萬革, 郭亞楠, 陳旭, 陳剛 申請(qǐng)人:依科賽生物科技（太倉(cāng)）有限公司