一種布魯氏桿菌新型疫苗及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種布魯氏桿菌新型疫苗及其制備方法。該方法包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養(yǎng)；其中，在50%葡萄糖補料中，添加0.01ug/L-100ug/L的白細(xì)胞介素2，和（或）0.01ug/L-100ug/L的維生素B1，和（或）0.01%-10%的微量元素。本發(fā)明方法使培養(yǎng)菌數(shù)得到大幅度提高，培養(yǎng)液中菌數(shù)可達1500-2000億/ml，在應(yīng)用時無需對該菌液進行濃縮處理，具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
【專利說明】一種布魯氏桿菌新型疫苗及其生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種布魯氏桿菌新型疫苗及其生產(chǎn)方法，屬于基因工程生物制藥領(lǐng)域。。

【背景技術(shù)】
[0002]布魯氏菌病(Brucellosis)也稱布氏桿菌,是一種由布魯氏菌(Brucella)弓丨起的世界范圍流行的人畜共患病，嚴(yán)重威脅人類和多種動物的生命健康，造成巨大的經(jīng)濟損失。臨床特點是緩慢起病，長期發(fā)熱、多汗、虛弱、全身痛和關(guān)節(jié)痛，急性期癥狀多在3 - 6月內(nèi)消退。布氏桿菌共分為牛、羊、豬、沙林鼠、綿羊和犬布氏桿菌六種。在中國發(fā)現(xiàn)的主要為前二種。
[0003]布氏桿菌為細(xì)小的短桿狀或球桿狀，不產(chǎn)生芽胞，革蘭氏染色陰性的桿菌。布氏桿菌對熱敏感，70°C 10分鐘即可死亡；光直射I小時死亡；在腐敗病料中迅速失去活力；一般常用消毒藥都能很快將其殺死。潛伏期短者兩周，長者可達半年。母牛流產(chǎn)是本病的主要癥狀，流產(chǎn)多發(fā)生于懷孕5-7個月，產(chǎn)出死胎或軟弱胎兒。母牛流產(chǎn)后常伴有胎衣不下或子宮內(nèi)膜炎，陰道內(nèi)繼續(xù)排出紅褐色惡臭液體，可持續(xù)2-3周，患病公牛常發(fā)生睪丸炎或附睪炎。人也可感染該病，表現(xiàn)為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝、脾腫大等癥狀。該病嚴(yán)重?fù)p害人和動物的健康，OIE將其列為B類動物疫病，中國將其列為二類動物疫病。
[0004]布氏桿菌病對畜牧業(yè)和人類健康均構(gòu)成嚴(yán)重威脅，疫苗免疫是預(yù)防和控制布氏桿菌病的主要措施。由于布氏桿菌胞內(nèi)寄生的特點，只有利福平等少數(shù)的幾種抗生素對其治療有效，但這些抗生素的副作用很大，不能長期服用，因此一旦發(fā)病并轉(zhuǎn)為慢性則無法根治，并能反復(fù)發(fā)作。因此，接種疫苗是預(yù)防布氏桿菌病的最有效的手段。
[0005]對布魯氏菌疫苗的研究已經(jīng)很多年。其研發(fā)策略經(jīng)歷了逐漸改進和完善的過程，根據(jù)不同時期研究策略側(cè)重點不同，可以將其大致分為三個階段。
[0006]第一階段:傳統(tǒng)疫苗(活苗，死苗):在布魯氏菌防治方面發(fā)揮了重要的作用。其中牛用S19，豬用S2，羊用M5，仍然是防治布魯氏菌病的重要疫苗。在傳統(tǒng)疫苗中，活苗的免疫效果雖然很好，但是對接種的動物造成一定的影響，對人也會引起感染，且易發(fā)生返祖現(xiàn)象。死苗雖然不會出現(xiàn)上述現(xiàn)象，但其免疫效果不好，用量大，遺傳穩(wěn)定性差。
[0007]第二階段:20世紀(jì)70年代以來，迅速發(fā)展的重組DNA技術(shù)為疫苗的研究提供了新的手段。布魯氏菌基因工程疫苗也開始發(fā)展。核酸疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗等成為科學(xué)家們的研究熱點。基因工程疫苗克服了傳統(tǒng)疫苗的易返祖，影響接種動物等不足，且其安全問題比較容易控制和處理，因此，基因工程疫苗將在防治布魯氏病中做出重大的貢獻。
[0008]第三階段:2000年6月26日，人類基因組測序完成標(biāo)志著人類進入了后基因組時代。疫苗的研究也開始改變過去從表型分析人手的思維方式，而是從全基因水平來篩選具有保護性免疫反應(yīng)的候選抗原。這種以基因組為基礎(chǔ)的疫苗發(fā)展策略，稱為反疫苗學(xué)。2002年以來，羊種、牛種、豬種布魯氏菌基因組測序相繼完成，為反疫苗學(xué)研發(fā)打下了基礎(chǔ)。布魯氏菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究將成為當(dāng)今疫苗研究的一個熱點。
[0009]現(xiàn)有的畜用減毒活疫苗有S19、S2、M5和RB51等，死疫苗有牛種布魯氏菌45 / 20，羊種布魯氏菌H38等，人用活疫苗主要有19-B和104M等。但無論是何種疫苗，動物接種疫苗后，由于人工免疫和自然感染動物所表現(xiàn)的臨床癥狀相似，很難鑒別是人工免疫還是自然感染，給動物的檢疫、運輸、宰殺帶來了困難。
[0010]現(xiàn)有的布氏桿菌活疫苗的生產(chǎn)規(guī)程方法如下:
一級菌種制備:凍干菌種開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白際瓊脂平板或其他適宜培養(yǎng)基上，在36?37°C培養(yǎng)2?3日。選取合格菌落10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36?37°C培養(yǎng)48?72小時，作為一級種子。在2、°C保存，使用期應(yīng)不超過I個月。
[0011]二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白際瓊脂扁平或其他適宜培養(yǎng)基，置36?37°C培養(yǎng)48?72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬?2萬ml的適宜液體培養(yǎng)基，置36?37°C培養(yǎng)48?72小時，進行純粹檢驗后置2?8°C保存，使用期應(yīng)不超過30天。
[0012]菌液培養(yǎng):按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的1%?2%接種二級菌種，在36?37°C逐漸增大通氣量，培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)過程中可根據(jù)需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總量的19Γ2 %。
[0013]按現(xiàn)有的規(guī)程進行布氏桿菌活疫苗(A19株)生產(chǎn)所培養(yǎng)得到菌液的活菌數(shù)為80(Γ1000億/ml，需要對該菌液進行濃縮處理，存在產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題，有待改進。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的布氏桿菌活疫苗的生產(chǎn)方法中所存在的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題，提供一種新的布氏桿菌活疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法所培養(yǎng)得到菌液的菌數(shù)可達1500-2000億/ml，具有存在產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
[0015]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養(yǎng)；其中在菌液培養(yǎng)補料階段，在50%葡萄糖中添加0.0lug/L^lOO ug/L的白細(xì)胞介素2 (IL2)，能夠有效的提高培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)量。
[0016]本發(fā)明進一步發(fā)現(xiàn)，其中在菌液培養(yǎng)階段，在50%葡萄糖中添加0.0lug/flOOug/L的維生素BI，能夠有效的提高培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)量。
[0017]本發(fā)明進一步發(fā)現(xiàn)，其中在菌液培養(yǎng)階段，在50%葡萄糖中添加0.019Γ10%的微量元素，能夠有效的提高培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)量。
[0018]每1000ml微量元素含硫酸鋅(ZnSO4) 2g、硫酸錳(MnSO4) 10g、氯化銅(CuCl2) lg、硫酸鈷(CoSO4.7H20)2g、硼酸(H3BO4) 0.5g、三氯化鐵(FeCl3.6H20) 27g、三氯化鋁(AlCl3
?6H20) 10g、鹽酸50ml，加去離子水至1000ml。
[0019]總之，本發(fā)明方法在菌液培養(yǎng)階段，尤其是在補料階段，添加適量的白細(xì)胞介素2，和(或)適量維生素BI，和(或)適量微量元素，能使培養(yǎng)菌數(shù)得到大幅度提高，培養(yǎng)液中菌數(shù)可達1500-2000億/ml，在應(yīng)用時無需對該菌液進行濃縮處理，具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。

【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0021]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0022]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023]實施例1
一級菌種制備:布魯氏桿菌新型疫苗凍干菌，開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個以上,移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時，作為一級種子，在2?8°C保存；
二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
每100ml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為:牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，氯化鈉2.5g，PH6.4-6.7, 1161:滅菌30?40分鐘。
[0024]菌液培養(yǎng):按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0.01%的消泡劑，滅菌后按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的2%接種二級菌種，通入空氣并逐漸增大空氣的通入量。培養(yǎng)過程中均勻加入含lug/L重組人白細(xì)胞介素2的50%葡萄糖補料，每次加入量為培養(yǎng)基總量的2%。直至36h培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1500億/ml。
[0025]實施例2
一級菌種制備:布魯氏桿菌新型疫苗凍干菌，開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個以上,移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時，作為一級種子，在2?8°C保存；
二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
每100ml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為:牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，氯化鈉2.5g，PH6.4-6.7, 1161:滅菌30?40分鐘。
[0026]菌液培養(yǎng):按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0.01%的消泡劑,滅菌后按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的2%接種二級菌種，通入空氣并逐漸增大空氣的通入量。培養(yǎng)過程中均勻加入含0.5ug/L維生素BI的50%葡萄糖補料，每次加入量為培養(yǎng)基總量的2%。直至36h培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1700億/ml。
[0027]實施例3
一級菌種制備:布魯氏桿菌新型疫苗凍干菌，開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個以上,移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時，作為一級種子，在2?8°C保存；
二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
每100ml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為:牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，氯化鈉2.5g，PH6.4-6.7, 1161:滅菌30?40分鐘。
[0028]菌液培養(yǎng):按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0.01%的消泡劑,滅菌后按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的2%接種二級菌種，通入空氣并逐漸增大空氣的通入量。培養(yǎng)過程中均勻加入含0.1%微量元素的50%葡萄糖補料，每次加入量為培養(yǎng)基總量的2%。直至36h培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)液中菌數(shù)為1700億/ml。
[0029]每100ml微量元素含硫酸鋅(ZnSO4) 2g、硫酸錳(MnSO4) 10g、氯化銅(CuCl2) lg、硫酸鈷(CoSO4.7H20)2g、硼酸(H3BO4) 0.5g、三氯化鐵(FeCl3.6H20) 27g、三氯化鋁(AlCl3
?6H20)10g、鹽酸50ml，加去離子水至1000ml，按200ml/瓶分裝后，121°C高壓滅菌20min，備用。
[0030]實施例4
一級菌種制備:布魯氏桿菌新型疫苗凍干菌，開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個以上,移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時，作為一級種子，在2?8°C保存；
二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
每100ml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為:牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，氯化鈉2.5g，PH6.4-6.7, 1161:滅菌30?40分鐘。
[0031]菌液培養(yǎng):按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0.01%的消泡劑,滅菌后按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的2%接種二級菌種，通入空氣并逐漸增大空氣的通入量。培養(yǎng)過程中均勻加入含2ug/L重組人白細(xì)胞介素2、0.5ug/L維生素BI和0.1%微量元素的50%葡萄糖補料，每次加入量為培養(yǎng)基總量的2%。直至36h培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)液中菌數(shù)為2000億/ml。
[0032]每100ml微量元素含硫酸鋅(ZnSO4) 2g、硫酸錳(MnSO4) 10g、氯化銅(CuCl2) lg、硫酸鈷(CoSO4.7H20)2g、硼酸(H3BO4) 0.5g、三氯化鐵(FeCl3.6H20) 27g、三氯化鋁(AlCl3
?6H20)10g、鹽酸50ml，加去離子水至1000ml，按200ml/瓶分裝后，121°C高壓滅菌20min，備用。
[0033]對比實施例5 (標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作對照)
一級菌種制備:布魯氏桿菌新型疫苗凍干菌，開封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板或其它適宜培養(yǎng)基上，在37°C培養(yǎng)3日。選取合格菌落10個以上,移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)72小時，作為一級種子，在2?8°C保存；
二級菌種制備:取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁平或其它適宜培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁平加蛋白胨水適量，將菌苔洗下，接種于I萬ml的馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)72小時，進行純粹檢驗后得到二級菌種，置2-8°C保存；
每100ml馬丁肉湯培養(yǎng)基的成分為:牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，氯化鈉2.5g，PH6.4-6.7, 1161:滅菌30?40分鐘。
[0034]菌液培養(yǎng):按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的質(zhì)量加入0.01%的消泡劑,滅菌后按馬丁肉湯液體培養(yǎng)基的2%接種二級菌種，通入空氣并逐漸增大空氣的通入量。培養(yǎng)過程中均勻加入50%葡萄糖補料，每次加入量為培養(yǎng)基總量的2%。直至36h培養(yǎng)結(jié)束。經(jīng)檢驗，培養(yǎng)液中菌數(shù)為800億/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種布魯氏桿菌疫苗的制備方法，包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養(yǎng)；其特征在于:在50%葡萄糖補料中，添加包括選自0.01ug/L?100 ug /L的白細(xì)胞介素2、0.01ug/L?100 ug/L的維生素BI或0.01%?10%的微量元素中的一種或多種。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述白細(xì)胞介素2選自人白細(xì)胞介素2，牛白細(xì)胞介素2、羊白細(xì)胞介素2、豬白細(xì)胞介素2、犬白細(xì)胞介素2或雞白細(xì)胞介素2。
3.權(quán)利要求1所述的制備方法，每100ml所述微量元素含硫酸鋅(ZnSO4)2g、硫酸錳(MnS04)10g、氯化銅(CuCl2)lg、硫酸鈷(CoSO4.7H20)2g、硼酸(H3BO4)0.5g、三氯化鐵(FeCl3? 6H20) 27g、三氯化鋁(AlCl3.6H20) 10g、鹽酸 50ml，加去離子水至 1000ml。
4.由權(quán)利要求1-3任何一項制備方法所制備得到的布魯氏桿菌活疫苗。
5.權(quán)利要求4所述的布魯氏桿菌活疫苗在制備預(yù)防布魯氏桿菌病試劑中的用途。
6.權(quán)利要求4所述的布魯氏桿菌活疫苗在制備治療布魯氏桿菌病藥物中的用途。
【文檔編號】C12R1/01GK104436181SQ201310420555
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】陳黃實, 李金嶺, 何萍, 陳嫚 申請人:北京中科拜克生物技術(shù)有限公司